Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Przygotowanie przezroczystej tkanki skóry myszy
UWAGA: Wszystkie myszy użyte w tym badaniu miały podłoże genetyczne C57BL/6
- Pobieranie tkanki skórnej myszy.
- Humanitarna eutanazja myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.
- Ostrożnie usuń włosy z odpowiedniego obszaru skóry za pomocą trymera, uważając, aby nie zranić skóry.
- Umyj skórę w celu odkażenia 70% etanolem w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
- Podnieś skórę grzbietu szyi za pomocą kleszczy i wykonaj nacięcie nożyczkami.
- Wypreparuj duży obszar grzbietowej skóry myszy (około 1,5 x 4 cm).
- Spłaszczyć skórę skórną skierowaną w dół na bibule filtracyjnej i zwrócić uwagę na orientację próbki przednio-tylną.
- Przyciąć bibułę filtracyjną wokół wypreparowanej skóry i umieścić w probówce o pojemności 15 ml wypełnionej świeżo przygotowanym 4% roztworem paraformaldehydu (PFA) w PBS.
- Utrwal na 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w lodówce w temperaturze 4 °C.
- Umyj skórę 2x 5 min w PBS w probówce 15 ml.
nuta: Poniższe (1.1.10 - 1.1.12) są opcjonalnymi krokami długotrwałego przechowywania tkanki.
- Odwodnić wypreparowaną skórę w PBS ze zwiększonym stężeniem etanolu (25%, 50%, 70%) w probówce o pojemności 15 ml podczas 1-godzinnych etapów mycia w temperaturze pokojowej.
- Odwodnioną skórę należy przechowywać w 70% etanolu w PBS w probówce o pojemności 15 ml w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.
- Cztery godziny przed oczyszczeniem należy nawodnić tkankę skórną w PBS ze zmniejszającym się stężeniem etanolu (70%, 50%, 25%, 0%) w probówce o pojemności 15 ml podczas 1-godzinnych etapów mycia w temperaturze pokojowej.
- Oczyszczanie biopsji skóry myszy
- Przygotować roztwór czyszczący CUBIC1, rozpuszczając 3,85 g mocznika i 3,85 g N,N,N',N'-tetrakis (2-hydroksypropylo)etylenodiaminy w 5,38 ml wody destylowanej na grzałce ustawionej na 60-70 °C. Użyj gorącego mieszadła.
- Dodać 2,31 g eteru mono-p-izooktylofenylowego glikolu polietylenowego/Triton X-100 do roztworu, gdy będzie klarowny i ostygnie do temperatury pokojowej.
- Przeciąć skórę myszy ostrą żyletką do biopsji o przybliżonych wymiarach 0,2 x 0,5 cm i zanurzyć w 5 ml roztworu oczyszczającego CUBIC1 w probówce o pojemności 15 ml. Aby zoptymalizować wizualizację mieszków włosowych, należy upewnić się, że dłuższy bok biopsji jest przecięty wzdłuż przednio-tylnego kierunku próbki.
- Umieścić na obrotowej platformie w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 37 °C.
- Zmień roztwór czyszczący po 7 dniach. Przed użyciem należy przygotować świeży roztwór CUBIC1.
- Sprawdź przezroczystość tkanki po 7 dniach. W razie potrzeby należy pozostawić biopsje w roztworze oczyszczającym CUBIC1, aż tkanka stanie się całkowicie przezroczysta.
- Gdy biopsja skóry stanie się przezroczysta, usuń roztwór CUBIC1 i dodaj 4 ml 1x PBS, aby przemyć tkankę 4 razy przez 6 godzin w temperaturze 37 °C.
- Umyć tkankę skóry w 20% w/v sacharozy w PBS w probówce o pojemności 15 ml przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
- Zamrozić tkankę w podłożu montażowym Związek o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) w probówce o pojemności 15 ml przez noc w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
nuta: Ten krok zwiększy przepuszczalność biopsji dla penetracji przeciwciał w kolejnych etapach.
