HCR-DNA FISH: Technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania wirusowego DNA w zakażonych komórkach

Streszczenie

Źródło: Wei Liu et al., Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection, J. Vis. Exp. (2019).

W tym filmie, komórki zainfekowane wirionami MCPyV zostały poddane reakcji łańcuchowej hybrydyzacji in situ w celu wykrycia specyficznych genomów MCPyV. Co więcej, technikę DNA-HCR połączono z FISH w celu wizualizacji DNA MCPyV w zakażonych ludzkich komórkach skóry.

Protokół

1. Infekcja

1. Utrzymuj pierwotne ludzkie fibroblasty skóry w DMEM za pomocą 10% płodowej surowicy cielęcej, 1% aminokwasów endogennych i 1% L-glutaminy. Po osiągnięciu konfluencji rozłup fibroblasty 1:4 bez wirowania w dół.
   nuta: Aby uzyskać najwyższą skuteczność infekcji MCPyV, należy użyć pierwotnych fibroblastów między pasażami 5 i 12, które aktywnie dzielą się w czasie posiewu.
2. Aby zainfekować ludzkie fibroblasty skóry, odessać pożywkę i przemyć komórki DPBS.
3. Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA do naczynia i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.
4. Sprawdź pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki schodzą z naczynia.
5. Dodać 10 ml pożywki DMEM/F12 zawierającej 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bFGF i 3 μM CHIR99021, z których wszystkie stymulują infekcję MCPyV, do naczynia i przenieść roztwór komórkowy do probówki o pojemności 15 ml.
6. Wirować komórki w temperaturze 180 x g przez 2 minuty i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w pożywce DMEM/F12 zawierającej 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bFGF i 3μM CHIR99021 przy 2-4 x 10⁴ komórkach na ml.
7. Wysiewać 200 μl zawiesiny komórkowej uzupełnionej 1 mg/ml kolagenazy typu IV do każdego dołka 96-dołkowej płytki. Rozmrozić wirion MCPyV na lodzie. Dodać 10⁹ odpowiedników genomu wirusa wirionów MCPyV na 1 μl jodiksanolu na każde 2 500 do 5 000 komórek, które mają zostać zakażone. Delikatnie postukaj w bok płytki i umieść płytkę w inkubatorze.
8. Po inkubacji w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez 48-72 h dodać 20% FBS do każdej studzienki.
9. Pozostawić infekcję do postępu w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez 72-96 godzin.

