Test wiązania mikrotubul w komórkach CRC: metoda badania białka Tau wiążącego mikrotubule w komórkach raka jelita grubego

Streszczenie

Źródło: Huda, M. N., et al. Test na fosforylację i wiązanie mikrotubul wraz z lokalizacją białka Tau w komórkach raka jelita grubego. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film opisuje test wiązania mikrotubul używany do oddzielania białka tau wiążącego mikrotubule od niewiążących, hiperfosforylowanych frakcji białka tau w komórkach raka jelita grubego. Test ten pomaga określić wpływ różnych substancji chemicznych, które mogą zmieniać stan fosforylacji białka tau, wpływając na jego wiązanie w mikrotubulach.

Protokół

1. Test wiązania mikrotubul

1. Do testu wiązania mikrotubul dodać ~1 x 10⁶ komórek HCT 116 do 100-milimetrowych szalek do hodowli tkankowych zawierających minimalną ilość niezbędnych pożywek (MEM) uzupełnionych 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną. Po jednym dniu hodowli komórki osiągną 60-70% konfluencji.
2. Przygotować 1X (2 ml) bufor PEM z 10X buforu PEM przechowywanego w temperaturze 4 °C, dodając 20 μM (40 μL) paklitakselu i 1 mM (20 μL) GTP. Weź bulion z mikrotubul (MT) z zamrażarki w temperaturze -80 °C, a zapas roboczy E. coli tau z zamrażarki w temperaturze -20 °C.
3. Przygotować próbki zgodnie z tabelą 1.
4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Ultrawirować w temperaturze 25 °C przez 60 minut w temperaturze 100 000 x g.
5. Przenieść 120 μl supernatantów zawierających niezwiązane tau do czystych i oznakowanych probówek.
6. Dodać 120 μl (taka sama objętość jak supernatant) 5-krotnego buforu do próbki do osadu zawierającego związany tau i dokładnie wymieszać. Przenieś roztwór do czystych, oznakowanych probówek i dokładnie wymieszaj.
7. Zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda przy użyciu komercyjnych zestawów do oznaczania białek.
   nuta: Podczas przygotowywania próbek należy wykorzystać objętość roztworu (krok 1.6) do przygotowania zarówno osadu, jak i próbek sklarowanych nad osadem.
8. Przygotuj próbki o równoważnym stężeniu białka i dodaj świeżo przygotowane 4x bufor do ładowania żelu SDS zawierający DTT (400 mM).
   nuta: Na tym etapie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.
9. Inkubować próbki w bloku grzewczym w temperaturze 100 °C przez 5 minut. Wymieszać próbki za pomocą wiru. Schłodzić w temperaturze pokojowej przez ~10-15 min.
10. Zmontuj system elektroforezy do uruchamiania 10% żelu poliakryloamidowego firmy SDS-PAGE.
    1. Załaduj 10 μg białka (13 μl próbki) na studzienkę na 10% żel poliakrylamidowy. Załaduj drabinę o masie cząsteczkowej.
    2. Po załadowaniu próbki podłącz elektrody dodatnie i ujemne systemu elektroforezy do źródła zasilania, aby utrzymać stałe napięcie. Początkowo należy rozpocząć od napięcia 70 V przez 20 minut, aby przenieść próbki białka z żelu do układania w stos do żelu rozdzielczego. Następnie zwiększ napięcie do 125 V i uruchom żel na około 70-120 minut, aż próbki i drabinka białkowa dotrą do końca żelu.
    3. Po zakończeniu elektroforezy należy przenieść żel na membranę PVDF za pomocą mokrego systemu do elektrobibuły. Przesył przez ~100 min przy 100 V.
    4. Zaznacz plamę, wykonując małe nacięcie z boku drabiny o masie cząsteczkowej. Do przecięcia kleksa użyj przezroczystego plastikowego arkusza i ostrego noża.
11. Zablokować membranę w 4% buforze blokującym BSA na 90 minut w temperaturze pokojowej.
12. Inkubować blot w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego (anty-tau w stosunku 1:5 000) w temperaturze 4 °C przez noc. Umyj blot w PBST cztery razy, po 7 minut każdy.
13. Przygotować odpowiedni roztwór przeciwciała drugorzędowego (kozia anty-mysia IgG w stosunku 1:5 000) i inkubować blot przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Umyj w PBST cztery razy, po 7 minut każdy.
14. Opracuj blot za pomocą zestawu do chemiluminescencji zgodnie z zaleceniami producenta. Przykryj blot przezroczystą folią. Pozyskiwanie obrazów za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencji dla chemiluminescencji za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Tabela 1: Przygotowanie próbki do testu wiązania mikrotubul.

próbka	nazwa	Potrzebna mikrotubula	Główne potrzebne białko	PEM-GTP-PTX
1	HCT 116-Control (6,21 μg/μl)	2 μl	9,66 μl (60 μg)	108,34 μl
cyfra arabska	HCT 116-Kurkumina 10 μM (4,81 μg/μl)	2 μl	16,63 μl (80 μg)	101,37 μl
3	HCT 116-Kurkumina 20 μM (3,28 μg/μl)	2 μl	30,49 μl (100 μg)	87,51 μl
4	HCT 116-LiCl 25 mM (5,43 μg/μl)	2 μl	18,42 μl (100 μg)	99,58 μl
5	E. coli tau	2 μl	1 μl TAU-352	117 μl
6	Tylko MT	2 μl	Z	118 μl
				120 μl każdy

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komórka HCT 116	Kontroler ATCC (Kontroler T	Zobacz materiał CCL-247
MEM (EBSS)	Klon	SH30024.01
Talerz 100 mm	Corning	430161
Przeciwciało anty-Tau 13	Biblioteka ABCAM	AB19030
Ditiotreitol (DTT)	Roche	10 708 984 001	Temperatura przechowywania 2–8 °C
Wirówki mikrolitrowe	Hettich Zentrifugen	MIKRO 200 R
Paklitaksel	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T1912	Temperatura przechowywania 2–8 °C
Kurkumina	Sigma-Aldrich (Fluka)	Numer telefonu 78246	Temperatura przechowywania 2–8 °C
Mikrotubule (MT)	Cytoszkielet	MT001 MT001 (MT001	Przechowywać w temperaturze 4 °C (na sucho)
wodorotlenek sodu	Sigma	Numer katalogowy: 72068
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M2670
GTP (GTP)	Sigma-Aldrich	Telefon komórkowy G8877	Przechowywać w temperaturze -20 °C
DPBS (Polskie Biuro Obsługi	WelGene	LB 001-02
Dysmubrator dźwiękowy	Fisher Naukowy	Wzór 500
Ultrawirówka	Beckman Coulter	Samolot Optima L-100 XP
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma	A7906
Obrazowanie molekularne	Bio-Rad	ChemiDoc XRS+	Przechowywać w temperaturze 4 °C
Odczynnik do oznaczania białek	Bio-Rad	500-0006
α-tubulina (11H10) MAb królika	Sygnalizacja komórkowa	2125
GAPDH (14C10) MAb królika	Sygnalizacja komórkowa	Numer katalogowy: 2118
Przeciwciało anty-Tau (fosfo S396)	Księga Abcam	ab109390
Tau-352 człowiek	Sigma	T 9950	Przechowywać w temperaturze -20 °C
Membrana PVDF	Bio-Rad	Numer katalogowy: 162-0177
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Affymetrix	Numer telefonu 75819
Test białka	Bio-Rad	500-0006	Przechowywać w temperaturze 4 °C
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG Drugorzędowe	Rybak termiczny	A-11005	Przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności

powiedział: ) Klienta powiedział: szt. powiedział: