1. Przygotowanie pożywek i odczynników
- Przygotowanie 200x bulionu z 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego
- Rozpuścić 29 mg 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego w 5 ml roztworu zmodyfikowanego podłoża Orła (DMEM) firmy Dulbecco i przefiltrować przez filtr membranowy 0,22 μm. Przechowywać w postaci 0,25 ml sterylnych podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
- Dodać 0,25 ml podwielokrotności 200x 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego do każdych 50 ml pożywki fibroblastów (DMEM z 1% L-glutaminą i 10% płodową surowicą bydlęcą) w wymaganym dniu, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1 mM 2-fosforanu kwasu L-askorbinowego.
- Przygotowanie pożywek wzrostowych keratynocytów
- Izolacja i hodowla keratynocytów pierwotnego raka płaskonabłonkowego (SCC) została opisana wcześniej. Opisano w nim również przygotowanie pożywek wzrostowych keratynocytów.
- Pokrótce przygotuj podłoże w następujący sposób:
300 ml DMEM i 100 ml Ham's F-12 uzupełnione 10% FBS
0,4 mg/ml hydrokortyzonu
5 mg/ml insuliny
10 ng/ml EGF
5 mg/ml transferyny
8,4 ng/ml toksyny
13 ng/ml liotyroniny
1x roztwór penicyliny-streptomycyny
2. Budowa in vitro natywnej matrycy pochodzącej z fibroblastów w pożywkach z dodatkiem 2-fosforanu L-askorbinowego
- Wysiewaj 200 000 fibroblastów na studzienkę na płytkach 6-dołkowych (20 000 komórek/cm2) w pożywce fibroblastów uzupełnionej 2-fosforanem kwasu L-askorbinowego. Podawaj co 2-3 dni 2-5 ml pożywki. (Uwaga: częstotliwość i objętość ponownego karmienia można dostosować do indywidualnych potrzeb różnych komórek).
- Pod koniec 6 tygodni utworzy się gruba warstwa komórek osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej, widoczna gołym okiem (ryc. 1). Aby uwolnić tę warstwę z płytki do hodowli tkankowej, delikatnie zeskrob obwód matrycy końcówką mikropipety o pojemności 1 ml, a następnie popchnij krawędzie matrycy w kierunku środka dołka. Ta warstwa komórek i matrycy (matryca natywna) powinna być łatwa do oderwania od powierzchni płytki, a teraz unosić się w podłożu. Rozłóż natywną matrycę na nośniku, aby uniknąć jej składania się na siebie.
- Pozwól natywnej matrycy unosić się i przemodelować przez 5 dni, zmieniając nośnik co 2-3 dni. Ze względu na wytrzymałość na rozciąganie i wewnętrzną przebudowę w matrycy, matryca drastycznie się skurczy i zostanie zredukowana do mniejszej, ale grubszej macierzy natywnej, gotowej do wykorzystania w teście inwazji.
3. Test inwazji z keratynocytami SCC guza
- Delikatnie podnieś natywną matrycę kleszczami i przenieś do siatki nylonowej. Po umieszczeniu na nylonowej siatce delikatnie rozprowadź matrycę, aby leżała jak najbardziej płasko, używając końcówki do mikropipet o pojemności 1 ml i kleszczyków.
- Przygotuj sterylne cylindry klonalne, smarując niewielką ilość sterylnej wazeliny na jednym końcu.
- Umieść cylindry klonalne na macierzy natywnej, stroną z wazeliną do dołu. Ma to na celu zapewnienie szczelnego uszczelnienia między macierzyą natywną a pierścieniami klonalnymi.
- Dodaj komórki cSCC do cylindrów klonalnych (250 000 komórek w 100 μl pożywki wzrostowej keratynocytów).
- Wyjmij cylindry klonalne po 6 godzinach, gdy komórki cSCC osiądą na macierzy natywnej.
- Podnieś siatkę nylonową z natywną matrycą i komórkami cSCC do interfejsu powietrze-ciecz na wygiętym wsporniku z siatki drucianej ze stali nierdzewnej.
- Dodaj pożywkę wzrostową keratynocytów uzupełnioną kwasem askorbinowym, aż poziom pożywki dotknie dna macierzy natywnej.
- Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni i zbieraj po 7 i 14 dniach, po wysiewie komórek cSCC.
