Test cytometrii trakcyjnej: metoda ilościowego określania siły trakcyjnej wywieranej przez komórki rakowe na ECM

Abstract

Źródło: Ali, M. Y., et al. Izolacja pierwotnych komórek nowotworowych jelita grubego ludzkiego z tkanek chirurgicznych i hodowla ich bezpośrednio na miękkich elastycznych podłożach do cytometrii trakcyjnej. J. Vis. Exp. (2015).

Ten film opisuje test mikroskopii siły pociągowej. Test określa trakcję komórkową ludzkich komórek raka jelita grubego na macierzy zewnątrzkomórkowej obecnej na miękkim elastycznym hydrożelu z osadzonymi kulkami fluorescencyjnymi. Wynikowe przemieszczenie kulek fluorescencyjnych mierzy się za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Protocol

1. Test mikroskopii siły trakcyjnej

1. Ogrzewać 0,25% roztwór trypsyny-EDTA/10% SDS w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 10 minut przed rozpoczęciem eksperymentów trakcyjnych.
2. Usunąć jeden żel (Funkcjonalizować żele PA i szkło z cząsteczkami ECM, ludzką fibronektyną w stężeniu 50 μg/ml) z inkubatora hodowli komórkowych w odpowiednim miejscu i miejscu na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego z odwróconym ekranem (powiększenie 32x).
3. Znajdź pojedynczą komórkę w polu widzenia. Zdejmij pokrywkę szalki Petriego.
4. Wykonaj obraz komórki z kontrastem fazowym (np. Rysunek 1).
5. Przełącz tryb obrazowania na fluorescencję i wybierz odpowiedni filtr. W tym czasie nie przesuwaj stolika mikroskopu ani próbki.
6. Zrób zdjęcie koralików fluorescencyjnych przemieszczonych przez trakcję komórkową (rysunek 2C).
7. Dodać 1 ml roztworu trypsyny/SDS do szalki Petriego, aby odłączyć komórkę od żelu. W tym czasie nie przesuwaj stolika mikroskopu ani próbki. Wykonaj również obraz kontrolny komórki, aby zapewnić całkowite usunięcie z żelu.
8. Wykonaj obraz referencyjny (siła zerowa) koralików po usunięciu komórki.
9. Powtórz kroki 1.2-1.8 dla wszystkich innych żeli.
10. Utwórz stos obrazów przy użyciu ImageJ z dwóch obrazów uzyskanych w krokach 1.6 i 1.8 dla każdego przypadku. Aby wygenerować stos obrazów, użyj następującej sekwencji poleceń w ImageJ po otwarciu obrazów: Stosy obrazów → → Obrazy do stosu.
11. Aby uzyskać pole przemieszczenia i przyczepność, użyj wtyczek ImageJ zgodnie z opublikowanymi metodami. Uzyskaj kody i szczegółowe samouczki dla tych wtyczek, korzystając z poniższego linku: https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
    1. Wyrównaj obrazy w stosie za pomocą wtyczki "Template Matching". Użyj następującej sekwencji poleceń w ImageJ po otwarciu stosu obrazów wygenerowanego w kroku 1.10: Wtyczki → Dopasowywanie szablonów → Wyrównaj plasterki w stosie → OK. W konsekwencji zapisz stos obrazów. Użyj tego nowego stosu obrazów w poniższych krokach.
    2. Uzyskaj pole przemieszczenia za pomocą wtyczki PIV (prędkość obrazu cząstek) (rysunek 2D). Po otwarciu stosu obrazów zapisanego w kroku 1.11.1 użyj następującej sekwencji poleceń: Wtyczki → PIV → Iteracyjny PIV (podstawowy) → OK → Zaakceptuj ten PIV i wyprowadź → Ok. Zapisz dane wyjściowe PIV w tym samym katalogu, co w oryginalnym stosie obrazów. Użyj tego jako danych wejściowych w następnym kroku.
    3. Na koniec użyj wtyczki FTTC (cytometria trakcyjna z transformacją Fouriera), aby uzyskać mapę trakcji (rysunek 2E). Użyj następującej sekwencji poleceń: Wtyczki → FTTC → Wstaw właściwości materiału, tj. moduł Younga i stosunek Poissona żelu PA → OK → Wybierz plik wyjściowy PIV zapisany w kroku 1.11.2 → OK. Zapisz wyniki FTTC w tym samym katalogu, co w stosie obrazów i danych wyjściowych PIV.

Results

Rysunek 1. Udana pierwotna hodowla ludzkich komórek jelita grubego (zarówno rakowych, jak i normalnych) na żelach o różnej sztywności i na naczyniu polistyrenowym. Obrazy z kontrastem fazowym pokazują typową morfologię (A) komórek nowotworowych i (B) komórek normalnych na podłożach o różnej sztywności.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pbs	Lonza	17-516F
trypsyna	Worthington	LS003736
Akrylamid	Sigma-Aldrich	Nr kat. A4058
N-metylenobisakryloamid (bis)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M1533
Ludzka fibronektyna	BD nauki biologiczne	354008
Koraliki flurekcyjne 0,1 μm	Technologie życiowe	Zobacz materiał F8801
0,25% trypsyna-EDTA	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 25200-056
Szkiełka nakrywkowe 12 mm2	Corning	2865-12