Preparat wirionu rekombinowanego poliomawirusa z komórek Merkla (MCPyV): technika wytwarzania rekombinowanego wirionu MCPyV o wysokim mianie

Streszczenie

Źródło: Wei Liu et al. Zakażenie i wykrywanie poliomawirusa z komórek Merkla, J. Vis. Exp. (2019 rok)

W tym filmie pokazujemy przygotowanie poliomawirusa z komórek Merkla lub wirionów MCPyV przy użyciu komórek 273TT. Technologia ta pomaga w wytwarzaniu wysokiego miana rekombinowanych wirionów MCPyV.

Protokół

1. Rekombinowany preparat wirionu MCPyV

1. Trawić 50 μg plazmidu pR17b (przenoszącego genom MCPyV) z 250 U BamHI-HF w objętości 200 μl (4 godziny w 37 °C) w celu oddzielenia genomu wirusa od szkieletu wektora (ryc. 1).
2. Dodać 1200 μl buforu PB (uzupełnionego 10 μl 3 M NaAc, pH 5,2) do strawionego DNA i oczyść za pomocą 2 miniprep kolumn wirowych (pojemność 20 μg DNA). Eluować wytrawiony plazmid pR17b z każdej kolumny za pomocą 200 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, pH8,0, 1 mM EDTA).
3. Przygotować reakcję ligacji w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodać 400 μl oczyszczonego plazmidowego DNA z kroku 1.2, 8,6 ml 1,05x buforu ligazy T4 i 6 μl ligazy T4 o wysokim stężeniu. Inkubować w temperaturze 16 °C przez noc.
4. Dodać 45 ml buforu PB (uzupełnionego 10 μl 3 M NaAc, pH 5,2) do ligacji i użyć kolektora próżniowego, aby załadować przez 2 kolumny wirowe miniprep. Eluować każdą kolumnę za pomocą 50 μl buforu TE. Spodziewaj się plonu około 30 μg DNA.
5. Późnym popołudniem/wieczorem wysiew 6 x 10^{6 komórek} 293TT do 10 cm naczynia zawierającego pożywkę DMEM uzupełnioną 10% płodową surowicą cielęcą, 1% aminokwasami endogennymi i 1% L-glutaminą bez higromycyny B.
6. Następnego ranka upewnij się, że komórki są w około 50% zlewne. Transfekcja przy użyciu 66 μl odczynnika do transfekcji (1,1 μl/^cm2), 12 μg ponownie zligowanego izolatu MCPyV DNA R17b z kroku 1.4, 8,4 μg plazmidu o ekspresji ST pMtB i 9,6 μg plazmidu pADL o ekspresji LT.
7. Kiedy transfekowane komórki są prawie zlewające się, następnego dnia trypsynizuj komórki i przenieś je do 15-centymetrowego naczynia w celu dalszej ekspansji.
8. Opcjonalnie należy pobrać niewielką liczbę komórek 293TT po rozprężeniu i przeprowadzić barwienie IF dla MCPyV LT (CM2B4) i VP1 (MCV VP1 rabbit) w celu określenia wydajności transfekcji. Na tym etapie jądrowe sygnały LT mogą być widoczne, ale ekspresja VP1 prawdopodobnie nie będzie wykrywalna.
9. Gdy 15-centymetrowa szalka stanie się prawie zlewająca (zwykle 5-6 dni po początkowej transfekcji), przenieś komórki do trzech 15-centymetrowych szalek. Zbierz komórki z 15-centymetrowych szalek, gdy staną się prawie zlewające się i postępuj zgodnie z poniższym protokołem zbierania wirusa.
   nuta: Opcjonalnie przeprowadź kontrolę jakości IF zgodnie z opisem w kroku 1.8. Na tym etapie większość komórek powinna być zarówno MCPyV LT, jak i VP1 dodatnia.
10. Aby zebrać wirusa, trypsynizuj komórki, wiruj z prędkością 180 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usuń supernatant. Dodać jedną objętość osadu komórkowego DPBS-Mg (DPBS z 9,5 mM MgCl₂ i 1x antybiotyk-antybiotyk). Następnie dodaj 25 mM siarczanu amonu (z 1 M roztworu podstawowego o pH 9), a następnie 0,5% Triton X-100 (z 10% roztworu podstawowego), 0,1% benzonazy i 0,1% DNazy zależnej od ATP. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
11. Inkubować mieszaninę przez 15 minut na lodzie, a następnie dodać 0,17 objętości 5M NaCl. Wymieszaj i inkubuj na lodzie przez kolejne 15 minut. Wirować przez 10 minut w temperaturze 12 000 x g w wirówce o temperaturze 4 °C. Jeśli supernatant nie jest przezroczysty, delikatnie odwróć probówkę i powtórz etap wirowania. Przenieść supernatant do nowej probówki.
12. Zawiesić osad za pomocą jednej objętości DPBS uzupełnionej 0,8 M NaCl i ponownie odwirować, jak opisano w kroku 1.11.
13. Połączyć supernatanty z kroku 1.11 i 1.12 i odwirować jeszcze raz, jak opisano w kroku 1.11.
14. Wlewaj gradienty jodiksanolu do cienkościennych probówek poliamerowych o pojemności 5 ml, podkładając (27%, następnie 33%, a następnie 39%) w krokach ~0,7 ml za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml wyposażonej w długą igłę lub pipetę p1000.
15. Obciążyć 3 ml sklarowanego supernatantu zawierającego wirusa na przygotowany gradient jodiksanolu.
16. Wirować przez 3,5 h przy 234 000 x g i temperaturze 16 °C w wirniku SW55ti. Ustaw przyspieszanie i zwalnianie na wolne.
17. Po ultraodwirowaniu zebrać 12 frakcji w silikonowanych probówkach (każda frakcja to ~400 μL).
18. Analizować frakcje na obecność wirusa za pomocą odczynnika dsDNA i/lub Western blot dla VP1 (MCV VP1 rabbit). Połączyć frakcje gradientu z szczytową zawartością dsDNA i/lub VP1 i scharakteryzować stado za pomocą ilościowego PCR w celu obliczenia ekwiwalentu genomu wirusa. Przechowywać zapas wirionu MCPyV w temperaturze -80 °C.

Wyniki

Rysunek 1. Produkcja wirionu MCPyV z wykorzystaniem rekombinowanego genomu wirusa.(A) Mapa plazmidowa pR17b (plazmid genomu MCPyV). (B) Reprezentatywny obraz próbki wirionu MCPyV pobranej i oczyszczonej w gradiencie. Strzałka oznacza pasmo wirionów MCPyV skoncentrowanych w rdzeniu gradientu. (C) Liczbę kopii genomu wirusa w każdej frakcji gradientu ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM/F12 średni	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 11330-032
Rekombinowane ludzkie białko EGF, mukowiscydoza	Systemy badawczo-rozwojowe	236-EG-200	Przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza
CHIR99021	Chemiczny Kajmany	Numer katalogowy: 13122	Przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza
CHIR99021	Sigma	SML1046	Przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza
Kolagenaza typu IV	Thermo Fisher Naukowy	17104019
Dypaza II	Roche	4942078001
Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 15240-062	Chronić przed światłem
Podłoże DMEM	Thermo Fisher Naukowy	11965084
Paraformaldehyd	Sigma	Zobacz materiał P6148
Anty-MCPyV LT (CM2B4)	Santa Cruz	SC-136172	Numer pojazdu # B2717
MCV VP1 królik		Surowica poliklonalna królika #10965	https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm