$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Badania przesiewowe w kierunku modyfikatorów początku czerniaka
- Tworzenie klonów środkowego wejścia Gateway metodą PCR, amplifikacja pełnej długości otwartej ramki odczytu genów będących przedmiotem zainteresowania (GOI) i rekombinacja do pDONR 221 przy użyciu klonazy BP II (Invitrogen). Użyj technologii Multisite Gateway (Invitrogen) do rekombinacji p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit #302 p3E_SV40polyA i miniCoopR, aby umieścić interesujące geny pod promotorem mitfa w wektorze miniCoopR (Figura 1A).
- Wstrzyknij 25 pikogramów każdego klonu wraz z 25 pikogramami mRNA transpozazy Tol2 do jednokomórkowego Tg (mitfa: BRAFV600E); P53(LF); Mitfa(lf)potrójnie homozygotyczne zarodki danio pręgowanego, jak opisano wcześniej. Inkubować wstrzyknięte zarodki w temperaturze 28,5 °C. Usunąć wszelkie martwe zarodki w temperaturze 24 hpf.
- Wybierz transgeniczne zwierzęta z uratowanymi melanocytami w temperaturze 72 hpf, umieszczając szalkę Petriego zawierającą wstrzyknięte zarodki pod mikroskopem preparacyjnym pod padającym światłem na białym tle (ryc. 1A).
- Przenieś zwierzęta do 3-litrowych zbiorników w odchowalni danio pręgowanego przy 4 dpf.
- W wieku 2 miesięcy wybierz zwierzęta, u których co najmniej jeden obszar ratowania melanocytów jest większy niż 4mm2 (ryc. 1A). Istnieje silna korelacja między stopniem uratowania melanocytów przy 72 hpf a stopniem uratowania melanocytów po 2 miesiącach. Kiedy zarodki z uratowanymi melanocytami zostaną wybrane przy 72 hpf, większość z nich (~ 80%) będzie miała co najmniej jeden obszar ratowania melanocytów większy niż 4 mm2 po 2 miesiącach.
- Co tydzień badaj wybrane zwierzęta pod kątem obecności guzów (ryc. 1B). Istnieje silna korelacja między zmianami histopatologicznymi i morfologicznymi. Przejście od łagodnego do złośliwego jest rozpoznawane jako zmiana morfologiczna, gdy zmiany unoszą się nad powierzchnię zwierzęcia. Wyizoluj zwierzęta z nowotworem do badań.
- Narysuj krzywe przeżycia wolnego od czerniaka wraz z wiekiem w tygodniach na odciętej i procentem przeżycia wolnego od czerniaka na rzędnej. Zwierzęta z melanocytami, które wyrażają interesujący gen, są porównywane ze zwierzętami kontrolnymi, które wyrażają EGFP (wzmocnione białko zielonej fluorescencji) w melanocytach (ryc. 1C). Mediana początku występowania nowotworu u zwierząt, którym wstrzyknięto miniCoopR-EGFP, wynosi około 18 tygodni. Określ, czy te dwie krzywe różnią się statystycznie, korzystając z testu logarytmicznej.
