$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie komórek B16-BL6
- Wyjmij płytki do hodowli komórkowych z inkubatora pod kątem 37 stopni i umieść je w sterylnym kapturze. Płytki powinny być w około 70% zlewane z komórkami czerniaka myszy B16-BL6. Większa konfluencja może zmienić potencjał przerzutowy komórek.
- Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA na płytkę, pozostaw na 1 minutę, a następnie odessaj roztwór pożywki trypsynowej.
- Dodać 1 ml trypsyny na płytkę i włożyć płytki z powrotem do inkubatora na 10 minut.
- Po przeniesieniu płytek z inkubatora do sterylnego kaptura, dodaj 4 ml bezsurowicy pożywki Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) do każdej płytki.
- Zbierz komórki za pomocą sterylnej, zmotoryzowanej pipety. Wysuń komórki na spód płytki, z końcówką dociśniętą pod bardzo niewielkim kątem, aby rozbić komórki. Powtórz kilka razy, aby zapewnić odpowiednią separację grudek komórek, które w przeciwnym razie mogłyby zatkać igłę wyrzutową. Zebrać i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
- Użyj hemocytometru, aby określić gęstość komórek. Utrzymując stałą całkowitą liczbę komórek B16-BL6, określ objętość RPMI bez surowicy potrzebną do osiągnięcia końcowych stężeń 0, 0,065, 0,015, 0,25 i 0,5 miliona komórek/ml.
- Równo podzielić pożywkę w probówce o pojemności 50 ml na probówki stożkowe o pojemności 15 ml. Odwirować stożkowe probówki o masie 2 250 x g przez 5 minut. Zdekantować media. Dodaj odpowiednią objętość RPMI bez surowicy i potwierdź pożądaną gęstość komórek za pomocą hemocytometru. Dostosuj gęstość, dodając dodatkowe prędkości obrotowe lub odpowiednio obracając i ponownie zawieszając w mniejszej objętości.
- Podać 500 μl zawiesiny każdej komórki do oznakowanych probówek o pojemności 1,8 ml na lodzie.
2. Iniekcja żyły ogonowej
- Kup samice myszy C57BL/6 (w wieku 6-8 tygodni), 5 myszy na grupę. Odczekaj kilka dni, aż myszy się przystosują.
- Weź mysz trzymaną za ogon i poprowadź ją tyłem do przodu do ogranicznika myszy. Trzymając tułów w głównej komorze ogranicznika i ogon na zewnątrz, pociągnij mysz w kierunku końca ogranicznika. Włóż tłok ograniczający, kontynuując naciskanie, aż mysz zostanie zabezpieczona.
- Obróć mysz o 90 stopni tak, aby jedna z bocznych żył ogonowych była skierowana do góry. Za pomocą wacika nasączonego alkoholem energicznie wyczyść bok ogona myszy, szczególnie w miejscu, gdzie żyła ogonowa jest najbardziej widoczna.
nuta: Dobre oświetlenie jest niezbędne do skutecznej wizualizacji żył ogonowych na myszach B57BL/6J. Lampy grzewcze lub podgrzewane podkładki chirurgiczne, choć nie są konieczne, pomogą również zwiększyć objętość żyły ogonowej.
- W sterylnym kapturze hodowlanym zebrać 300 μl pożywki do hodowli komórkowych z probówki o pojemności 2 milionów komórek/ml. Odwrócić igłę, przesuwając bok i naciskając tłok, aby usunąć pęcherzyki ze strzykawki. Wysunąć kulturę-RPMI, aby uzyskać końcową objętość 250 μl.
- Przedłuż ogonek myszy ręką niedominującą. Trzymaj ogon z bliższym końcem ogona uniesionym palcem wskazującym ręki niedominującej, a dystalną częścią ogona wciśniętą kciukiem.
nuta: W ten sposób żyła ogonowa jest utrzymywana w pozycji bocznej, równolegle do powierzchni ograniczającej, z możliwością przystającego wejścia w bardziej dystalną część ogona.
- Wprowadzić igłę do żyły ogonowej, w kierunku dystalnego końca, pod minimalnym kątem w dół, a następnie wyregulować igłę tak, aby dopasować ją do kąta żyły ogonowej po dalszym wprowadzaniu (obniżając koniec tłoka strzykawki względem igły).
- Wbić igłę na około 1 cm do żyły ogonowej. Po włożeniu należy rozpocząć wciskanie tłoka, trzymając igłę stabilnie.
nuta: Jeśli igła znajduje się w żyle ogonowej, a koniec igły nie jest zatkany, podłoże powinno bez przeszkód przepływać do żyły. Skuteczne wstrzyknięcie charakteryzuje się usunięciem krwi z żyły. Jeśli występuje opór lub w miejscu wstrzyknięcia zaczyna tworzyć się pęcherzyk, wyjmij igłę i spróbuj ponownie w bardziej proksymalnym miejscu wzdłuż żyły ogonowej.
- Wyjąć igłę z żyły i wyrzucić ją. Przyłóż gazę do miejsca wprowadzenia, aby zatamować krwawienie.
- Wyjąć tłok z ogranicznika i umieścić mysz w klatce odbiorcy.
- Powtórz dla wszystkich pozostałych stężeń.
nuta: Tworzenie ognisk w płucach trwa około 2-3 tygodni, przy czym zmienność zależy od linii komórkowej i pożądanej wielkości ognisk. W międzyczasie myszy powinny być monitorowane pod kątem objawów, które mogłyby uzasadniać wczesną eutanazję, takich jak nadmierne dyszenie.
3. Liczenie ognisk płucnych
- Poddaj mysz eutanazji, umieszczając ją w komorze CO2 i wystawiając ją na działanie 100% CO2 wprowadzanego w tempie 10-30% objętości komory na minutę przez 5 minut. Następnie nastąpi zwichnięcie szyjki macicy.
- Rozłóż mysz na styropianie. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj chirurgiczne nacięcie wzdłuż mostka.
- Wykonaj dwa dodatkowe nacięcia, zarówno od góry nacięcia mostka, jak i rozgałęziając się w kierunku ramion myszy, odsłaniając klatkę piersiową.
- Wykonaj dwa cięcia, każde wzdłuż bocznych boków mostka, aby usunąć klatkę piersiową z tułowia, odsłaniając płuca i serce.
- Trzymając serce pęsetą chirurgiczną, przetnij przełyk i tchawicę, uwalniając serce i płuca od myszy. Umieść pod mikroskopem preparacyjnym przy 10-krotnym powiększeniu, aby uzyskać lepszą wizualizację.
- Wypreparuj serce z płuc i usuń grasicę, pozostawiając tylko dwa płuca.
- Mając płuca pod lunetą sekcyjną, zacznij liczyć ogniska płuc. Każde ognisko powinno pojawić się jako okrągły, brązowy wytrutek na powierzchni płuc.
- Aby uzyskać spójność między myszami, policz liczbę ognisk na powierzchni płata, a następnie odwróć ten płat. Wykonanie każdego z czterech płatów osobno pozwala na łatwiejsze liczenie.
- Zachowaj i napraw płuca podczas wykonywania IHC, w przeciwnym razie wyrzuć resztki.