Izolacja komórek macierzystych czerniaka: metoda uzyskiwania dodatnich i ujemnych komórek czerniaka CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie

Streszczenie

Źródło: Welte, Y. et al. Hodowla komórkowa pochodząca od pacjenta i izolacja komórek macierzystych CD133+ przypuszczalnych nowotworów z czerniaka. J. Vis. Exp. (2013)

Ten film opisuje technikę izolowania komórek macierzystych czerniaka CD133 ujemnych i dodatnich z pierwotnej linii komórkowej czerniaka za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie. CD133-dodatnie CSC czerniaka są dalej badane w celu zrozumienia mechanizmów nowotworzenia czerniaka.

Protokół

1. Magnetyczne sortowanie komórek czerniaka CD133⁺ i CD133^- za pomocą kolumn LS

1. Przygotuj bufor MACS zawierający 2 mM EDTA i 5% FCS w PBS. Wymieszać przez odwrócenie i sterylny bufor filtratu za pomocą jednostki filtrującej Steritop-GP 0,22 μm. Schłodzić bufor do temperatury 4-8 °C i odgazować przed użyciem.
2. Podgrzej pożywkę Accutase, PBS i Quantum 263 do 37 °C.
3. Umyj 80% zlewających się komórek za pomocą PBS. Dodać odpowiednią ilość Accutazy i inkubować, aż komórki oderwą się od powierzchni hodowli. Zbierz komórki w probówce o pojemności 50 ml za pomocą pożywki Quantum 263.
4. Określić liczbę komórek i odwirować wymaganą liczbę komórek przez 5 minut w temperaturze 300 x g i 4-8 °C. (Zgodnie z protokołem Miltenyi'ego można załadować maksymalnie 2x 10⁹ komórek na kolumnę LS. Należy określić optymalne liczby specyficzne dla linii komórkowej, które mogą być znacznie niższe.) Całkowicie odessać supernatant.
5. Ponownie zawiesić maksymalnie 1x 10⁸ komórek z buforem MACS o pojemności 350 μl (w przypadku większej liczby komórek należy odpowiednio zwiększyć wszystkie następujące objętości bufora MACS, odczynnika blokującego FcR, CD133/1-Biotyny i mikrokulek anty-biotyny).
6. Dodać 100 μl odczynnika blokującego FcR.
7. Dodać 50 μl CD133/1-Biotyny. Dobrze wymieszać za pomocą wiru i inkubować w temperaturze 4-8 °C przez 10 minut.
8. Przemyć komórki, dodając 10 ml buforu MACS i odwirować przez 5 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 4-8 °C. Całkowicie odessać supernatant.
9. Powtórzyć etap prania (1.8).
10. Zawiesić osad komórkowy za pomocą buforu MACS o pojemności 400 μl.
11. Dodaj 100 μl mikrokulek antybiotyny. Dobrze wymieszać za pomocą wiru i inkubować w temperaturze 4-8 °C przez 15 minut.
12. W międzyczasie przygotuj separator MACS do separacji magnetycznej. Podłącz QuadroMACS do MACS Separator Multi Stand. Włóż wymaganą liczbę kolumn LS ze skrzydłami kolumny do przodu w polu magnetycznym QuadroMACS. Umieść filtr wstępnej separacji (z siatką nylonową 30 μm) w każdej kolumnie LS, a odpowiednią probówkę zbiorczą (15 ml lub 50 ml) pod każdą kolumną. Przygotować filtr i kolumnę, przepłukując je 3 ml buforem MACS. Odrzuć przepływ.
13. Przemyć komórki, dodając 10 ml buforu MACS i odwirować przez 5 minut w temperaturze 300 x g i temperaturze 4-8 °C. Całkowicie odessać supernatant.
14. Ponownie zawiesić komórki za pomocą buforu MACS o pojemności 500 μl i nałożyć zawiesinę komórek na kolumnę LS za pomocą filtra wstępnej separacji.
15. Przemyć trzykrotnie 3 ml buforu MACS na kolumnę. Świeży bufor należy dodawać tylko wtedy, gdy zbiornik kolumny jest pusty.
16. Całość zebranych ścieków zawiera nieznakowaną frakcję komórkową CD133^.
17. Wyrzuć filtr wstępnej separacji, wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją na odpowiedniej probówce zbiorczej.
18. Zastosuj 5 ml buforu MACS. Natychmiast wypłukać oznaczone komórki CD133⁺, mocno wciskając tłok do kolumny.
19. Aby zwiększyć czystość frakcji ujemnej, należy nałożyć zawiesinę komórek na nową zrównoważoną kolumnę LS umieszczoną w QuadroMACS. Ścieki zawierają frakcję CD133^-.
20. Odrzuć kolumny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dokładności	PAA Laboratories GmbH	L11-007
Sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego odwodniona (EDTA)	Sigma-Aldrich, Inc.	E-7889
CD133/1 (W6B3C1)	Miltenyi Biotec GmbH	Numer katalogowy: 130-092-395
Pośredni zestaw mikrokulek CD133 dla ludzi	Miltenyi Biotec GmbH	Numer katalogowy: 130-091-895	Zawiera: CD133/1(AC133)-biotynę, mikrogranulki anty-biotyny i odczynnik blokujący FcR
Kwantowy 263	PAA Laboratories GmbH	U15-815
Separator MACS z wieloma podstawkami	Miltenyi Biotec GmbH	Numer katalogowy: 130-042-303
Kolumny separacyjne MACS 25 kolumn LS	Miltenyi Biotec GmbH	Numer katalogowy: 130-042-401
Separator QuadroMACS	Miltenyi Biotec GmbH	Numer katalogowy: 130-090-976