Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Izolacja melanocytów i fibroblastów
- Poddaj eutanazji od 0 do 4 dniowych młodych samców i/lub samic C57Bl/6J przez ścięcie głowy i usuń kończyny z uśpionych myszy za pomocą nożyczek chirurgicznych.
- W komorze z przepływem laminarnym krótko zwiń pień każdej myszy na sterylnej szalce Petriego zawierającej 70% etanolu. Wyjmij pień z etanolu i umieść go na pustej, sterylnej szalce Petriego.
- Za pomocą nożyczek chirurgicznych, wysterylizowanych w 70% etanolu, wykonaj nacięcie w skórze po brzusznej stronie tułowia, zaczynając od szyi do ogona. Oderwij skórę od tułowia myszy za pomocą sterylnych kleszczy.
- Umieść skórę skórą właściwą do dołu w 6-dołkowym naczyniu zawierającym 3 ml 1x Antybiotyk/Antybiotyk roztwór i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2-3 minuty.
- Włącz rozdrabniacz tkanek z następującymi ustawieniami: Grubość plastra: 1 μm; Siła ostrza: ~60% maksimum; Prędkość: ~50% maksimum.
- Przenieś skórę stroną właściwą do dołu do sterylnego krążka do rozdrabniania tkanek i przepuść skórę całkowicie przez aktywowany rozdrabniacz tkanek 3 razy.
- Przenieś homogenizowaną skórę do sterylnej, stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml buforu do trawienia skóry (przygotuj 3 ml świeżego buforu do trawienia skóry zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% roztworu penicyliny/streptomycyny, 1% L-glutaminy, 10 mg/ml kolagenazy typu I, 0,25% trypsyny wieprzowej i 0,02 mg/ml dezoksyrybonukleazy I w RPMI 1640). Wymieszaj otrzymaną zawiesinę, pipetując w górę i w dół 10-15 razy za pomocą mikropipety P1000.
- Zakryj stożkową probówkę i inkubuj próbkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut, odwracając probówkę co 3-5 minut.
- Komórki w skórze otoczkować homogenacyjnie, odwirowując stożkową rurkę w obracającym się wirniku kubełkowym o sile 750 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Za pomocą mikropipety P1000 powoli i całkowicie usuń bufor do trawienia skóry, uważając, aby nie naruszyć granulki.
nuta: Na tym etapie można zachować część całej skóry i wykorzystać ją jako kontrolę w celu potwierdzenia czystości komórkowej. Przecedź te komórki przez sitko o wielkości 70 μm i poddaj je dalszemu procesowi.
- Dokładnie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki z melanocytami, pipetując w górę i w dół 15-20 razy za pomocą mikropipety P1000. Dodaj otrzymany roztwór komórkowy kroplami do niepowlekanego dołka 6-dołkowego naczynia zawierającego 1 ml pożywki melanocytowej.
- Umieścić posiany homogenat skóry w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Pozostawić kultury do inkubacji przez 40 min.
nuta: W tym czasie niektóre fibroblasty w homogenacie skóry będą przylegać do niepowlekanego naczynia, podczas gdy melanocyty i keratynocyty pozostaną w zawiesinie.
- Przenieść supernatant hodowli z niepowlekanego naczynia do jednego dołka wstępnie umytego, pokrytego kolagenem naczynia 6-dołkowego. Dodać G418 do pożywki tak, aby końcowe stężenie wynosiło 100 ng/ml.
- Dodaj 2 ml pożywki Fibroblast do jednego dołka niepowlekanego naczynia, które teraz zawiera przylegające fibroblasty.
- Inkubować obie kultury przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych ustawionym w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Oddzielnie odessać pożywkę i wszelkie zanieczyszczenia z każdej kultury, 16-24 godziny po posiewaniu. Umyj każde naczynie dwukrotnie 1 ml sterylnego PBS, a następnie dodaj 2 ml świeżej pożywki melanocytowej plus 100 ng/ml G418 do kultury melanocytów i 2 ml świeżej pożywki Fibroblastów do kultury fibroblastów. (Przygotuj 6 ml świeżej pożywki melanocytowej zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 7% surowicy końskiej, 1% roztworu penicyliny/streptomycyny, 1% L-glutaminy, 0,5 mM cyklicznego AMP di-butyrylu (dbcAMP), 20 nM 13-octanu tetradekanoiloforbolu (TPA) i 200 pM toksyny (CT) w pożywce Nutrient Mix F-12 Ham's Media.
UWAGA: Skoncentrowane roztwory podstawowe dbcAMP, TPA i CT mogą być sporządzane, porcjowane i przechowywane przez >1 rok w temperaturze -80 °C. Pożywki bazowe pozbawione tych składników można przechowywać do 1 miesiąca w temperaturze 4 °C.
Przygotuj 4 ml pożywki Fibroblasts zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny/streptomycyny i 1% L-glutaminy w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Eagle Medium. Ten nośnik może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca)
- Po potraktowaniu kultur melanocytów G418 przez 48 godzin, przemyj komórki dwukrotnie 1 ml sterylnego PBS i dodaj do hodowli 2 ml świeżej pożywki melanocytowej bez G418.
nuta: Ponieważ fibroblasty w kulturze melanocytów nadal obumierają po leczeniu G418, umyj naczynie sterylnym PBS, aby usunąć martwe komórki i dodaj świeże podłoże melanocytowe. Kultury melanocytów i fibroblastów powinny być pasażowane, gdy osiągną 70-80% zbiegalności.
