Selekcja aptamerów bez użycia starterów z wykorzystaniem losowej biblioteki DNA

Podsumowanie

Protokoły SELEX obejmują wiele rund selekcji, z których każda wymaga regeneracji związanych ligandów, co z kolei wymaga stałych sekwencji starterów flankujących regiony losowej biblioteki. Te stałe sekwencje starterów mogą zakłócać proces selekcji (powodując wyniki fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne). Przedstawiamy tutaj protokół bez użycia starterów.

Streszczenie

Aptamery to silnie ustrukturyzowane oligonukleotydy (DNA lub RNA), które mogą wiązać się z celami z powinowactwem porównywalnym do przeciwciał ¹. Są one identyfikowane poprzez proces selekcji in vitro zwany SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment), aby rozpoznawać szeroką gamę celów, od małych cząsteczek po białka i inne makrocząsteczki ^2-4. Aptamery posiadają właściwości, które dobrze nadają się do diagnostycznych i/lub terapeutycznych zastosowań in vivo: poza dobrą swoistością i powinowactwem, są one łatwo syntetyzowane, wytrzymują bardziej rygorystyczne warunki przetwarzania, charakteryzują się niską immunogennością, a ich stosunkowo niewielki rozmiar może skutkować łatwiejszą penetracją tkanek.

Aptamery identyfikowane za pomocą standardowego procesu SELEX zazwyczaj składają się z około 80 nukleotydów (nt), ponieważ są one typowo selekcjonowane z bibliotek kwasów nukleinowych z randomizowanymi regionami o długości ok. 40 nt oraz stałymi miejscami dla starterów o długości ok. 20 nt po każdej stronie. Stałe sekwencje starterów mogą zatem stanowić blisko 50% sekwencji biblioteki, co może w sposób pozytywny lub negatywny wpływać na identyfikację aptamerów w procesie selekcji ³, choć podejścia bioinformatyczne sugerują, że stałe sekwencje nie przyczyniają się znacząco do struktury aptameru po selekcji ⁵. Aby rozwiązać te potencjalne problemy, sekwencje starterów blokowano za pomocą komplementarnych oligonukleotydów lub zmieniano na inne sekwencje w połowie rund SELEX ⁶, bądź przycinano je do 6-9 nt ^{7, 8}. Wen i Gray ⁹ opracowali metodę genomowego SELEX bez użycia starterów, w której sekwencje starterów zostały całkowicie usunięte z biblioteki przed selekcją, a następnie zregenerowane, aby umożliwić amplifikację wybranych fragmentów genomowych. Jednakże, aby zastosować tę technikę, należy skonstruować unikalną bibliotekę genomową o ograniczonej różnorodności, a regeneracja po rundach selekcji opiera się na liniowym etapie reamplifikacji. Alternatywnie, próby uniknięcia problemów spowodowanych stałymi sekwencjami starterów poprzez zastosowanie wysokowydajnego rozdziału napotykają trudności związane z amplifikacją PCR ¹⁰.

Opracowaliśmy metodę selekcji bez użycia starterów (primer-free, PF), która znacznie upraszcza procedury SELEX i skutecznie eliminuje problemy związane z interferencją starterów ^{11, 12}. Protokoły te działają w sposób bezpośredni. Centralny randomowy region biblioteki jest oczyszczany bez dodatkowych sekwencji flankujących, a następnie wiązany z odpowiednim celem (na przykład z oczyszczonym białkiem lub złożonymi mieszaninami, takimi jak linie komórkowe). Następnie otrzymuje się sekwencje związane, łączy się je ponownie z sekwencjami flankującymi i przeprowadza reamplifikację w celu wygenerowania wybranych podbibliotek. Jako przykład wyselekcjonowaliśmy aptamery do białka S100B, będącego markerem czerniaka. Analizy wiązania wykazały wartości Kd w zakresie 10^-7 - 10^-8 M po kilku rundach selekcji; wykazujemy również, że aptamery te działają efektywnie w formacie wiązania typu kanapkowego (sandwich).

Protokół

1. Krótki opis protokołów selekcji bez użycia starterów

Bibliotekę dwuniciowego DNA przygotowano za pomocą PCR z zastosowaniem odpowiednich oligonukleotydów (Rysunki 1 i 2, Krok a), które zawierają centralną randomizowaną domenę o długości 30 nt, flankowaną przez dwa regiony starterów. Opracowano dwa nieco różniące się protokoły „bezstarterowe” (PF). W bibliotece dsDNA region 5' zawiera miejsce nacinania („nicking site”) dla endonukleazy Nt.BstNBI; enzym ten rozpoznaje dsDNA, ale przecina tylko jedną nić substratu DNA. Region 3' biblioteki dsDNA zawiera kolejne miejsce nacinania dla endonukleazy Nt.BbvCI, która również rozpoznaje dsDNA, ale przecina tylko jedną nić, pozostawiając CC na końcu 3' (PF₁), a także miejsce restrykcyjne dla endonukleazy BspMI, która przecina obie nici, nie pozostawiając dodatkowych nukleotydów na końcu 3' (PF₂). Zazwyczaj w pierwszej kolejności stosujemy protokół PF₁ (ponieważ łatwiej jest oddzielić fragmenty powstające podczas procesu selekcji; patrz poniżej), a w kolejnych rundach selekcji wykorzystujemy protokół PF₂.

Fragment 32 nt 5'-pN30-CC-3' (oznaczony jako fragment 32+) oraz fragment 30 nt 5'-pN30-3' (oznaczony jako fragment 30+) zostały wygenerowane odpowiednio poprzez trawienie biblioteki dsDNA za pomocą Nt.BbvCI/Nt.BstNBI lub BspMI/Nt.BstNBI, a następnie oczyszczone za pomocą elektroforezy żelowej. Fragment 32+ zawiera 30 nt losowej domeny z sekwencją flankującą CC na końcu 3' (PF₁). Fragment 30+ (PF₂) składa się wyłącznie z sekwencji 30 nt losowej domeny. Fragment „self-bridge” 66- (zawierający losowy region N30 z sekwencjami flankującymi 5' i 3') uzyskano w drodze oczyszczania żelowego (Nt.BbvCI lub Nt.BstNBI tną tylko górną nić „+”). Ten self-bridge jest otrzymywany bezpośrednio w protokole PF₁ lub może zostać wygenerowany i wyizolowany po przecięciu DNA biblioteki wyłącznie za pomocą NtBbv.CI lub Nt.BstNBI w protokole PF₂ (Rysunki 1 i 2, Krok b). Fragmenty 32+ lub 30+ inkubowano z oczyszczonymi białkami lub hodowanymi komórkami czerniaka, aby umożliwić wiązanie fragmentów z białkami lub komórkami, a następnie niezwiązane fragmenty wypłukano (Rysunki 1 i 2, Krok c). Związane lub wyselekcjonowane fragmenty wykorzystano do regeneracji regionów starterowych.

W reakcji hybrydyzacji/ligacji samomostek został wytworzony i oczyszczony jednocześnie z oczyszczaniem fragmentów 32+ i 30+; starter 5' był taki sam jak podczas konstrukcji biblioteki, a startery 3' zastąpiono dopasowanymi starterami, które zawierały dodatkowo promotor transkrypcji Sp6 na końcu 3' (Rycina 1 i 2, Krok d). Produkty reakcji hybrydyzacji/ligacji wykorzystano następnie do transkrypcji RNA in vitro (Rycina 1 i 2, Krok e). Po transkrypcji RNA zligowane DNA (w tym niewyselekcjonowany fragment DNA samomostka) poddano trawieniu DNazą I w celu usunięcia interferujących sekwencji tła. Dane z odwrotnej transkrypcji (RT)-PCR wykazały, że produkty zregenerowane za pomocą starterów zostały efektywnie reamplifikowane, co stanowi „rundę” selekcji (Rycina 1 i 2, Krok f). Amplifikacja tła widoczna przy wysokiej liczbie cykli w kontrolnej reakcji PCR bez RT może zostać całkowicie usunięta poprzez dodatkowe trawienie DNazą I i nie jest wykrywalna przy niższej liczbie cykli, którą stosujemy rutynowo.

Po 7 rundach selekcji scharakteryzowano właściwości wiązania aptamerów. Wartości Kd mieściły się w zakresie 10^-7 10^-8 M (Rysunek 3). W testach wiązania różne pary aptamerów wykazywały wiązanie addytywne, co wskazuje, że celują one w odmienne miejsca białka S100B. Przebadano zatem pary aptamerów w testach wiązania typu „kanapkowego” (sandwich), zarówno na szklanych mikromacierzach (slajdy Codelink) z użyciem drugich aptamerów znakowanych fluorescencyjnie, jak i na pochodnych nanodrutach złotych z drugimi aptamerami sprzężonymi z 50 nm nanocząsteczkami złota (AuNPs; Rysunek 3). W obu przypadkach specyficzność wiązania była wysoka: na mikromacierzach Codelink nie zaobserwowano wiązania typu kanapkowego w przypadku aptamerów, które nie wykazały wiązania addytywnego podczas oznaczania Kd. W przypadku pochodnych nanodrutów nie stwierdzono praktycznie żadnego wiązania z białkami nietarczowymi, a poszczególne kompleksy kanapkowe można zaobserwować dzięki sprzężonym z aptamerami AuNPs (Rysunek 3).

