Izolacja keratynocytów ludzkiej skóry: metoda hodowli pierwotnych keratynocytów z próbek skóry

Streszczenie

Johansen, C. et al. Wytwarzanie i hodowla pierwotnych ludzkich keratynocytów ze skóry dorosłych. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film opisuje izolację keratynocytów - najważniejszych komórek warstwy naskórka ludzkiej skóry, poprzez zastosowanie kombinacji trawienia enzymatycznego i metod mechanicznego zakłócania. Ta metoda pomaga w preferencyjnym wzroście keratynocytów w porównaniu z innymi typami komórek skóry przy użyciu selektywnej pożywki wzrostowej.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Izolacja keratynocytów od ludzkiej skóry

1. Zacznij od przygotowania następujących roztworów: 50 ml roztworu 0,25% trypsyny i 0,1% glukozy w DPBS. Wymieszać i przefiltrować, wysterylizować (0,2 μm) roztwór. Przygotuj 10 ml RPMI-1640 + 2% roztworu FBS, 50 ml DPBS i pożywki bez keratynocytów (KSFM). Dodaj suplementy KSFM i 250 μl gentamycyny do 500 ml KSFM. Przed użyciem podgrzej roztwory do temperatury 37 °C.
2. Zbieraj skórę od zdrowych dorosłych ochotników poddawanych operacji plastycznej. Użyte próbki skóry mają wymiary około 10 cm x 15 cm, ale mogą różnić się wielkością. Utrzymuj skórę w chłodzie podczas transportu, transportując próbki skóry w styropianowym pudełku zawierającym element chłodzący. W razie potrzeby próbka skóry może być przechowywana przez noc w temperaturze 4 °C.
3. Usuń tłuszcz spod skóry za pomocą wysterylizowanych nożyczek, skalpeli i kleszczy.
4. Zapiąć część skóry (około 10 cm x 15 cm) na sterylnej osłonie na wierzchu płytki za pomocą igieł. Najpierw oczyść skórę suchym, wysterylizowanym gazikiem. Następnie oczyść skórę za pomocą wysterylizowanego gazika z 70% etanolem.
5. Za pomocą strugarki nożnej odetnij górną warstwę (naskórek) części skóry i umieść ją na szalce Petriego o średnicy 9 cm. Następnie natychmiast dodaj 25 ml roztworu DPBS/trypsyna/glukozy (przygotowanego w kroku 1.1) do szalki Petriego. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
6. Za pomocą pipety usuń roztwór DPBS/trypsyny/glukozy z szalki Petriego i dodaj 10 ml RPMI-1640 + 2% FBS, aby dezaktywować trypsynę.
7. Za pomocą dwóch kleszczy uwolnij teraz komórki naskórka do podłoża, delikatnie zeskrobując i mieszając zarówno naskórek, jak i przedział skórny części skóry.
8. Przefiltruj zawiesinę komórek naskórka przez metalowy filtr (otwór o średnicy 1 mm) i zbierz w probówce o pojemności 50 ml. Dodaj pozostałe skrawki skóry do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml RPMI-1640 bez FBS i wiruj przez 10 sekund. Przefiltrować zawiesinę przez metalowy filtr do probówki o pojemności 50 ml zawierającej zawiesinę komórek naskórka. Dodaj DPBS do całkowitej objętości 50 ml.
9. Odwirować zawiesinę komórkową przez 10 minut przy 450 x g w temperaturze pokojowej.
10. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek naskórka w około 10 ml KSFM o temperaturze 37 °C, w zależności od wielkości osadu komórkowego. Policz komórki za pomocą metody barwienia błękitem trypanowym pod mikroskopem. Liczba komórek uzyskanych z wycinka skóry o wymiarach 10 cm x 15 cm wynosi około 50-100 x 10⁶ komórek. Do każdej kolby hodowlanej^{o długości 75 cm2} przenieść 8 x 10⁶ komórek wraz z 12 ml KSFM o temperaturze 37 °C. Delikatnie wstrząsnąć kolbami hodowlanymi, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek.
11. Inkubować keratynocyty w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy wilgotności 100% i 5% CO_{2 .} Zmień podłoże po 2 dniach i trzy razy w tygodniu. Pasaż komórek, gdy hodowla jest w 70-80% zlewna, co trwa około 2 tygodni w zależności od szybkości proliferacji keratynocytów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
KSFM (Międzynarodowa Organizacja Zarządzania Kryzysowego	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 17005-034	Pożywka do hodowli komórkowych
Suplementy KSFM	ThermoFisher Naukowy	37000-015	Suplementy do KSFM
DPBS (Polskie Biuro Obsługi	ThermoFisher Naukowy	Nr kat. 14190-144	DPBS bez wapnia i Magnez
Dmso	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8418	Dimetylosulfotlenek
Gentamycyna	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 15710-049	Dodatek do pożywki do hodowli komórkowych
Filtr sterylizacyjny	Sartorius Sartorius (Wyspa	Numer katalogowy: 16534	Filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,2 μm
trypsyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T7409	Służy do trypsynizacji komórek
glukoza	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał G7528	-
Przekaźnik RPMI-1640	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 61870-010	-
FBS (Sieć Usługowa	ThermoFisher Naukowy	16000044	Służy do inaktywacji trypsyny
Kleszcze	-	-	Kleszcze każdej firmy mogą być używany
nożyczki	-	-	Nożyczki każdej firmy mogą być używany
skalpel	Swann Morton	Numer katalogowy: 0501	Skalpele każdej firmy mogą być używany
70% etanolu	-	-	-
Gaziki	NOBAMED (Szpital NOBAMED)	Numer katalogowy: 875420	Gaziki od dowolnego dostawcy mogą być używane
Strugarka nożna	Credo Solingen	1510	Strugarka nożna od dowolnego dostawcy może być używane
Szalki Petriego	TPP (TPP)	Numer katalogowy 93100	Szalki Petriego od dowolnego dostawcy mogą być używane
Filtr metalowy	-	-	Własny otwór o średnicy 1 mm metal filtr
75 cm2 kolby hodowlane	Nunc	156499	-
150 cm2 kolby hodowlane	Ttp	Numer katalogowy 90151	-
0,05% roztwór trypsyny-EDTA	ThermoFisher Naukowy	25300-062	Służy do trypsynizacji komórek, gdy Przejazd

Klienta Sar TGL szt.