2. Barwienie immunofluorescencyjne
- Rozmrażać tkankę od (krok 1.2.9) do temperatury pokojowej przez 2 - 3 godziny.
- Umyj chusteczkę w probówce o pojemności 15 ml z 5 ml PBS przez 8 godzin w temperaturze pokojowej, aby usunąć związek OCT.
- Przenieś biopsje do probówki o pojemności 2 ml i inkubuj tkankę w 1 ml króliczego przeciwciała anty-keratynowego14 lub króliczego przeciwciała anty-Ki67, oba rozcieńczone w stosunku 1:100 w PBST (PBS + 0,1% Triton-X100) przez 3 dni na wytrząsarce w piekarniku o temperaturze 37 °C.
- Przenieść biopsje do probówki o pojemności 15 ml i umyć tkankę 4 razy przez 6 godzin w 5 ml PBST na wytrząsarce w piekarniku o temperaturze 37 °C.
- Przenieść biopsje do probówki o pojemności 2 ml, dodać 1 ml przeciwciała wtórnego anty-królika Alexa594 rozcieńczonego w stosunku 1:100 w PBST i inkubować przez 3 dni na wytrząsarce w piekarniku o temperaturze 37 °C.
- Przenieś biopsje do probówki o pojemności 15 ml i umyj tkankę 4 razy przez 6 godzin w 5 ml PBST na wytrząsarce w piekarniku o temperaturze 37 °C.
- Przenieść biopsje do probówki o pojemności 2 ml, dodać 1 ml roztworu przeciwbarwiącego jądro 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) (1:1000) w PBST i inkubować przez noc na wytrząsarce w piecu o temperaturze 37 °C.
- Usuń roztwór do barwienia przeciwstawnego DAPI i dodaj 1 ml PBST do probówki o pojemności 2 ml, aby umyć tkankę 4 razy przez 6 godzin na wytrząsarce w piekarniku o temperaturze 37 °C.
nuta: Krok opcjonalny: Biopsje można przechowywać w ciemności w 1x PBS z 0,02% azydkiem sodu przez co najmniej 3 tygodnie.
3. Obrazowanie
- Przygotować roztwór czyszczący CUBIC2, który zawiera 50% (m/v) sacharozy, 25% (w/v) mocznika, 10% (w/v) 2,2′,2′'-nitrylotriotrietanolu i 0,1% (v/v) Triton X-100.
- Inkubować tkankę skórną w 1 ml roztworu CUBIC2 w probówce o pojemności 2 ml na wytrząsarce przez 24 godziny w piecu o temperaturze 37 °C. Ten krok wyrówna współczynnik załamania światła tkanki.
- Sprawdź przejrzystość tkanki. Gdy jest czysty, umieść całą biopsję skóry (0,2 x 0,5 cm) na dłuższym boku na szklanym szkiełku nakrywkowym, tak aby kierunek długości mieszków włosowych był równoległy do powierzchni szkiełka nakrywkowego (#1 24 x 60 mm).
nuta: Krok opcjonalny: Biopsje barwione przeciwciałami mogą być przechowywane w roztworze CUBIC2 przez około 7 dni. Biopsje zabarwione czerwienią nilową mogą być przechowywane w roztworze CUBIC2 tylko przez okres do 1 dnia i powinny być zobrazowane tak szybko, jak to możliwe.
- Przygotować komorę obrazowania (rysunek 1).
UWAGA: Materiały eksploatacyjne wymagane do przygotowania komory obrazowania to: niebieska tack, ciastolina lub podobne oraz 2 szkiełka nakrywkowe (24 x 50 mm) (Rysunek 1A).
- Przygotować dwa cienkie paski niebieskiego kleju (średnica około 1 mm x 2 cm) i dwa szkiełka nakrywkowe (ryc. 1B).
- Umieść niebieskie paski przyklejające na jednym szkiełku nakrywkowym, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca na biopsję skóry (Rysunek 1C, krok 3.4.3).
