Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Miejscowa indukcja guza poprzez chirurgiczne zakażenie adeno-cre
- Przygotowanie zwierząt do zabiegu chirurgicznego
nuta: Praktycznie każda mutacja warunkowa ("floxed") może być wywołana za pomocą opisanej tutaj metody. Zaleca się stosowanie mutacji w genach związanych z rakiem jelita grubego, takich jak Apc, Kras lub Tp53. Skuteczność rekombinacji Cre zależy od wielkości konstruktu, który ma być wycięty. Duże sekwencje floxowane są wycinane mniej wydajnie. Rekombinacja wszystkich alleli powinna zostać potwierdzona w nowotworach metodą PCR.
- Do rozwoju nowotworów jelita grubego należy użyć krzyżówki następujących alleli warunkowych dla podstawowego modelu CRC (numer bazy danych MGI w nawiasach):
Apctm2Rak (MGI: 3688435)
Krastm4Tyj (MGI: 2429948)
Tp53tm2Tyj (MGI: 3039263)
- Jeśli wymagany jest allel reporterowy fluorescencji (np. do wykrywania mikroprzerzutów), należy użyć następującego allelu:
Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze (MGI: 3809522)
nuta: Wszystkie powyższe szczepy są dostępne za pośrednictwem NCI Mouse Repository lub Jackson Laboratory. Nie jest wymagany post, ponieważ cały pozostały kał można wypłukać przed infekcją adenowirusową. Post przedoperacyjny prowadzi do wyższej śmiertelności okołooperacyjnej i stanowi ogromny stres dla małych gryzoni.
- Stosować sewofluran w stężeniu 3 - 3,5% obj. do znieczulenia ogólnego. Utrata odruchu szczypania palca u nogi wskazuje na wystarczające znieczulenie.
- Przed pierwszym nacięciem wstrzyknąć podskórnie 0,05 mg/kg buprenorfiny.
- Zakryj oczy znieczulonej myszy maścią okulistyczną, aby uniknąć wysuszenia rogówki.
- Umieść mysz w pozycji leżącej na małym stole. Użyj nieurazowych taśm samoprzylepnych, aby unieruchomić mysz.
- Ogol brzuch golarką elektryczną (alternatywnie można użyć kremu do depilacji) i zdezynfekuj wacikami nasączonymi alkoholem lub jodem. Stosować czas kontaktu zalecany przez producenta.
- Przykryj pole operacyjne sterylnymi serwetami.
nuta: Stosowanie antybiotyków okołooperacyjnych jest opcjonalne i podlega wytycznym instytucjonalnym.
- Do wszystkich zabiegów chirurgicznych należy używać sterylnych narzędzi jednorazowych lub wysterylizowanych.
- Laparotomia w linii środkowej i odsłonięcie jelita grubego
- Użyj nożyczek (alternatywnie można użyć skalpeli), aby wykonać nacięcie w linii środkowej (~ 15 mm) na skórze dolnej części brzucha.
- Podnieś mięśnie ściany brzucha kleszczami i ostrożnie naciąć je nożyczkami, otwierając jamę brzuszną.
- Zidentyfikuj dystalną okrężnicę, dotykaj jej tylko atraumatycznymi kleszczami. Zacisnąć okrężnicę delikatnym zaciskiem (np. zaciskiem naczyniowym Micro Serrefine) około 15 mm proksymalnie od odbytu.
nuta: Przez cały czas zwracaj szczególną uwagę na wrażliwość jelita grubego. Perforacja nieuchronnie prowadzi do zapalenia otrzewnej i sepsy oraz wymaga eutanazji zwierzęcia.
- Segmentowe zakażenie jelita grubego wirusem Adeno-cre
- Włóż elastyczną rurkę teflonową przezodbytniczo i ostrożnie przesuwaj ją, aż osiągnie okluzję światła uzyskaną przez zacisk umieszczony wcześniej 15 mm od krawędzi odbytu. Nie używaj nadmiernej siły, ponieważ może to prowadzić do perforacji.
- Kanunumeruj probówkę kaniulą 30G, podłącz standardową strzykawkę o pojemności 1 ml i przepłucz okrężnicę zwykłą solą fizjologiczną, aby usunąć pozostały kał. Może to wymagać kilku ml soli fizjologicznej.
- Gdy dystalna okrężnica jest pusta, wyjmij rurkę i zastąp ją świeżą rurką teflonową i ponownie umieść ją bezpośrednio dystalnie do zacisku, jak opisano powyżej.
- Okrężnica należy zatkać drugim zaciskiem ~ 3 mm dystalnie do zacisku proksymalnego (tj. nad wprowadzoną rurką, ~ 12 mm od krawędzi odbytu), co skutkuje izolowanym segmentem o grubości 3 mm, który ma zostać zainfekowany.
nuta: Do dystalnej okluzji segmentu najbardziej odpowiednie okazały się klipsy do tętnic wieńcowych Fogarty, ponieważ są gumowane, co prowadzi do ciasnej niedrożności okrężnicy pomimo rurki śródświetlnej między gałęziami zacisku.
