Barwienie przeciwciałami melanocytów łuskowych: technika wykrywania czynników transkrypcyjnych wyrażanych w melanocytach związanych z łuską grzbietową modeli danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Sharanya Iyengar et al. Badania przesiewowe w kierunku modyfikatorów czerniaka przy użyciu autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego. J. Vis. Exp. (2012)

Ten film opisuje metodę barwienia przeciwciał w celu wykrycia ekspresji czynników transkrypcyjnych w melanocytach związanych z łuską grzbietową modeli danio pręgowanego. Ta technika barwienia immunologicznego pomaga w specyficznej identyfikacji czynnika transfekcji A indukującego melanocyty u transgenicznego danio pręgowanego.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Barwienie przeciwciałami melanocytów łuskowych

1. Uzupełnić bufor PO₄ 80 ml 0,1M Na₂HPO₄ i 20 ml 0,1 M NaH₂PO₄. Upewnij się, że pH wynosi 7,3. Uzupełnić 2x bufor utrwalający zawierający 8,0 g sacharozy, 0,15 ml 0,2 M CaCl₂ i 90 ml 0,2 M buforu PO₄ o pH 7,3. W razie potrzeby dostosować pH do 7,3 za pomocą NaOH lub HCl, a następnie uzupełnić do 100 ml buforem PO₄
.
2. Odważyć do 300 mg stałego PFA i dodać do probówki do mikrowirówki. Dodać 5 mM NaOH do objętości równej 4,5 x masie PFA w mg (np. 450 ul 5 mM NaOH do 100 mg PFA). Ogrzewać w temperaturze 60-70 °C, od czasu do czasu wstrząsając, aż do rozpuszczenia PFA. Odkręć pozostałe cząstki i odzyskaj 20% supernatantu PFA. Spraw, aby za każdym razem był świeży.
3. Przygotować roztwór utrwalający zawierający 1x bufor utrwalający i 4% PFA.
4. Znieczulić ryby w 0,17 mg/ml tricainy.
5. Używając padającego światła pod mikroskopem preparacyjnym, wyrwij łuski grzbietowe za pomocą ostrych kleszczy z cienką końcówką, uważając, aby nie uszkodzić połowy łuski zawierającej melanocyty (ryc. 1A). Umieść łuski bezpośrednio z kleszczyków w 1 ml roztworu utrwalającego i inkubuj w temperaturze pokojowej, obracając, przez ≥ 2 godziny. Przenieś rybę do wody dla ryb i monitoruj ryby, aby potwierdzić pomyślne wyzdrowienie.
6. Aby wybielić pigmentowane melanocyty, umyj utrwalone łuski w PBST (1x PBS pH 7,4, 0,1% Triton X-100) 2 razy przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 1 ml świeżo przygotowanego roztworu wybielacza zawierającego 0,4 ml 10% KOH i 0,15 ml 30% H₂O₂ w 5 ml z dH₂O. Załóż parafilm lub zamki nasadkowe, aby zapobiec rozerwaniu probówek przez gaz. Kontynuuj wybielanie, aż pigment zniknie (zazwyczaj 10 minut) (Rysunek 1B, C). Prać w PBST cztery razy przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
7. Blokować przez co najmniej 30 minut w roztworze blokowym składającym się z 1x PBS pH 7,4, 0,2% Triton X-100, 2 mg / ml BSA, 1% DMSO, 0,02% NaN₃ i 2% surowicy jagnięcej. Pomiń NaN₃, jeśli rozwija się z reakcją HRP.
8. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym w roztworze blokowym przez noc w temperaturze pokojowej. Musisz mieć co najmniej 400 μl roztworu na próbkach, aby były zanurzone.
9. Umyj wagę 3 razy przez 30 minut w PBST w temperaturze pokojowej.
10. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi przez 2 godziny do nocy w roztworze blokowym w temperaturze pokojowej.
11. Barwienie przez 10 minut za pomocą PBST + 0,1 μM DAPI.
12. Umyć 3 razy przez 5 minut za pomocą PBST.
13. Zamontuj wagę na szkiełku podstawowym w kropli vectashield tak, aby wklęsła strona wagi była skierowana w dół w kierunku szkiełka i umieść na nich szkiełko zakrywające. Uszczelnij krawędzie szkiełka przezroczystym lakierem do paznokci i obserwuj szkiełka pod mikroskopem fluorescencyjnym (ryc. 1D, E, F, G).

Wyniki

Rysunek 1. Barwienie przeciwciałami melanocytów łuskowych. A) Łuski zrywane ze znieczulonego danio pręgowanego miniCoopR-EGFP. B) Niebielona łuska z pigmentowanymi melanocytami i C) bielona łuska z danio pręgowanego miniCoopR-EGFP. Pasek skali = 100 μM. Niebielona skala barwiona przeciwciałem D) Mitfa i E)...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki do rekombinacji bramki	Invitrogen
miniCoopR (Współpraca
Przeciwciało Mitfa
Przeciwciało FITC przeciwko królikowi IgG	Invitrogen
Vectashield (Tarcza Vectashield	Laboratoria wektorowe	H-1000
kacper Danio pręgowany
Strzykawka 701N 10 μl	Hamilton/Fisher	Numer katalogowy: 14-824
FBS (Sieć Usługowa	Invitrogen	26140079

w sieci) )