Izolacja CTC z próbki krwi pełnej: metoda uzyskiwania CTC z mysiego modelu raka jelita grubego

Streszczenie

Źródło: Kochall, S., et al. Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film opisuje szczegółowy protokół izolowania krążących komórek nowotworowych z próbki krwi pełnej z mysiego modelu guza jelita grubego poddanego eutanazji. Te wyizolowane CTC mogą być hodowane i wykorzystywane do zamierzonej dalszej analizy.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Izolacja krążących komórek nowotworowych z próbek krwi pełnej

UWAGA: Pobieranie krwi przez przezskórne nakłucie serca u znieczulonych myszy, a następnie eutanazja. Idealnie byłoby, gdyby 1000 μl krwi zostało pobrane do strzykawki wypełnionej 100 μl antykoagulantu (kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) lub heparyna). Użyj przeciwciała anty-ludzkiego-EpCAM (cząsteczka adhezyjna komórek nabłonka), aby zidentyfikować CTC. Działa to bardzo dobrze, jeśli w modelu mysim wykorzystuje się ludzkie linie komórkowe nabłonka. W przypadku innych zastosowań mogą być wymagane różne przeciwciała.

1. Wzbogacenie CTC:
   1. Napełnij probówki o pojemności 15 ml pożywką o gradiencie gęstości o pojemności 5 ml i ostrożnie przenieś krew do probówki o pojemności 15 ml.
   2. Odwirować (30 minut przy 300 x g bez hamulca) i ostrożnie usunąć górny supernatant.
   3. Resztę przelać do nowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować (15 min, 300 x g z hamulcem).
   4. Odzyskać interfazę zawierającą komórki jednojądrzaste (odrzucić resztę) i dwukrotnie przemyć komórki PBS.
   5. Zawiesić osad w 200 μl PBS/1% EDTA i dodać 4 μl przeciwciała EpCAM. Inkubuj 20 minut na lodzie w ciemności.
2. Przesiewanie i kompletacja
   1. Przygotować następujący bufor (zwany dalej buforem do zbierania): PBS + 10% płodowa surowica cielęca (FCS) + 1% penicylina/streptomycyna (1%) + 0,8% EDTA.
   2. Za pomocą pisaka PAP narysuj okrąg o średnicy ~1 cm na sterylnej szalce Petriego o średnicy 6 cm (zapobiega rozpraszaniu się płynu w naczyniu) i odpipetuj 700 μl buforu do tego koła.
   3. Dodaj 50 μl zawiesiny komórek do 700 μl buforu do pobierania w okręgu. Sprawdź gęstość komórek pod mikroskopem. Podziel próbkę na różne naczynia, jeśli jest zbyt gęsta.
   4. Poczekaj, aż komórki się uspokoją (~5 min).
   5. Przesiewać kroplę zawiesiny komórkowej dla komórek barwionych (= EpCAM-dodatnich) komórek.
   6. Po znalezieniu komórki należy ją pobrać za pomocą mikromanipulatora i umieścić w buforze o pojemności 50 μl, w zależności od zamierzonej dalszej analizy (np. buforu do ekstrakcji RNA lub pożywki hodowlanej).
   7. W zależności od zamierzonych dalszych analiz, wyizolować komórki i/lub pożywkę EpCAM-ujemne jako kontrole ujemne.
   8. Kontynuuj dalsze analizy (np. hodowla komórkowa, PCR).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Gradient gęstości średni – Ficoll	StemCell - Preparat limfatyczny	Zobacz materiał 7801
Alexa Fluor 488 anty-ludzkie przeciwciało CD326 (EpCAM) klon 9C4	Legenda biologiczna	Numer katalogowy: 324210
Alexa Fluor 488 anty-mysie przeciwciało CD326 (EpCAM) klon G8.8	Legenda biologiczna	Numer katalogowy: 118210
Szalka Petriego, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Odpowietrznik	Greiner bio-one	628102
Fluorescencyjny mikroskop hodowli komórek	Księga Leica
Mikromanipulator Transferman 4r	Eppendorf
Komórka Tram Powietrze	Eppendorf		pompa aspiracyjna podłączona do mikromanipulatora
Uniwersalny ściągacz do mikroelektrod Dmz	Korporacja Dagan		wymagane do produkcji mikrokapilar do aspiracji pojedynczych komórek
Kapilary szklane pryzmatyczne	Korporacja Dagan
Długopis PAP	Księga Abcam
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco	Life Technologies GmbH	14190169	bufor kompletacyjny
Surowica cielęca płodu (FCS)	BIOCHROM AG	S 0115	bufor kompletacyjny
Penicylina/Streptomycyna (PenStrep)	Life Technologies GmbH	15140122	bufor kompletacyjny
Edta	Roth	8040.1	bufor kompletacyjny
Immunohistochemia
Oczyszczony klon przeciwciała anty-ludzkiego CD326 (EpCAM) 9C4	Legenda biologiczna	324201	Immunohistochemia EpCAM
HRP królik anty-mysi IgG	Księga Abcam	ab97046	Immunohistochemia EpCAM