Generowanie organotypowych rekonstrukcji całej skóry: procedura tworzenia modelu 3D skóry na podstawie próbek ludzkiej skóry

Streszczenie

Źródło: Müller, I. et al. 3D organotypowy sferoidalny model skóry czerniaka. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film opisuje szczegółowy protokół generowania organotypowych rekonstrukcji skóry in vitro 3D w celu zbadania progresji czerniaka. Ten model skóry naśladuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządów in vivo.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Izolacja pierwotnych keratynocytów od naskórka

1. Umyj tkankę naskórka PBS. Pokrój naskórek na mniejsze kawałki (1^mm2) i zbierz je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 10 ml 1x Trypsin-EDTA (podgrzanej do 37 °C) i inkubować przez 5 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Mieszać zawiesinę tkankową co 2 minuty.
2. Zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając 1 ml płodo....

Wyniki

Rycina 1: Hodowla organotypowych rekonstrukcji 3D skóry zanurzonej w pożywce i na granicy faz powietrze-ciecz. W dniu 0 pierwotne keratynocyty są wysiewane na wierzchu przedziału skórnego składającego się z pierwotnych fibroblastów osadzonych w matrycy kolagenu typu I. Rekonstrukcje skóry 3D pozostają uprawiane zanurzone w EGM przez 7 dni, odrywają się od ścianki wkładu i zaczynają się kurczyć. W 8 .......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
albumina surowicy płodu (FCS)	Thermo Fisher Naukowy	10270106	Dodać 10 % do pożywki do hodowli komórkowych
Trypsyna-EDTA	Thermo Fisher Naukowy	25300054	1X rozcieńczony w PBS
DMEM (DMEM)	Thermo Fisher Naukowy	41965062	do hodowli fibroblastów pierwotnych
Rozpuść	Technologie życiowe Gibco	17105041	2U/ml, rozpuścić w PBS
Kolagen typu I	BD Nauki biologiczne	354249	zwykle z ogona szczura, stężenie powinno wynosić 3,5-4 mg / ml
Wkładki 24-dołkowe Nunclon	Nunc	140629	Wielkość porów 8 μm; używaj wkładek stojących, a nie wiszących
sitko komórkowe	BD Sokół	Numer telefonu 352360	żółty
Gentamycine (Dżentyle)	Thermo Fisher Naukowy	15750060	rozpuszczać się w PBS
Keralife keratincyte medium	Systemy komórkowe		nie należy dodawać FCS ani antybiotyków
Kolagenaza	SERVA	Numer katalogowy: 17454	Standardowa klasa NB4
młodociane keratynocyty ludzkie	Systemy komórkowe	FC-0007	alternatywa dla własnego preparatu z młodocianego napletka
młodociane ludzkie fibroblasty	Systemy komórkowe	FC-0001	alternatywa dla własnego preparatu z młodocianego napletka
EFG (EFG	Technologie życiowe Gibco	Nr kat. 13247-051	dodać 10 ng/ml tylko w celu wytworzenia pożywki NWZ
Chlorek wapnia	Chemikalia Merck	2381	dodać 1,9 mM dla generowania NWZ i 3,8 mM dla medium MM
Kwas selenowy	Alfa Aesar	Numer katalogowy: 18851	dodać 53 nM do generowania medium EGM i MM
insulina	Lilly	HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml	dodać 5 μg/ml w celu wytworzenia pożywki EGM i MM
Etanoloaminy	Sigma-Aldrich	E-0135 (E-0135	dodać 0,1 mM do generowania medium EGM i MM
P-etanoloamina	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P-0503	dodać 0,1 mM do generowania medium EGM i MM
Holotransferyna	Sigma-Aldrich	T-0665	dodać 5 μg/ml w celu wytworzenia pożywki EGM i MM
Trójjodotyroniny	Sigma-Aldrich	T-6397	dodać 20 pM dla wygenerowania medium NWZ i MM
Hydrokortyzon	Sigma-Aldrich	H-088816	dodać 0,4 μg/ml do wytworzenia pożywki EGM i MM
progesteron	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P-8783	dodać 10 nM tylko dla wytworzenia medium NWZ
Hepes	Sigma-Aldrich	H-3784	dodać 15 mM do generowania medium EGM i MM
seryna	Sigma-Aldrich	S-4311	dodać 1 mM dla generowania medium NWZ i MM
Chlorek choliny	Sigma-Aldrich	C-7017	dodać 0,64 mM do generowania medium EGM i MM
dFCS powiedział:	Sigma-Aldrich	F-0392 Numer pojazdu 086K0361	dodać 2 % na generowanie NWZ i medium MM
adenina	Sigma-Aldrich	A-9795	dodać 0,18 mM do generowania medium EGM i MM
L-glutamina	Komórka promocyjna	Nr kat. C-42209	dodać 7,25 mM do generowania medium EGM i MM
Chlorek strontu	Sigma-Aldrich	255521	dodać 1 mM dla generowania medium NWZ i MM

powiedział: powiedział: ) szt. ) powiedział: (wersja angielska)