Generowanie organotypowych rekonstrukcji całej skóry: procedura tworzenia modelu 3D skóry na podstawie próbek ludzkiej skóry

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Izolacja pierwotnych keratynocytów od naskórka

1. Umyj tkankę naskórka PBS. Pokrój naskórek na mniejsze kawałki (1^mm2) i zbierz je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 10 ml 1x Trypsin-EDTA (podgrzanej do 37 °C) i inkubować przez 5 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Mieszać zawiesinę tkankową co 2 minuty.
2. Zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając 1 ml płodowej surowicy cielęcej (FCS). Ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół plastikową pipetą o pojemności 10 ml przez 4 minuty. Staraj się unikać bąbelków i tworzenia się piany.
3. Odpipetować zawiesinę komórek do sitka komórkowego (wielkość porów 100 μm), umieszczonego na wierzchu świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przepłukać 3x 5 ml PBS. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut. Zawiesić osad komórkowy w 2-6 ml pożywki hodowlanej zawierającej 1% (v/v) gentamycyny. Określ liczbę komórek ręcznie, zliczając komórki w hemocytometrze i zasiewając 6 x 10⁵ komórek do kolby do hodowli komórkowych T75.

2. Izolacja pierwotnych fibroblastów od skóry właściwej

1. Pokrój tkankę skórną na mniejsze kawałki (1^mm2) i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 10 ml roztworu kolagenazy (5 j./ml w PBS⁺) i inkubować przez 45 minut w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Odwirować mieszaninę fragmentów tkanek i komórek w temperaturze 200 x g przez 5 min.
2. Przemyj osad komórkowy dwukrotnie 10 ml DMEM zawierającym 4,5 g/l glukozy i L-glutaminy, ale bez L-pirogronianu. Na koniec ponownie zawiesić fragmenty tkanki w 2 ml DMEM zawierającym 1% (v/v) gentamycyny i 10% FCS. Przenieść je do kolby do hodowli komórkowej T25 i inkubować w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 przez} noc.
   UWAGA: Mała objętość pozwala fibroblastom na migrację z resztek tkanki i zmusza je do przyłączenia się do kolby hodowlanej.
3. Następnego ranka dodaj kolejne 6 ml DMEM/Gentamycyny/FCS i inkubuj przez 2-3 dni w temperaturze 37 °C, aż komórki osiągną 80-90% zlewności.

3. Generowanie komory skórnej organotypowych rekonstrukcji całej skóry

1. Generuj modele skóry za pomocą 24-dołkowych wkładek mikroporowatej błony komórkowej (wielkość porów 8 μm) umieszczonych w 24-dołkowych płytkach.
   nuta: Upewnij się, że nie używasz wkładów wiszących, ale stojących, ponieważ zostaną one umieszczone w 6-dołkowej płytce do uprawy powietrzno-płynnej na późniejszym etapie.
2. Przygotuj roztwór neutralizujący żel (GNL), a także pożywki hodowlane określane jako MM i pożywki wzrostowe śródbłonka (EGM). Aby zapobiec krzepnięciu, przechowuj kolagen typu I (zwykle z ogona szczura, 3,5-4 mg/ml w 0,02 N kwasu octowego) na lodzie do czasu użycia, ponieważ zaczyna żelować w temperaturze pokojowej.
3. Ponownie zawiesić 1 x 10⁵ fibroblastów na wkładkę w GNL i szybko wymieszać zawiesinę komórkową z kolagenem w stosunku 1:3 w końcowej objętości 500 μl / wkładkę. Mieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków, ponieważ pęcherzyki mogą pogorszyć jakość rekonstrukcji skóry.
4. Pozwól, aby poszczególne żele skórne osiadły, trzymając je bez podłoża w temperaturze pokojowej przez 30 minut w sterylnym kapturze. Następnie przykryj każdy żel DMEM zawierającym 4,5 g/l glukozy, 1% L-glutaminy, 10% FCS i bez L-pirogronianu i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C.

4. Wytwarzanie przedziału naskórkowego organotypowych pełnych rekonstrukcji skóry

1. Następnego dnia usunąć podłoże z żeli skórnych i zrównoważyć je z pożywką EGM (10% FCS, 1% PenStrep, 10 mg/ml gentamycyny) przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Pobrać pożywkę i ostrożnie wysiać 1 x 10⁵ keratynocytów zawieszonych w 100 μl EGM na wierzchu żelu skórnego.
2. Inkubować rekonstrukcje przez 1,5 godziny w temperaturze 37 °C, aby keratynocyty mogły przylegać do komory skórnej.
   nuta: W tym czasie inkubacji żele zaczną się kurczyć z powodu skurczu wywołanego przez fibroblasty, a tym samym przynajmniej częściowo oderwać się od ścianek wkładki.
3. Przykryj odpowiedniki skóry około 800 μl EGM i ostrożnie usuń resztki żelu ze ścianki wkładki za pomocą małej (białej) końcówki pipety. Hodować odpowiedniki skóry zanurzone w EGM przez 7 dni w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ i zmieniać pożywkę co drugi dzień.
   nuta: W tym czasie odpowiedniki skóry znacznie się skurczą.

5. Powietrzno-płynna uprawa organotypowych rekonstrukcji całej skóry

1. W 8 dniu przenieś każdą wkładkę do indywidualnego dołka na 6-dołkowej płytce. Do każdej studzienki należy dodać tylko 1,2-1,4 ml pożywki MM, tak aby rekonstrukcja skóry była zaopatrywana w podłoże z dna studzienki, ale nie była pokryta pożywką.
   nuta: Uprawa na granicy faz powietrze-ciecz pozwala na rozwarstwienie części naskórka i utworzenie pełnej warstwy rogowej naskórka (stratum corneum).
2. W ciągu następnych 10-17 dni należy zmieniać podłoże zgodnie z punktem 5.1 co drugi dzień. W tym okresie dodaj do pożywki leki lub inne bodźce w razie potrzeby. Ostrożnie usuń pełną rekonstrukcję skóry z wkładu mikroporowatej błony za pomocą zakrzywionej pęsety w celu dalszej analizy, np. analizy immunohistochemicznej (ryc. 1).

Rycina 1: Hodowla organotypowych rekonstrukcji 3D skóry zanurzonej w pożywce i na granicy faz powietrze-ciecz. W dniu 0 pierwotne keratynocyty są wysiewane na wierzchu przedziału skórnego składającego się z pierwotnych fibroblastów osadzonych w matrycy kolagenu typu I. Rekonstrukcje skóry 3D pozostają uprawiane zanurzone w EGM przez 7 dni, odrywają się od ścianki wkładu i zaczynają się kurczyć. W 8 dniu wkładki są przenoszone do 6 dołków i hodowane na granicy faz powietrze-ciecz, aby umożliwić stratyfikację naskórka.