Test przeszczepu podskórnego: metoda przeszczepiania komórek czerniaka od dawcy do biorcy modelu danio pręgowanego

Streszczenie

Źródło: Iyengar, S. et al. Badania przesiewowe w kierunku modyfikatorów czerniaka przy użyciu autochtonicznego modelu guza danio pręgowanego. J. Vis. Exp.(2012)

Ten film opisuje metodę przeszczepu komórek nowotworowych z modelu dawcy czerniaka do biorcy z obniżoną odpornością, zebry Casper. Pomaga uwidocznić wszczepienie i proliferację guza u ryb biorcy.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Test transplantacyjny

1. Przygotuj biorcę 2-3 miesięcznej ryby Casper, napromieniowując 25 Gy promieniowaniem gamma na jeden dzień przed przeszczepem. Pozwól rybie zregenerować się w wodzie dla ryb.
2. Poddaj eutanazji rybę z nowotworem zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. W szczególności rybę umieszcza się w naczyniu z 0,6 mg/ml tricainy, aż ustaną skrzela.
3. Odetnij guz i umieść go na szalce Petriego z filtrem o pojemności około 5 ml wysterylizowanym 0,9x PBS z 5% FBS. Pokrój guz w kostkę brzytwą w roztworze.
4. Pracując w temperaturze pokojowej, rozcieraj pipetą P1000, aby uzyskać pojedyncze komórki. Uzupełnić objętość do 25 ml za pomocą filtra wysterylizowanego 0,9x PBS z 5% FBS.
5. Przefiltruj przez filtr siatkowy 40 μM.
6. Wirować w wirówce stołowej Eppendorf 5810R z prędkością 1 500 obr./min (453 obr./min) przez 10 minut.
7. Usuń supernatant i przygotuj zawiesinę komórek do mniej więcej pożądanego stężenia (załóżmy, że 10 7 komórek na guz o wielkości 100 mm³).
8. Obliczyć dokładną liczbę komórek za pomocą hemocytometru i rozcieńczyć zawiesinę komórek tak, aby końcowa objętość wstrzyknięcia wynosiła około 5 μl. Na przykład, jeśli ma zostać wstrzykniętych 50 000 komórek, zawiesinę komórek należy rozcieńczyć do końcowego stężenia 10 000 komórek/μl. Przesuwaj probówkę zawierającą zawiesinę komórek co kilka minut, aby zapobiec zlepianiu się komórek.
9. Umyj strzykawkę Hamilton 26s (końcówka skośna) 701 N 10 μL 2-3 razy 100% etanolem i 0,9x PBS. Umieścić w strzykawce 5 μl zawiesiny komórek.
10. Napromieniowaną rybę biorcę należy znieczulić 0,17 mg/ml trikainy. Umieść rybę na boku na wilgotnym Kimwipe (Rysunek 1A).
11. Ustabilizuj rybę jedną ręką i włóż igłę skosem skierowanym do góry pod kątem 45° w bok ryby powyżej jamy otrzewnej, mniej więcej w połowie odległości między tylną granicą tyłomózgowia a przednią granicą płetwy grzbietowej. Delikatnie wciśnij tłok (Rysunek 1B).
12. Pozwól rybie zregenerować się w słodkiej wodzie rybnej i codziennie obserwuj ryby pod kątem wszczepienia guza (ryc. 1C). Jeśli doszło do wszczepienia, można również zaobserwować ciągły wzrost i rozwój choroby.

Wyniki

Rysunek 1. Przeszczep komórek czerniaka. a) Danio pręgowany Casper bez wstrzyknięć. Pasek skali = 500 μM. B) Podskórne miejsce przeszczepienia (grot strzałki) u napromieniowanego biorcy Caspera bezpośrednio po wstrzyknięciu 50 000 komórek czerniaka. Pasek skali = 200 μM. C) Napromieniowany biorca Casper wy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki do rekombinacji bramki	Invitrogen
miniCoopR (Współpraca
kacper Danio pręgowany
Strzykawka 701N 10 μl	Hamilton/Fisher	Numer katalogowy: 14-824
Filtr 40 μM	BD Falcon/Fisher	Numer telefonu 352340
FBS (Sieć Usługowa	Invitrogen	26140079

w sieci) TGL