- Użyj drugiej strzykawki (standardowo 1 ml z kaniulą 30G), aby ostrożnie wstrzyknąć 50 - 80 μl 0,25% trypsyny-EDTA do zaciśniętego segmentu okrężnicy i inkubować przez 10 minut. Pozostaw kaniulę i strzykawkę podłączone do rurki teflonowej, aby zapobiec cofaniu się płynu.
nuta: Jelito grube musi być napompowane, aby przełamać barierę śluzówkową i dotrzeć do krypty komórek macierzystych, ale nie za bardzo, aby uniknąć perforacji zaciśniętego segmentu.
- Najpierw usuń dystalny zacisk, a następnie rurkę trypsyny.
- Przepłukać dystalną część jelita grubego ~ 500 μl soli fizjologicznej, aby usunąć pozostałą trypsynę.
- Włóż nową rurkę teflonową, umieść dystalny zacisk z powrotem na miejscu i napompuj segment okrężnicy 50 - 80 μl roztworu adenowirusowego (1011 jednostek tworzących płytkę (PFU)/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem) i inkubuj przez 30 minut (Figura 2A).
nuta: Nie rozlewaj roztworu wirusa, ponieważ kontakt z adeno-cre może prowadzić do rozwoju guza w dowolnej tkance warunkowo zmutowanych myszy.
- Usuń zaciski i rurkę.
- Zamknięcie brzucha i rekonwalescencja pooperacyjna
- Zamknij ścianę brzuszną za pomocą 6-0 szybko wchłanialnych szwów biegowych (np. polidioksanon (PDS)).
- Zamknij skórę klipsami chirurgicznymi do ran.
- Umieść mysz na poduszce grzewczej ustawionej na 38 °C, aż do całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia.
- Podać kolejny bolus 0,05 mg/kg buprenorfiny domięśnie 12 godzin po zabiegu, a następnie dodatkowe bolusy buprenorfiny co 12 godzin, jeśli to konieczne.
- Monitoruj myszy co najmniej raz dziennie pod kątem oznak niepokoju spowodowanego wzrostem guza.
2. Kolonoskopia
UWAGA: W zależności od zastosowanych mutacji warunkowych, infekcja adenowirusowa prowadzi do endoskopowo widocznych guzów w ciągu 2 - 4 tygodni. Dlatego pierwszą kolonoskopię pooperacyjną należy wykonać 2 tygodnie po indukcji adenowirusa i powtarzać co 2 tygodnie. Do kolonoskopii mysiej zalecany jest dostępny na rynku system.
- Przygotowanie zwierząt do kolonoskopii
nuta: Post nie jest wymagany. Pozostały kał jest zwykle dobrze uformowany w dystalnej części okrężnicy i może zostać wypchnięty poza guz podczas kolonoskopii, dzięki czemu stresujący proces powtarzającego się postu nie jest potrzebny.
- Stosować sewofluran w stężeniu 3 - 3,5% obj. do znieczulenia ogólnego. Utrata odruchu szczypania palca u nogi wskazuje na wystarczające znieczulenie.
- Zakryj oczy znieczulonych myszy maścią okulistyczną, aby uniknąć wysuszenia rogówki.
- Unieruchamiaj myszy w pozycji leżącej na małym stole.
- Kolonoskopia
- Włóż lunetę (średnica 1,9 mm; długość 10 cm) do przewodu pokarmowego przez odbyt i ostrożnie wdmuchuj powietrze pod kontrolą wzrokową, aby rozciągnąć okrężnicę. Nie wdmuchiwać więcej powietrza niż jest to wymagane do badania.
nuta: Do wdmuchiwania powietrza można zastosować pompę powietrza przeciwmgielnego systemu kolonoskopowego. Jeśli nie jest dostępna pompa powietrza przeciwmgielnego, można użyć dowolnej innej pompy powietrza z bardzo niskimi ustawieniami ciśnienia lub sprężonego powietrza z delikatnym zaworem redukcyjnym ciśnienia. Dwutlenek węgla (CO2 ) łatwo prowadzi do kwasicy u małych gryzoni i dlatego należy go unikać.
- Ostrożnie popchnij lunetę do przodu, aż będzie można zidentyfikować zmianę błony śluzowej w dalszej części jelita grubego (ryc. 1A - 1D).
- Zapisz obrazy endoskopowe do późniejszej oceny. Endoskopowy system punktacji guzów śródświetlnych został opisany wcześniej.
- Ostrożnie zdejmij lunetę i umieść mysz na poduszce grzewczej ustawionej na 38 °C, aż całkowicie wyzdrowieje ze znieczulenia.
