Method Article

Test organizacji cytoszkieletu i adhezji ogniskowej: metoda oparta na immunofluorescencji do badania adhezji komórek i rozprzestrzeniania się na podłożach

April 30th, 2023

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Ali, M. Y et al., Izolacja pierwotnych komórek nowotworowych jelita grubego u człowieka z tkanek chirurgicznych i hodowla ich bezpośrednio na miękkich elastycznych podłożach do cytometrii trakcyjnej. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film opisuje technikę badania cytoszkieletu i ogniskowych zrostów w pierwotnych komórkach ludzkiego raka jelita grubego, aby zrozumieć jego zmiany w zależności od sztywności podłoża. Ta hodowla komórek rakowych na miękkich i twardych podłożach umożliwia różne dalsze pomiary biofizyczne w celu prognozowania raka.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Testy mikroskopii immunofluorescencyjnej

  1. Pobrać podłoża z komórkami, które mają być wybarwione immunologicznie, do okapu laminarnego i usunąć pożywkę hodowlaną.
  2. Przepłukać podłoża PBS i utrwalić komórki 4% paraformaldehydem w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Umyć podłoża PBS trzykrotnie (za każdym razem 5 minut). W związku z tym inkubować podłoża z 500 μl wzmacniacza sygnału przez 30 minut i płukać PBS.
  4. Inkubować komórki z przeciwciałem monoklonalnym anty-winkulinowym w rozcieńczeniu 1:250 w PBS przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy przemyć podłoża PBS 3 razy (za każdym razem....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 1. Barwienie immunofluorescencyjne F-aktyny i winkuliny na miękkich podłożach żelowych i twardych polistyrenowych.Brak błonnika aktynowego w mniej rozpowszechnionej (A1) komórce nowotworowej lub (A2) normalnej komórce na miękkich żelach 2 kPa. Jednak punktowe zrosty ogniskowe zawierające winkulinę są obecne na miękkich żelach (B1-B2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Odczynniki
Pbs Lonza 17-516F
Paraformaldehyd Nauki o mikroskopii elektronowejRT15710
Wzmacniacz sygnałuTechnologie życiowe I36933
Przeciwciało monoklonalne anty winkuliny Sigma-AldrichZobacz materiał V9131
Alexa Fluor 488 kozia anty-mysia IgG Technologie życioweA11001
Koniugaty falloidyny TRITC Sigma-AldrichZobacz materiał P1951
Materiałów
Szkiełka nakrywkowe 12 mm2 Corning2865-12
powiedział:

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cytoskeleton OrganizationFocal AdhesionImmunofluorescence AssayCell AdhesionSubstrate RigidityVinculin StainingActin FilamentsConfocal MicroscopyParaformaldehyde FixationPhalloidin Conjugates

Related Articles