$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Genetycznie modyfikowane pierwotne ludzkie keratynocyty
UWAGA: Użyj amfotropowych komórek feniksa hodowanych na kompletnych pożywkach DMEM [DMEM + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) + długopis/paciorkowca] do produkcji wirusów do infekowania pierwotnych ludzkich keratynocytów. Geny pakowania wirusów, które kodują białka, takie jak gag-pol i otoczka, są stabilnie zintegrowane z genomem komórki feniksa, co pozwala na produkcję wirusa po transfekcji wektorem retrowirusowym. Komórki Phoenix mogą być transfekowane z wysoką wydajnością, co pozwala na wysoką produkcję miana wirusa. Wirusy wytwarzane z tej linii pakującej mogą również infekować wiele różnych komórek ssaków, w tym ludzi.
- Dzień 1: Dzień przed transfekcją wysiewaj komórki feniksa na 6-dołkowej płytce o gęstości 800 000 komórek na dołek w kompletnym pożywce DMEM.
- Dzień 2: W dniu transfekcji należy użyć 3 μg wektorów retrowirusowych na studzienkę. Podwielokrotność 3 μg wektora retrowirusowego do probówki o pojemności 1,5 ml. Użyj mieszaniny 100 μl DMEM plus 6 μl odczynnika do transfekcji na każde 3 μg wektora. Wymieszać 6 μl odczynnika do transfekcji ze 100 μl DMEM w probówce o pojemności 1,5 ml. (Stosowane wektory retrowirusowe są wymienione w tabeli sprzętu/materiałów)
- Inkubować przez 5 minut i dodać mieszaninę o objętości 106 μl do wstępnie porcjowanej probówki zawierającej 3 μg wektora retrowirusowego. Mieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodaj całą tę mieszaninę kroplami do każdej studzienki komórek feniksa.
- Dzień 3: Dzień po transfekcji usuń pożywkę z komórek feniksa i dodaj 2 ml świeżej, kompletnej pożywki DMEM. Tego samego dnia wysiewaj pierwotne ludzkie keratynocyty na 6-dołkowe płytki o gęstości 75 000 komórek na dołek. Utrzymuj keratynocyty w pożywce wolnej od keratynocytów w surowicy (KCSFM) z antybiotykami (pen/strep).
nuta: Zakupiono pierwotne keratynocyty ludzkie. Ogniwa można kupić u różnych dostawców (wymienionych w tabeli Materiały).
- Dzień 4: Zbierz pożywkę z transfekowanych komórek feniksa, które teraz zawierają cząsteczki wirusa. Przepuść pożywkę przez filtr 0,45 μm za pomocą strzykawki (w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczających komórek feniksa) i umieść 2 ml na keratynocytach (posianych w 75 000 komórek/dołek poprzedniego dnia). Dodać bromek heksadimetryny (5 μg/ml) do pożywki, aby pomóc w pośredniczeniu w procesie infekcji. Miana wirusów wynoszą ~1 x 107 TU/mL.
- Wirować 6-dołkowe płytki w wirówce o sile 200 x g przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu usuń pożywkę zawierającą wirusa i umyj komórki raz 1x PBS przed dodaniem KCSFM.
- Dzień 5: Ponownie należy zainfekować tę samą partię keratynocytów, co w 1,4, używając 2 ml przefiltrowanej pożywki zawierającej bromek heksadimetryny (5 μg/ml). Wirować z prędkością 200 x g przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby usunąć nośnik zawierający wirusa i przemyć 1x PBS, a następnie dodać KCSFM.
nuta: Wybierz keratynocyty za pomocą leku, jeśli na wektorze retrowirusowym znajduje się możliwy do wyboru marker i rozwiń do wykorzystania w dalszej analizie lub zastosowaniach, takich jak hodowle organotypowe.