Przygotowanie bloku zamrożonej tkanki skórnej: protokół zachowania próbek czerniaka skóry z mysiej skóry grzbietowej

Streszczenie

Źródło: Moon, H., et al. Przestrzenna i czasowa kontrola inicjacji mysiego czerniaka ze zmutowanych komórek macierzystych melanocytów. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film opisuje szczegółowy protokół izolacji mysiej skóry grzbietowej zawierającej czerniaka, a następnie krioemnestingu w celu przygotowania zamrożonego bloku tkanki skórnej. Blok tkankowy osadzony w krioterapii można podzielić na sekcje i zbadać pod mikroskopem w celu zbadania progresji czerniaka.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Przetwarzanie tkanek

1. Izolacja skóry
   1. Przed rozpoczęciem zaopatrz się: w narzędzia do sekcji zwłok, bibułę filtracyjną i ręczniki papierowe.
   2. Poddaj myszy eutanazji zgodnie z zatwierdzonymi protokołami i potwierdź śmierć przed kontynuacją.
   3. Za pomocą maszynki do strzyżenia włosów zgol włosy z grzbietowej części skóry. Delikatnie przeczesz obszar niestrzępiącą się chusteczką, aby oczyścić obszar.
   4. Wykonaj małe nacięcie ostrymi nożyczkami tuż nad podstawą ogona.
   5. Włóż duże nożyczki do nacięcia i oddziel podskórne tkanki łączne.
   6. Ostrożnie odizoluj obszar skóry, który Cię interesuje, przecinając ostrymi nożyczkami wzdłuż krawędzi tkanki.
   7. Umieść tkankę skóry na czystym ręczniku papierowym i za pomocą kleszczy rozciągnij skórę tak, aby przylegała do ręcznika i była napięta. Ten krok służy zapewnieniu dodatkowego wsparcia dla tkanki, aby można było nią manipulować i przetwarzać przy zachowaniu jej kształtu.
      nuta: Należy uważać, aby dotykać tylko zewnętrznych obszarów tkanki skórnej, ponieważ kleszcze mogą spowodować uszkodzenie skóry, które można zobaczyć histologicznie.
2. Utrwalanie tkanek
   1. Złóż kawałek bibuły filtracyjnej na pół i odpowiednio oznacz. Umieść skórę wraz z podkładem ręcznika papierowego w złożonym papierze bezpośrednio przylegającym do zagięcia, upewniając się, że próbka jest gładka i nie jest pofałdowana ani pognieciona. Uszczelnij bibułę filtracyjną, zszywając otwarte boki, a następnie przytnij, aby pozostała bibuła mogła być wykorzystana do przyszłych próbek.
      nuta: Ten krok jest wykonywany tak, aby skóra zachowała swój kształt podczas utrwalania.
   2. Całkowicie zanurzyć próbkę tkanki w 10% obojętnej buforowanej formalinie na 3 do 5 godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
   3. Po utrwaleniu należy wyjąć próbki z formaliny, umyć w wodzie dejonizowanej (2x 5 min każda) i przystąpić do wykonywania bloków tkankowych. Ostrożnie usuń wszelkie resztki materiału z tkanki skórnej (tj. resztki papieru).
3. Wytwarzanie zamrożonych bloków tkanek (ryc. 1)
   1. Przytnij krawędzie próbki skóry tak, aby nie były postrzępione, a następnie wykonaj 3 strzałkowe nacięcia. Szerokość tych pasków nie powinna być większa niż wysokość kriomoldu (5 mm). Następnie należy wykonać nacięcia poprzeczne, aby kawałki skóry nie były dłuższe niż szerokość kriomoldu (20 mm) i można je było osadzić. Powtórz z pozostałą połową skóry grzbietowej lub zachowaj tkankę do innych zastosowań (alternatywnie, zachowaj połowę przed utrwaleniem).
      nuta: Ważne jest, aby utrzymać kawałki skóry we właściwej orientacji.
   2. Ustaw kriomold (25 x 20 x 5 mm³) w orientacji pionowej i umieść 4 do 5 kawałków skóry na wierzchu OCT. Gdy wszystkie elementy znajdą się na swoim miejscu, użyj 2 par cienkich kleszczy, aby przyłożyć długą krawędź skóry do dna krioformy. Skóra powinna teraz stać w OCT prostopadle do podstawy formy. Na tym etapie należy zwrócić uwagę, aby zminimalizować tworzenie się kieszeni powietrznych w OCT (rysunek 1).
   3. Napełnij foremkę OCT do drugiej wargi i umieść ją na płaskiej powierzchni suchego lodu. Użyj kleszczy, aby dostosować wszelkie kawałki skóry, które mogły się przesunąć podczas przenoszenia, gdy blok zaczyna zamarzać. Po zestaleniu się dolnej warstwy manipulacja tkankami będzie niemożliwa.
   4. Wytnij szkiełka o grubości 8-10 μm do analizy.
4. Wytwarzanie bloków tkankowych zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE)
   1. Umieść 2 kawałki utrwalonej skóry w oznakowanej kasecie i odwodnij w rosnących stężeniach etanolu (75% etanolu przez 30 min, 85% przez 30 min, 90% przez 30 min, 95% przez 30 min, 100% przez 2x 30 min, ksylen lub substytut ksylenu przez 2x 30 min). Inkubować z parafiną w temperaturze 58-60°C, najpierw przez 30 minut, a następnie przez noc.
   2. Zanurzyć tkankę w formie do tkanek ze stali nierdzewnej o wymiarach 24 x 24^mm2 z ciekłą parafiną i zestalić w temperaturze -5 °C. Orientacja tkanki powinna być podobna do orientacji zamrożonych bloków tkankowych, aby można było uwidocznić podłużne odcinki w poprzek wielu mieszków włosowych (ryc. 1).
   3. Gdy parafina zastygnie, usuń formę i pokrój ją na odcinki 5-10 μm do analizy.

