Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Pierwotny zbiór i siew keratynocytów
- Poddać eutanazji cztery do pięciu dorosłych samic myszy poprzez wdychanie CO2 zgodnie z zatwierdzonymi standardami dla zwierząt/IACUC. Jednak protokół ten może być również stosowany w przypadku pojedynczych samic / samców myszy.
- Przytnij około 9cm2 futra grzbietowego za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia zwierząt i umieść wszystkie strzyżone myszy w słoiku o pojemności 500 ml z wystarczającą ilością roztworu antyseptycznego jodu powidonu (nie peelingu), aby przykryć je na 1-2 minuty. Dobrze wstrząśnij słoikiem, aby równomiernie pokryć myszy roztworem antyseptycznym.
- Odlej roztwór i spłucz czystą wodą, aż płyn będzie klarowny. Powtórz to samo mycie antyseptyczne, a następnie spłucz wodą. Po antyseptycznym przemyciu roztworem jodu namocz wszystkie myszy w 70% etanolu przez 5-10 min.
UWAGA: Myszy o jasnym futrze (np. BALB/c) zachowają lekko żółtawy kolor po antyseptycznym płukaniu jodem, podczas gdy ciemniejsze myszy (np. C57BL/6) nie. Warto zauważyć, że żółty kolor nie ma wpływu na żywotność komórek ani wzrost kultur.
- Ostrożnie usuń przyciętą skórę grzbietową za pomocą kleszczy do kciuków i nożyczek w kapturze z przepływem laminarnym. Wyciętą skórę grzbietową umieścić w stożkowej probówce wypełnionej PBS/2x gentamycyną. Unikaj stosowania brzusznej skóry bocznej, aby zapobiec zanieczyszczeniu komórek sutka w hodowli.
- Używając autoklawowanych kleszczy i skalpela, kładź jedną skórę grzbietową na raz, owłosioną stroną do dołu, na cienkiej szalce Petriego. Zacznij zeskrobywać całą tkankę podskórną, w tym tłuszcz z brzusznej strony tkanki skórnej, aż stanie się półprzezroczysta. Staraj się usunąć maksymalne ślady tkanki podskórnej bez rozrywania skóry (części mieszków włosowych). Nie skrobać również przez długi czas i unikać wysuszenia skóry.
- Utrzymuj zeskrobaną skórę w roztworze PBS, dopóki wszystkie inne pozostałe skórki nie zostaną przetworzone. Następnie za pomocą skalpela pokrój skórki w paski o wymiarach 0,5 cm x 1-1,5 cm i połóż owłosioną stroną do góry na sterylnej szalce Petriego.
- Ostrożnie odpipetować 20 ml PBS/2x roztworu gentamycyny zmieszanego z trypsyną (0,25%) na plastikową szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 20 mm. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś skórki i unieś je włoską stroną do góry na powierzchni roztworu trypsyny przez 2 godziny w inkubatorze o temperaturze 32 °C.
UWAGA: Czas i temperatura trypsynizacji mają kluczowe znaczenie dla dobrego plonowania wysoce kulturowych keratynocytów pierwotnych. Chociaż inne metody mogą zapewnić dobre plony żywotnych komórek, zdolność do hodowli keratynocytów była mniej zadowalająca.
- Podczas tego 2-godzinnego czasu inkubacji pokryć naczynia powłoką kolagenową i umieścić je w temperaturze 37 °C na 1 godzinę (patrz krok 1.1.2). W przypadku testów klonogennych szalki Petriego o średnicy 60 mm są powlekane na 24 godziny przed zbiorem keratynocytów, aby umożliwić napromieniowanej warstwie zasilającej 3T3 przyczepienie się do dna i równomierne rozprowadzenie.
nuta: Powlekanie naczyń hodowlanych do hodowli klonogennej jest bardzo ważne dla prawidłowego przyczepiania, tworzenia kolonii i ostatecznego wzrostu/proliferacji keratynocytów naskórka myszy.
- Etap skrobania naskórka: Ułóż sterylną plastikową kwadratową szalkę Petriego i utwórz powierzchnię pod kątem 30° w celu prawidłowego skrobania naskórka za pomocą 15 ml pożywki do zbierania (patrz Tabela 1). Ostrożnie usuń pływający pasek skóry z roztworu trypsyny za pomocą zakrzywionych kleszczyków. Następnie za pomocą nowego ostrza skalpela zeskrob naskórek i włosy do podłoża.
- Nie używaj nadmiernej siły, ale użyj wystarczającej siły, aby zeskrobać naskórek lub wpłynąć na żywotność komórek.
- Podczas skrobania naskórka trzymaj ostrze prostopadle do kawałka skóry. Jeśli ostrze jest ustawione pod kątem w kierunku ruchu ostrza, istnieje większe ryzyko rozdarcia skóry. Jeśli ostrze jest odchylone od ruchu ostrza, istnieje większe prawdopodobieństwo niepełnego usunięcia naskórka.
- Ostrożnie wlej pożywkę zawierającą zeskrobane komórki naskórka do sterylnego słoika o pojemności 60 ml (autoklawowalnego i wielokrotnego użytku) z 1,5-calowym mieszadłem magnetycznym. Opłucz szalkę Petriego dodatkowym podłożem do zbierania, aby zebrać pozostałe komórki naskórka i doprowadzić końcową objętość do 30 ml. Użyj mieszadła magnetycznego i mieszaj z prędkością 100 obr./min przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Proces ten usunie uwięzione komórki naskórka z włosów.
- Umieść sterylne sitko do komórek o pojemności 70 μm na górze stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Sitko do komórek pasuje do stożkowej rurki o pojemności 50 ml.
- Umieść słoik w kapturze bezpieczeństwa biologicznego. Wyjmij mieszadło i wlej zawartość do filtra sitowego podłączonego do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odcedź niepożądane włosy i arkusze warstwy rogowej naskórka.
- Ściśnij włosy wraz z materiałami warstwy rogowej naskórka w sitku i manipuluj nimi, aby uwolnić uwięzione komórki rzęsate. Użyj 5 ml pożywki do zbierania, aby pozostałe uwięzione komórki mogły się uwolnić i spłynąć do probówki. Doprowadzić całkowitą objętość do 50 ml w stożkowej probówce.
- Zakryć stożkową probówkę o pojemności 50 ml filtratem komórkowym i odwirować przy 160 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. Następnie odessać supernatant i dodać 5 ml pożywki do zbioru. Na koniec ponownie zawiesić osad komórkowy, delikatnie rozcierając ~20x pipetą o pojemności 5 ml.
- Na tym etapie trzymaj komórki w zamrażalniku, aby uniknąć agregacji. Następnie dodaj 25 ml podłoża do zbioru i ponownie rozcieraj (20-25x).
- Aby zapewnić dokładną liczbę keratynocytów na tym etapie, weź 1 ml zawiesiny komórek i dodaj 19 ml pożywki do zbierania. Teraz rozcieńczenie komórek wynosi 1:20 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Jeśli keratynocyty są pobierane od jednej myszy, dostosuj objętość zawiesiny komórek. Na przykład zamiast 30 ml użyj 15 ml i wykonaj rozcieńczenie 1:10 do liczenia komórek.
- Odmierzyć pipetą 0,5 ml rozcieńczonych komórek z probówki stożkowej o pojemności 50 ml (rozcieńczenie 1:20) i przenieść do 1,5 ml autoklawizowanej probówki do mikrowirówki. Usunąć 0,2 ml (200 μl) mieszanki komórek do innej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać równą objętość (200 μl) 0,4% roztworu błękitu trypanowego. Delikatnie wymieszaj ten roztwór 3x i przenieś komórki do hemocytometru w celu zliczenia jądrzastych keratynocytów.
- Oceń wszystkie ciemnoniebieskie komórki dodatnie dla błękitu trypanowego jako martwe komórki niezdolne do życia i oceń małe złote i różowawe komórki jako żywe komórki. Tak więc ostateczna wydajność keratynocytów na mysz powinna wynosić około 30 milionów żywotnych komórek.
- Odwirować oryginalną probówkę stożkową o pojemności 50 ml (od kroku 1.8) przez 7 minut przy 160 x g w temperaturze 4 °C. Na tym etapie ponownie zawieś komórki w żądanym podłożu i wykonaj wymagane rozcieńczenie do wysiewu komórek.
- W przypadku hodowli masowej należy zasiać od 2 do 4 milionów żywotnych złotych komórek na każdej szalce Petriego o średnicy 35 mm w pożywce do hodowli komórkowych (pożywka typu KGM + suplementy do kultur jednowarstwowych) (patrz Tabela 1). W przypadku testu klonogennego (tworzenia kolonii) wysiewa się 1000 komórek na 60 mm szalki Petriego na napromieniowanych promieniowaniem rentgenowskim warstwach podajnika 3T3 szwajcarskiej myszy z powłoką kolagenową i zmodyfikowaną pożywką E Willii z suplementami i surowicą.