- Umieścić biopsję skóry między paskami na szkiełku nakrywkowym w kropli roztworu CUBIC2 (ryc. 1C).
- Pokryj biopsję skóry drugim szkiełkiem nakrywkowym (ryc. 1D).
- Umieść komorę obrazowania z zamontowaną biopsją skóry na stoliku mikroskopu konfokalnego i przenieś tkankę do ścieżki świetlnej.
- Zeskanuj próbkę za pomocą rtęciowego lub halogenowego źródła światła i standardowych filtrów epifluorescencyjnych (np. DAPI/GFP/CY3/CY5) w celu zidentyfikowania obszarów zainteresowania wybarwionych fluorescencyjnie.
- Obrazuj obszary zainteresowania za pomocą obiektywu 10X i 20X (NA 0,75) i standardowych technik obrazowania fluorescencji konfokalnej (np. w przypadku próbek barwionych DAPI oświetlaj laserem 405 nm i zbieraj sygnał fluorescencyjny w zakresie 425-475 nm, a w przypadku Alexa Fluor 594 lub próbek barwionych czerwienią Nilową oświetlaj laserem 561 nm i zbieraj sygnał fluorescencyjny w zakresie 570-620 nm).
- Generuj stosy obrazów Z każdego obszaru zainteresowania za pomocą oprogramowania do akwizycji obrazów ze stosu Z mikroskopu (np. za pomocą oprogramowania do obrazowania elementów NIS 4.13, jak opisano poniżej).
- Zapewnij optymalną moc lasera i wybierz ustawienia PMT HV/Offset, aby pobrać fluorescencję próbki.
- Otwórz pasek narzędzi "ND Acquisition" z "Acquisition Controls".
- Wybierz zakładkę "Ustawienia serii Z" (upewnij się, że wszystkie inne karty są odznaczone).
- Podczas skanowania na żywo ustaw ostrość na górze próbki i naciśnij przycisk "Góra".
- Skoncentruj się na dolnej części próbki i naciśnij przycisk "Dół".
- Wprowadź wymagany rozmiar kroku (lub naciśnij przycisk zoptymalizowanego rozmiaru kroku).
- Naciśnij przycisk "Uruchom teraz".
- Zapisywanie wynikowych stosów obrazów Z jako indywidualnych stosów obrazów TIFF (1 fluorochrom na stos obrazów Z).
- Użyj stosów Z-stacks obrazu, aby zrekonstruować interesujące obszary objętości 3D za pomocą oprogramowania do analizy 3D (np. przy użyciu Imaris x64 7.2.3, jak opisano poniżej).
- Uruchom oprogramowanie do analizy.
- Wybierz przycisk "Surpass" na pasku narzędzi, aby wygenerować objętość 3D.
- Otwórz pierwszy kolorowy obraz Z-stack (np. DAPI).
- Użyj narzędzia "dodaj kanał", aby dodać dodatkowe kanały kolorów, po jednym kanale na fluorochrom. Tak więc próbka zawierająca zarówno fluorochromy DAPI, jak i Alexa Fluor 594 będzie wymagała dwóch kanałów.
- Użyj narzędzia "Właściwości obrazu", aby ustawić prawidłowe wymiary pikseli (wokseli) (XYZ), jak określono w punkcie 3.7 powyżej.
- Użyj narzędzia "Regulacja wyświetlania", aby zmienić kolory kanałów w razie potrzeby (np. ustaw kanał DAPI na niebieski, kanał Alexa Fluor 594 na czerwony).
- Aby ustawić wolumin 3D w oknie obrazu, użyj myszy komputerowej, aby kliknąć i przeciągnąć wolumin zgodnie z wymaganiami.
- Użyj narzędzia "Migawka" na pasku narzędzi, aby wygenerować zrzuty ekranu obrazu 3D.
- Użyj narzędzia "Animacja" na pasku narzędzi, aby wygenerować filmy z obracaniem próbki 3D.
