Test organizacji cytoszkieletu i adhezji ogniskowej: metoda oparta na immunofluorescencji do badania adhezji komórek i rozprzestrzeniania się na podłożach

1. Testy mikroskopii immunofluorescencyjnej

1. Pobrać podłoża z komórkami, które mają być wybarwione immunologicznie, do okapu laminarnego i usunąć pożywkę hodowlaną.
2. Przepłukać podłoża PBS i utrwalić komórki 4% paraformaldehydem w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
3. Umyć podłoża PBS trzykrotnie (za każdym razem 5 minut). W związku z tym inkubować podłoża z 500 μl wzmacniacza sygnału przez 30 minut i płukać PBS.
4. Inkubować komórki z przeciwciałem monoklonalnym anty-winkulinowym w rozcieńczeniu 1:250 w PBS przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy przemyć podłoża PBS 3 razy (za każdym razem 5 min).
5. Inkubować próbki z przeciwciałem drugorzędowym Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgG w rozcieńczeniu 1:200 w PBS w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przemyć podłoża PBS 3 razy (za każdym razem 5 minut).
6. Aby uwidocznić strukturę F-aktyny, inkubuj komórki z koniugatami falloidyny TRITC w stężeniu 50 μg/ml przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Następnie należy przemyć podłoża PBS 3 razy (za każdym razem 5 min).
7. Zobrazuj próbki za pomocą konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego (rysunek 1A-1D).

Rysunek 1. Barwienie immunofluorescencyjne F-aktyny i winkuliny na miękkich podłożach żelowych i twardych polistyrenowych.Brak błonnika aktynowego w mniej rozpowszechnionej (A1) komórce nowotworowej lub (A2) normalnej komórce na miękkich żelach 2 kPa. Jednak punktowe zrosty ogniskowe zawierające winkulinę są obecne na miękkich żelach (B1-B2). I odwrotnie, komórki pierwotne wykazują dobrze rozłożoną morfologię, dobrze zdefiniowane włókna naprężenia aktynowego (C1-C2) i dyskretne wydłużone zrosty ogniskowe (D1-D2) na sztywnych podłożach polistyrenowych.