- Użyj łącznie od 2 do 4 ml pożywki dla szalek Petriego o średnicy 35 mm i 60 mm. Również sformułować DMEM i pożywkę Williams E pozyskaną z ATCC o obniżonym poziomie wodorowęglanu sodu do stosowania w stężeniu 5% CO2 .
- Hodować komórki hodowlane (masowo lub klonogennie) w temperaturze 32 °C, wilgotności 95% i 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę jeden dzień po początkowym zasiewie dla kultury masowej, a następnie 3 razy w tygodniu. Jednak w przypadku testów klonalnych pierwsza zmiana pożywki następuje 2 dni po wysiewie komórek, a następnie 3 razy w tygodniu.
- W przypadku hodowli klonalnej hoduj komórki w odstępach dwu- i czterotygodniowych. Po zakończeniu hodowli klonalnych (2 lub 4 tygodnie) odessać pożywkę. Utrwal kolonie w 10% buforowanej formalinie przez noc w temperaturze pokojowej i zabarwiaj 0,5% rodaminą B w wodzie autoklawu przez 1 godzinę. Następnie usuń plamę z rodaminy B za pomocą pipety z krawędzi naczyń.
- Opłucz naczynia w zimnej wodzie z autoklawem, aż naczynia będą czyste. Umieść naczynia pochylone na pokrywie naczyń i pozwól im wyschnąć do ostatecznego liczenia kolonii. Warto zauważyć, że podczas wykonywania testu hodowli klonogennej nigdy nie pipetuj <1 ml komórek. Jeśli komórki są skoncentrowane, należy je stopniowo rozcieńczyć.
| Rozwiązania i media | Komentarze |
| Rozwiązania w zakresie zbiorów | |
| 2,5% trypsyna (5 ml) | |
| PBS firmy Dulbecco (500 ml) | |
| Gentamycyna (2 ml) | |
| PBS z 2x gentamycyną (45 mL) | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z 2x gentamycyną | |
| Roztwór trypsyny | |
| Rozwiązania w zakresie hodowli komórkowych | |
| Roztwór do powlekania naczyń Purecol-fibronektyna: | |
| 1 M HEPESA (1 ml) | |
| 116 mM CaCl2 (1 ml) | |
| Albumina surowicy bydlęcej 1,0 mg/ml (10 ml) | |
| Pożywka do hodowli komórkowych (100 ml) | |
| Fibronektyna (1 mg) | |
| Kolagen Purecol (1 mL) | |
| Roztwór do zamrażania komórek | |
| DMSO (2 ml) | |
| DMEM z 10% BCS i paciorkowcem | |
| Podłoże do zbioru | Musi być bez wapnia |
| 2x gentamycyna (1 ml) | |
| FBS (50 ml) | |
| SMEM (500 ml) | |
| Wysokowapniowe podłoże E Williamsa z: | |
| EGF (5 μg/ml) 1 ml | |
| Glutamina 14,5 ml | |
| Hydrokortyzon (1 mg/ml) 0,5 ml | |
| Insulina 1 ml | |
| LinoAcid-BSA (0,1 mg/ml) 0,5 ml | |
| MEM Ess Aminokwasy 4 ml | |
| MEM Witaminy 5 ml | |
| Penicylina-Streptomycyna 5 ml | |
| Transferyna (5 mg/ml) 1 ml | |
| Vit A (1 mg/1 000 μL) 57,5 μL | |
| Vit E 1 mg/ml (4°C) 3,5 μL | |
| Vit D2 (10 mg/ml) 50 μL | |
| Kompletna pożywka wzrostowa fibroblastów 3T3 (CGM) | |
| BCS (100 ml) | |
| DMEM (900 ml) | |
| Penicylina-streptomycyna (10 ml) | |
| KGM (w kraju) | Pożywką stosowaną do hodowli masowej jest pożywka o obniżonej zawartości wapnia |
| Morris 2 medium z tymi samymi suplementami co Williams E | Wariant Williams E o obniżonej zawartości wapnia z suplementami |
Tabela 1: Receptury roztworów i pożywek.