2. DNA in situ HCR

1. Utrwalić komórki hodowane na szkiełkach nakrywkowych za pomocą 4% PFA w PBS przez 10 minut. Umyj szkiełka nakrywkowe dwukrotnie PBS, a następnie potraktuj je 70% etanolem, aby przepuszczalność komórek w temperaturze 4 °C przez noc.
   nuta: Utrwalone próbki mogą pozostawać w tym stanie przez kilka dni.
2. Wstępnie zhybrydyzować próbki, zastępując etanol buforem do hybrydyzacji sondy i inkubując przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
3. Rozcieńczyć sondę(-y) (1 μM) (tabela 1) w roztworze buforowym do hybrydyzacji sondy w rozcieńczeniu 1:500 na 30 minut przed zakończeniem etapu wstępnej hybrydyzacji i inkubować w temperaturze 45 °C.
4. Pod koniec inkubacji odpipetować ~10 μl rozcieńczonej mieszanki sondy na szkiełko nakrywkowe na szkiełko mikroskopowe. Umieść szkiełka nakrywkowe, komórką do dołu, na odpowiednich kropelkach mieszanki sondy do hybrydyzacji. Uszczelnij krawędzie i grzbiety szkiełek nakrywkowych do szkiełek za pomocą dużej ilości cementu gumowego.
5. Podgrzewać szkiełka z dodanymi sondami w temperaturze 94 °C przez 3 minuty, ustawiając szkiełka na płaskiej stronie bloku grzewczego. Przenieść szkiełka do wilgotnej komory i inkubować w temperaturze 45 °C przez noc. Aby zrobić prostą nawilżoną komorę, lekko zwilż sterylne ręczniki papierowe o dH₂O i umieść je na dnie plastikowego pojemnika, który jest uszczelniony gumową uszczelką.
   nuta: Podczas ogrzewania cement kauczukowy może krótko bulgotać. Upewnij się jednak, że plomba nie pęknie.
6. Ostrożnie oderwij cement gumowy za pomocą kleszczy i umieść szkiełka nakrywkowe komórką do góry z powrotem w dołkach 24-dołkowej płytki. Umyj szkiełka nakrywkowe buforem do przemywania sondy w temperaturze RT trzy razy.
7. Inkubować szkiełko nakrywkowe w buforze amplifikacyjnym (200 μl w płytkach 24-dołkowych) w temperaturze pokojowej przez 30-60 minut.
8. W międzyczasie wyżarzaj każdą z dwóch oznaczonych oligonukleotydowych spinek do włosów, rozpoznając sondy (Tabela 1) w oddzielnych probówkach PCR, podgrzewając do 94 °C przez 90 s i schładzając do RT przez 30 minut, chroniąc przed światłem. Wymieszać dwie spinki do włosów w buforze do amplifikacji, każda w rozcieńczeniu 1:50.
9. Przygotować powierzchnię do reakcji amplifikacji, rozciągając film parafinowy na otwartej powierzchni pokrywy 24-dołkowej płytki. Odpipetować 50-100 μl kropelek mieszaniny spinki do włosów/buforu wzmacniającego na folię parafinową dla każdego szkiełka nakrywkowego. Użyj kleszczyków, aby ostrożnie usunąć szkiełka nakrywkowe z roztworu do wstępnego amplifikacji. Wysuszyć szkiełko nakrywkowe, dotykając krawędzi porowatą jednorazową chusteczką i położyć komórką do dołu na kropli amplifikacji.
10. Umieść pokrywkę płytki przytrzymującą szkiełka nakrywkowe w wilgotnej komorze i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności.
11. Ponownie umieść szkiełka nakrywkowe w studzienkach. Próbki należy inkubować z 5x SSCT [5x chlorek sodu cytrynian sodu (SSC) 0,1% Tween 20 przefiltrowany przez filtr 0,22 μm] zawierający 0,5 μg/ml DAPI przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć próbki dwukrotnie za pomocą 5x SSCT w RT.
12. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych. Przeanalizuj komórki i zobrazuj próbki za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.

Sonda MCPyV 1	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA tgagctacctcactaaggagtggtttttatactgcagtttcccgcccttg ATTTT CACATTTACACACCTCAACCTACTCACCACCACCCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 2	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggataggagccccaagcctctgccaacttgaaaa
Sonda MCPyV 3	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cattgactttcctggagaggagtttgactgataaacaaaaacttt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 4	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gatactgccttttttgctaattaagcctcttaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 5	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcttctcctgtaagaatagcttccaaagttactcctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 6	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaaaagcttgcacagagcc ATTTT CACATTTACACACCTCAACCTCAACCTCACCACCCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 7	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gctcaggggaggaaagtgattcatcgcagaagagatcctcccagggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 8	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcctgggacgctgagaaggcatacccagaggaagagctctggctggg ATTTT CACATTTACACACCTCAACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 9	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agcttcgggaccccccaaaattttcgctggaggggggg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda MCPyV 10	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtctctgcggctttggcaatggttttctgaga ATTTT CACATTTACACACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda HPV 1	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cagctgtgcataactgtggtaactttctgggtcgctcctgtgtt ATTTT CACATTTACACACCTCAACCTCCAACTCTCTCAC
Sonda HPV 2	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA acaatattgtaatgggctctgtccggttgctgcttgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda HPV 3	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtgtaagtccaaatgcagcaatacaccaatcgcaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda HPV 4	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgggggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC
Sonda HPV 5	CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ccatccattacatcccgtacccttccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC

Tabela 1: Sondy użyte w badaniu.

Materiały

Paraformaldehyd

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor hybrydyzacji sondy	Technologie molekularne
Bufor do mycia sondy	Technologie molekularne
Bufor wzmacniający	Technologie molekularne
spinki do włosów z etykietą Alexa 594	Technologie molekularne	B4	Chronić przed światłem
Sigma	P6148