HCR-DNA FISH: Technika fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ do wykrywania wirusowego DNA w zakażonych komórkach

Streszczenie

Źródło: Wei Liu et al., Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection, J. Vis. Exp. (2019).

W tym filmie, komórki zainfekowane wirionami MCPyV zostały poddane reakcji łańcuchowej hybrydyzacji in situ w celu wykrycia specyficznych genomów MCPyV. Co więcej, technikę DNA-HCR połączono z FISH w celu wizualizacji DNA MCPyV w zakażonych ludzkich komórkach skóry.

Protokół

1. Infekcja

1. Utrzymuj pierwotne ludzkie fibroblasty skóry w DMEM za pomocą 10% płodowej surowicy cielęcej, 1% aminokwasów endogennych i 1% L-glutaminy. Po osiągnięciu konfluencji rozłup fibroblasty 1:4 bez wirowania w dół.
   nuta: Aby uzyskać najwyższą skuteczność infekcji MCPyV, należy użyć pierwotnych fibroblastów między pasażami 5 i 12, które aktywnie dzielą się w czasie posiewu.
2. Aby zainfekować ludzkie fibroblasty skóry, odessać pożywkę i przemyć komórki DPBS.
3. Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA do naczynia i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.
4. Sprawdź pod mikroskopem, aby upewni....

Materiały

Paraformaldehyd

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor hybrydyzacji sondy	Technologie molekularne
Bufor do mycia sondy	Technologie molekularne
Bufor wzmacniający	Technologie molekularne
spinki do włosów z etykietą Alexa 594	Technologie molekularne	B4	Chronić przed światłem
Sigma	P6148