Wyniki

Rysunek 1: Izolacja tkanki skórnej i krioosadzanie. Po eutanazji należy ogolić obszar skóry grzbietowej myszy będący przedmiotem zainteresowania i zatopić skórę w kriomold zawierającym OCT. Przerywana linia na myszy reprezentuje linię środkową. Zazwyczaj 3 lub 4 kawałki skóry można odizolować za pomocą odcinka linii 3-4 wzdłuż linii środkowej; Jeden taki kawałek jest oznaczony prostokątem 1/2/3/4. T...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Maszynka do strzyżenia włosów zwierząt	Wahl	Numer katalogowy: 09990-502
Krem do depilacji	Nair	N/a	Dostępne w większości drogerii
Waciki bawełniane	rozmaity
Żarówka ultrafioletowa	Promieniowanie UVP	95-0042-08	model XX-15M lampa UV średniej klasy
200-procentowy etanol	rozmaity		czysty etanol
Histoplast PE	Fisher Naukowy	22900700	granulki parafiny
Neutralna buforowana formalina, 10%	Sigma	HT501128-4L
Związek O.C.T.	Thermo	23730571
Kaseta na chusteczki higieniczne	Sakura Sakura	Numer katalogowy: 89199-430	do przetwarzania FFPE
Krioformy	Sakura Sakura	Numer katalogowy: 4557	Wymiary: 25 x 20 mm
Metalowa forma FFPE	Księga Leica	3803082	24 mm x 24 mm
Izofluran	rozmaity		Klasa weterynaryjna
System inhalacyjny do znieczulenia	rozmaity		Klasa weterynaryjna
Cienkie nożyczki	Certyfikat FST	Numer katalogowy 14085-09	Proste, ostre/ostre
Cienkie nożyczki	Certyfikat FST	Numer katalogowy 14558-09	Proste, ostre/ostre
Kleszcz	Certyfikat FST	Numer katalogowy: 11252-00	Dumont #5
Kleszcz	Certyfikat FST	Numer katalogowy: 11018-12	Mikro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten f/f	Laboratoria Jacksona	Numer katalogowy: 13590
LSL-tdPomidor	Laboratoria Jacksona	Numer telefonu 7914	AI14

powiedział: