Modelowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta: technika generowania mysich modeli czerniaka

Streszczenie

Źródło: Min Xiao et al. Model ksenoprzeszczepu uzyskany od pacjenta z czerniakiem. J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie komórki czerniaka pochodzenia ludzkiego są wszczepiane podskórnie w obszar boczny myszy z obniżoną odpornością. Model PDX umożliwia przedkliniczne badanie komórek czerniaka, które lepiej oddaje niejednorodność guza i agresywność czerniaka obserwowane w warunkach in vivo.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przetwarzanie tkanki nowotworowej do implantacji myszy

1. Wycięcie chirurgiczne lub biopsja chirurgiczna przetwarzanie tkanek
   1. Przenieś tkankę na sterylną szalkę Petriego i oddziel tkankę nowotworową od otaczającej normalnej tkanki tak bardzo, jak to możliwe.
   2. Usuń tkankę martwiczą (zwykle identyfikowaną jako blado-biaława tkanka znajdująca się centralnie w guzie) z pozostałego guza w jak największym stopniu.
   3. Użyj skalpela, aby podzielić początkowy fragment guza na mniej więcej równe części (~3 mm x 3 mm) w celu chirurgicznej implantacji myszy (ryc. 1).
   4. Opcjonalnie, jeśli dostępna jest wystarczająca ilość tkanki nowotworowej, należy ją zamrozić w celu przeprowadzenia dalszych testów (sekwencjonowanie RNA [RNASeq], sekwencjonowanie całego eksomu [WES] itp.).
   5. Zrób zawiesinę guza, mieląc tkankę nowotworową za pomocą techniki krzyżowego ostrza z dwoma ostrzami skalpela. Zmiel kawałki guza tak drobno, jak to możliwe, aby utworzyć zawiesinę, która jest teraz gotowa do chirurgicznej implantacji myszy.
   6. Alternatywnie, jeśli tkanka nowotworowa jest zbyt twarda do mechanicznej dysocjacji, należy zastosować procedurę dysocjacji trawienia, aby utworzyć żelową zawiesinę i zawiesinę jednokomórkową do implantacji i / lub wstrzyknięcia.
      1. Zmiel kawałki guza tak drobno, jak to możliwe, aby utworzyć zawiesinę.
      2. Umieścić zawiesinę w probówce o pojemności 50 ml z zimnym zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS)^-/- (bez Ca⁺⁺ i Mg^++); następnie odwirować osad przy 220 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.
      3. Zawiesić zawiesinę w 10 ml podgrzanej świeżej pożywki fermentacyjnej (200 U/ml kolagenazy IV + 5 mM CaCl₂ + 50 U/ml DNazy w HBSS-^/-) na 1 g tkanki nowotworowej.
      4. Umieścić probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 20 minut i energicznie mieszać co 5 minut za pomocą jednorazowej pipety.
      5. Przemyć do 50 ml HBSS-^/-, a następnie odwirować przy 220 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.
      6. Dodać 5 ml podgrzanego TEG (0,025% trypsyny + 40 μg/ml glikolu etylenowego-bis(β-aminoetylowego eter)-N,N,N',N'--tetraoctowego [EGTA] + 10 μg/ml alkoholu poliwinylowego [PVA]) na 1 g tkanki nowotworowej, delikatnie zawiesić/wstrząsnąć i umieścić probówkę w temperaturze 37 °C na 2 minuty bez mieszania.
      7. Dodać co najmniej 1 równą objętość zimnego podłoża barwiącego (1% albuminy surowicy bydlęcej [BSA] + 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego [HEPES] + 1x penicylina-streptomycyna w pożywce L15) w celu wygaszenia trypsyny i odwirować przy 220 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.
      8. Ponownie zawiesić próbkę w 10 ml pożywki barwiącej na 1 g tkanki nowotworowej i przefiltrować ją przez sitko do komórek 40 μm, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową do wstrzyknięcia myszy (ryc. 1).
      9. Gnojowica pozostała na wierzchu sitka komórkowego może być również zbierana w celu chirurgicznej implantacji myszy.
2. Implantacja i wstrzyknięcie guza u myszy
   1. Implantacja chirurgicznego wycięcia lub biopsji chirurgicznej Tissue
      nuta: Upewnij się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne są sterylne przez autoklawowanie lub użycie wstępnie wysterylizowanych narzędzi jednorazowych.
      1. Ogol włosy z dolnej części pleców 6-8 tygodniowych samców lub samic myszy NSG, pozostawiając obszar o wymiarach około 1,5 cm x 3 cm bez włosów. Znieczulenie myszy za pomocą izofluranu i potwierdź, delikatnie ściskając stopę w ramach testu reakcji. Użyj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
      2. Umieść pojedyncze myszy na poduszce grzewczej w stożku nosowym aparatu do znieczulenia, wyszoruj ogolony obszar chlorheksydyną. Następnie zalej 70% etanolem i pozwól mu odparować.
      3. Przygotuj kawałki lub podziel zawiesinę guza na szalce Petriego na pojedyncze kopce do implantacji chirurgicznej (tj. na trzy równe kopce, jeśli mają być wszczepione 3 myszy).
      4. Za pomocą ostrza skalpela wykonaj nacięcie o długości około 5 mm na środku grzbietu myszy, weź jedną parę kleszczy i podnieś skórę po stronie nacięcia po przeciwnej stronie operatora.
      5. Weź nożyczki do drugiej ręki i oddziel skórę od warstwy mięśniowej, delikatnie przecinając błonę powięziową małymi nacięciami nożycowymi, tworząc w ten sposób "kieszeń" na tkankę nowotworową.
      6. Podnieś jeden fragment guza lub pojedynczy kopiec tkanki zawiesiny guza za pomocą ostrza skalpela i delikatnie umieść tkankę w utworzonej kieszeni.
      7. Podaj 100 μl sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej na wzgórek tkanki nowotworowej w kieszeni.
      8. Za pomocą dwóch par kleszczy pociągnij nacięcie na obu końcach, tak aby krawędzie rany zbliżyły się do siebie, i zamknij ranę, zakładając jeden lub dwa klipsy do rany.
      9. Podskórnie wstrzyknąć 1-5 mg/kg meloksykamu jako środek przeciwbólowy u myszy po zabiegu chirurgicznym.
      10. Wyjmij mysz ze stożka nosowego i umieść ją z powrotem w jej pierwotnej klatce; obserwuj mysz podczas budzenia. Nie wracaj do klatki, dopóki w pełni nie wyzdrowiejesz.
      11. Usuń klipsy do ran po około 7 dniach. Jeśli gojenie nie jest pełne po 7 dniach, pozostaw klips do rany na dodatkowy jeden lub dwa dni.
          nuta: W przypadku użycia zawiesiny pojedynczej komórki z chirurgicznego wycięcia lub przetwarzania tkanek z biopsji chirurgicznej, zmiesza się ona ze sztuczną macierzą zewnątrzkomórkową (w stosunku 1:1) do wstrzyknięcia myszom.
   2. Wstrzyknięcie FNA lub tkanki biopsji grubioigłowej
      1. Umieść mysz NSG na stojaku ze stalową siatką, chwyć ją mocno za ogon i delikatnie pociągnij mysz do tyłu. Mocno chwyci siatkę przednimi nogami. Alternatywnie, unieruchamiaj mysz w ręce niedominującej i pozwól, aby obszar boczny był widoczny
      .
      2. Zdezynfekuj skórę boku wacikami nasączonymi alkoholem. Powoli i równomiernie wstrzykiwać zawartość strzykawki pod skórę myszy.
      3. Wyciągnij igłę i umieść mysz z powrotem w klatce.
3. Monitoruj wzrost guza
   1. Monitoruj myszy raz w tygodniu, aby sprawdzić, czy nie ma wyczuwalnych guzów.
   2. Gdy guzy osiągną mierzalny rozmiar (około 50 mm³), użyj suwmiarki, aby zarejestrować wymiary guza. Użyj następującego wzoru, aby obliczyć objętość guza: (szerokość x szerokość x długość) / 2.
   3. Zbierz guz, gdy objętość guza osiągnie około 1,5 cm³ (około 4-10 tygodni). Guz nazywa się teraz pasażem myszy 1 (MP1).

Wyniki

Rycina 1: Alternatywne metody implantacji.(A) Guzy mogą być przetwarzane na kawałki, zawiesinę zawiesiny zawiesiny lub jako zawiesinę jednokomórkową. (B) Wszystkie trzy metody pozwolą na wzrost nowotworów in vivo. Pokazane tutaj są myszy z podskórnie wszczepionym guzem i zobrazowane 12 dni po implantacji. (C) Pokazano krzywe wzrostu guza dla myszy, ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 M Hepes	KORPORACJA SIGMA-ALDRICH	Nr kat. # H0887-100ML
100x PenStrep	Invitrogen	Kot # 15140163
1x HBSS-/- (bez Ca++ lub Mg++)	Med	Nr kat. # MT21-023-CV
2,5% trypsyna	KORPORACJA SIGMA-ALDRICH	Nr kat. # T4549-100ML	10 ml podwielokrotności przechowywanych w temperaturze –20oC
Bsa	KORPORACJA SIGMA-ALDRICH	Nr kat. # A9418-500G
Chlorheksydyny	Fisher Naukowy	Kot# 50-118-0313
Kolagenaza IV (2,000 u/mL)	Worthington	Nr kat. #4189	uzupełnić w HBSS-/- z wywaru w proszku Collagenazy IV (Worthington #4189, u/mg wskazane na butelce i różni się w zależności od partii); zamrozić 1
Dmso	KORPORACJA SIGMA-ALDRICH	Nr kat. # C6295-50ML
Strefa DNaza	KORPORACJA SIGMA-ALDRICH	Nr kat. # D4527
EGTA (kwas bis(2-aminoetylowy) glikolu etylenowego (eter 2-aminoetylowy)-N,N,N'-tetraoctowy)	Merck	Nr kat. # 324626.25
FBS (Sieć Usługowa	TECHNOLOGIE INVITROGEN LIFE	Kot # 16000-044
Strefa grzybów	TECHNOLOGIE INVITROGEN LIFE	Nr kat. # 15290-018
Gentamycyna	FISHER NAUKOWY	Kot # BW17518Z
Izofluran	HENRY SCHEIN ZDROWIE ZWIERZĄT	Kot # 050031
Podłoża L15 firmy Leibovitz	Invitrogen	Kot # 21083027
Matrigel	Corning	Nr kat. # 354230	Sztuczna macierz zewnątrzkomórkowa
Meloksykam	HENRY SCHEIN ZDROWIE ZWIERZĄTRekwiazent # ::Henry Schein	Kot # 025115	1-5 mg / kg, jako środek przeciwbólowy
Myszy z zerowym receptorem NOD/SCID/IL2 (NSG)	Instytut Wistar, zakład dla zwierząt		hodowla
PVA (alkohol poliwinylowy)	KORPORACJA SIGMA-ALDRICH	Nr kat. # P8136-250G
RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X z L-Glutaminą	Fisher Naukowy	Kot# MT10041CM
skalpel	pióro	Kot # 2976-22
Klipsy do ran	MikRon	Kot #427631