$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie organotypowe:
Przygotowanie żelu organotypowego impregnowanego fibroblastami:
- Przygotować zawiesinę komórek fibroblastów zawierającą 5 x 105 komórek na organotyp w DMEM, uzupełnioną 10% FCS i 292 μg/ml L-glutaminy.
- Żele organotypowe przygotować na lodzie w następujących proporcjach:
- • 7 tomów Kolagenu ze Szczurzego Ogona: Matrigel mix (1:1)
- • 1 objętość filtrowanego 10x DMEM
- • 1 objętość SKO
- • 1 objętość zawiesiny komórek fibroblastów zawierająca 5 x 105 fibroblastów
Na 9 żeli (1 ml na żel) przygotuj 10 ml i delikatnie wymieszaj, aby uniknąć pęcherzyków.
- Dodaj 1 ml do każdego dołka na 24-dołkowej płytce i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze, aby żele zastygły. Po 1 godzinie dodaj 1 ml DMEM (10% FCS)/Glut na wierzch żeli i wróć na noc do inkubatora.
- Następnego dnia należy odessać pożywkę od góry żeli i płytki 1 ml pożywki zawierającej 5 x 105 komórek nabłonka CRC.
Przygotowanie arkuszy nylonowych powlekanych żelem:
- Przygotuj wcześniej sterylne, autoklawowane nylonowe arkusze o wymiarach 1,5 cm x 1,5 cm.
- Za pomocą sterylnych kleszczy umieść wymaganą liczbę nylonowych arkuszy w naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm (zwykle w jednym naczyniu można pomieścić 4 nylonowe arkusze).
- Uzupełnić żel na lodzie w następującej kolejności (wymagana jest całkowita objętość 250 μl na arkusz nylonu):
- • 7 tomów kolagenu ze szczurzego ogona
- • 1 objętość filtrowanego 10x DMEM
- • 1 objętość SKO
- • 1 objętość DMEM 10% FCS/Glut
- Jeśli roztwór jest żółty, zobojętnić przez dodanie 0,1 M NaOH w 50 μl porcji, aż roztwór zmieni kolor na różowy.
- Dodać 250 μl tego roztworu do każdego arkusza nylonu i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 przez 30 minut, aby żel stwardniał.
- Uzupełnij 1% roztwór aldehydu glutarowego w PBS. Po stężeniu żelu dodać 10 ml do każdego naczynia hodowlanego o średnicy 10 cm i inkubować w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
- Arkusze nylonu prać 3x w PBS i 1x w DMEM (10% FCS)/Glu i inkubować przez noc w DMEM/Glu w temperaturze 4 °C.
Unoszenie żeli organotypowych na stalowych siatkach w celu inwazji:
- Przygotuj rusztowania, składając arkusze stali nierdzewnej w formację trójnogu. Autoklaw przed użyciem.
- Użyj kleszczyków wysterylizowanych w etanolu, aby umieścić stalową siatkę w każdym dołku sześciodołkowej płytki.
- Umieść pokryty żelem arkusz nylonowy stroną kolagenową do góry na każdej siatce.
- Ostrożnie przenieść żele organotypowe z płytki 24-dołkowej na wypukły arkusz nylonowy za pomocą szpatułki wysterylizowanej w etanolu.
- Napełnij studzienkę DMEM 10% FCS/Glut uzupełnionym 10% FCS, aż arkusz nylonu zetknie się z medium, ale nie zostanie zanurzony. Upewnij się, że podłoże nie styka się z żelem organotypowym.
- Inkubować przez 14 dni w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 , wymieniając pożywkę co 2 dni.
2. Utrwalenie organotypowe
- Usuń cały arkusz organotypowy, w tym nylonowy, z dołka i umieść na folii spożywczej.
- Przetnij arkusz organotypowy i nylonowy za pomocą czystego jednorazowego skalpela i utrwal obie połówki w formaldehydzie na 24 godziny w temperaturze pokojowej.
- Zastąp formaldehyd 70% etanolem po 24 godzinach i pozostaw na noc przed zatopieniem w parafinie, pocięciem i barwieniem.
3. Laserowa mikrodysekcja inwazyjnego marginesu
- Przekrój do grubości 10 μm na szkiełkach montowanych na membranie.
- Odparafinować skrawki, nakładając ksylen na 1 minutę, następnie usunąć ksylen i utrwalić 75% etanolu przez kolejne 1 minutę.
- Usuń etanol i zabarwić 0,125% roztworem fioletu krezylowego przez 1 minutę. Fiolet krezylowy uwydatnia komórki nabłonkowe i umożliwia łatwą dyskryminację od zrębu.
- Usuń fiolet krezylowy i nałóż 100% etanol na kolejną 1 minutę, a następnie spłucz 100% etanolem. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut.
- Przeprowadź mikrodysekcję laserową przy użyciu wybranej platformy (np. systemu Leica AS).
- Umieść szkiełko podstawowe z zabarwioną częścią przeznaczoną do mikropreparowania ekranem do dołu na stoliku mikroskopu.
- Zamontuj probówkę do mikrowirówki o pojemności 0,5 ml w kasecie zbiorczej i dodaj 50 μl buforu do lizy komórek (np. buforu do lizy DNA, RNA lub białka) do nasadki, do której zbierze się mikrowypreparowana tkanka.
- W polu widzenia bezpośredniego użyj joysticka, aby zidentyfikować tkankę będącą przedmiotem zainteresowania. Korzystając z interfejsu oprogramowania, opisz wybarwioną sekcję organiczną, podkreślając komórki, które mają zostać poddane mikrosekcji na froncie inwazji guza.
- Poinstruuj laser, aby wystrzelił, co powinno zarówno wyciąć podświetloną sekcję, jak i wepchnąć mikrowypreparowaną tkankę do nasadki probówki mikrowirówkowej.
- Po zebraniu wystarczającej ilości materiału wysuń kasetę zbiorczą, zamknij probówkę mikrowirówki i delikatnie odwiruj, aby wyciągnąć bufor do lizy na dno probówki.
- Umieść próbki na lodzie do momentu zakończenia mikrodysekcji. Próbki należy przetworzyć odpowiednią metodą w celu ekstrakcji analitu będącego przedmiotem zainteresowania.