Metoda wiszącej kropli: technika generowania sferoid czerniaka 3D

Streszczenie

Źródło: Müller, I. et al., A 3D Organotypowy Czerniak Spheroid Model. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film opisuje technikę generowania trójwymiarowych sferoid metodą wiszącej kropli przy użyciu komórek czerniaka. Wygenerowany in vitro trójwymiarowy (3D) organotypowy model sferoidalny czerniaka może zobrazować architekturę czerniaka złośliwego in vivo i może dać wgląd w interakcje wewnątrz guza.

Protokół

1. Generowanie sferoid czerniaka 3D metodą wiszącej kropli

1. Hodowla komórek czerniaka (np. 451-LU lub dowolnej linii komórkowej czerniaka) zgodnie z ogólnymi protokołami, przy użyciu RPMI zawierającego 10% FCS.
   1. Aby wytworzyć sferoidy czerniaka o podobnej wielkości i jakości, umyj komórki czerniaka w PBS, dodaj 5 ml 1x Trypsyna-EDTA w PBS do komórek w kolbie do hodowli komórek T175 i inkubuj przez 3 - 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Zneutralizuj trypsynę, dodając 5 ml RPMI/10% FCS. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 200 x g przez 5 minut. Zawiesić osad komórkowy w RPMI/FCS przy końcowym stężeniu 10 000 komórek/ml, określonym przez zliczenie w hemocytometrze.
2. Za pomocą elektronicznej pipety wielofunkcyjnej umieścić 40 x 25 μl (= 250 komórek) zawiesiny komórkowej na wewnętrznej powierzchni pokrywy sterylnego, nieprzywierającego naczynia do hodowli komórkowych (Ø 10 cm). Szybkim, ale płynnym ruchem odwróć pokrywkę i umieść ją na odpowiednim naczyniu do hodowli komórkowych zawierającym 5 ml PBS.
   1. Hodowla "wiszących naczyń kroplowych" w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 10-14 dni, w zależności od użytego typu komórki.
      nuta: Komórki z przerzutowej fazy wzrostu czerniaka zazwyczaj rosną szybciej i tworzą bardziej stałe sferoidy w wiszącej kropli w porównaniu z komórkami czerniaka pochodzącymi z promieniowej fazy wzrostu lub pionowej fazy wzrostu. W celu indywidualnej oceny obserwuj wzrost sferoidy pod lornetką lub pod mikroskopem świetlnym (powiększenie 4x). Zazwyczaj sferoidy stają się wykrywalne po 48 godzinach pod lornetką lub pod mikroskopem świetlnym (powiększenie 4x). Po 10-14 dniach są widoczne bez żadnego urządzenia powiększającego.
3. Pięć dni po pierwszym zauważeniu kropli dodaj 10 μl świeżej pożywki RPMI/10% FCS do każdej kropli. Następnie wymieniaj 10 μl pożywki co drugi dzień. Bardzo pomocne w tym kroku jest korzystanie z elektronicznego dozownika.
4. W zależności od rodzaju komórki zbierz sferoidy po 10-15 dniach. Ostrożnie spłucz sferoidy z pokrywki wiszącego naczynia do hodowli komórek kroplowych za pomocą PBS. Zbierz 10-20 sferoid w sterylnym, nieprzywierającym naczyniu do hodowli komórkowych. Ostrożnie usunąć nadmiar PBS za pomocą pipety Pasteura.
   nuta: Okres hodowli zależy od fazy wzrostu guza komórek czerniaka, kiedy zostały one pierwotnie uzyskane, np. sferoidy pochodzące z komórek 451-LU osiągają średnicę około 500 μm w ciągu 12 dni od wyhodowania w wiszącej kropli.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
albumina surowicy płodu (FCS)	Thermo Fisher Naukowy	10270106	Dodać 10 % do pożywki do hodowli komórkowej
Trypsyna-EDTA	Thermo Fisher Naukowy	25300054	1X rozcieńczony w PBS
Prędkość obrotowa	Thermo Fisher Naukowy	61870010	Do hodowli linii komórkowych czerniaka