2. Materiały

2.1. Generowanie biblioteki PF DNA i reamplifikacja fragmentów związanych

Szczegóły opisano w publikacjach Pan i Clawson, 2009; Pan et al., 2008.

2.2. Selekcja w oparciu o oczyszczone białko

1. 20 mM Tris-HCl, pH 7.4
2. Fragment 32+ oraz Fragment 30+
3. Bufor do selekcji (2.5 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂ w 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4, Gibco)
4. Kuleczki agarozowe Ni-NTA (Qiagen)
5. Kolumna polipropylenowa (Qiagen)
6. Bufor wiążący (50 mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄, pH7.2, 150 mM NaCl)
7. Ekspresowane, oczyszczone białko S100B w buforze wiążącym (5 μg/μL)
8. Fenol:ChCl3:IAA (pH 7.9, Ambion)
9. 3 M NaAc, pH 5.2
10. Etanol 100% oraz 70%

2.3. Klonowanie TOPO i analiza sekwencyjna wybranych bibliotek dsDNA

1. produkty PCR wybrane w 7^th rundzie (można przeprowadzić dodatkowe rundy w celu dalszej optymalizacji wiązania aptameru)
2. Wektor pCR2.1-TOPO (Invitrogen)
3. Komórki DH5 Component (Invitrogen)
4. Zestaw Plasmid Mini Kit (Qiagen)
5. Starter M13 forward
6. Informax's Vector NTI (Invitrogen)

2.4. Charakterystyka wiązania aptamerów

1. Aptamery i oligonukleotydy kontrolne (N₃₀CC i N₃₀, IDT)
2. Kinaza polinukleotydowa T4 (New England Biolabs)
3. γ-³²P-ATP (3000 Ci/mmol; 10 μCi/ml)
4. Oczyszczone białko S100B w buforze wiążącym (5 μg/μL)

2.5. Testy wiązania typu kanapkowego z oczyszczonym białkiem S100B i wybranymi aptamerami

1. 1^st aptamer przyłączono albo do a.) szkiełek do mikromacierzy Codelink, albo do b.) nanodrutów Au.
2. Oczyszczone białko S100B, rozcieńczone do stężenia 0.125 μM w 70 μl dla a) lub 1 μM w 50 μl do b).
3. 2^nd aptamer został albo a.) znakowany Alexafluorem 546 w przypadku szkiełek do macierzy Codelink, lub b.) sprzężony z 50 nm AuNPs w badaniach z pochodnymi nanodrutów Au.

3. Metody

3.1. Generowanie biblioteki DNA PF

Szczegółowe metody i protokoły selekcji aptamerów można znaleźć w publikacjach Pan i Clawson, 2009; Pan i wsp., 2008.

3.2. Selekcja aptamerów z użyciem oczyszczonego białka S100B

Jako cel wykorzystano ludzkie białko wiążące wapń S100B (S100B. Gene ID#6285). Białko S100B z oznakowaniem His₆ (o długości 98 aminokwasów) wyeksprymowano i oczyszczono przy użyciu systemu QIAexpressionist (QIAGEN). W razie potrzeby lub wskazań, znacznik His₆ można usunąć enzymatycznie. W trakcie kolejnych rund selekcji 1 μL próbki z każdego etapu pobierano do pomiaru metodą ciekłosciintylacyjną w celu określenia ogólnej wydajności wiązania.

3.2.1. Przygotowanie fragmentów DNA biblioteki PF

1. Resuspend fragmenty 32⁺ i 30⁺ w 40 μL 20 mM Tris-HCl, pH 7,4.
2. Podgrzewaj przez 3 min w temperaturze 85°C, a następnie schładzaj do 37°C przez 3 min w inkubatorze ustawionym na 37°C.
3. Dodaj 760 μL buforu selekcyjnego (2,5 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂ w 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7,4, GIBCO) i inkubuj przez 3 min w 37°C, a następnie pozostaw w temperaturze pokojowej (RT) na 10 min.
4. Przepuść przez kolumnę wypełnioną kulkami agarozowymi Ni-NTA (QIAGEN) uprzednio przepłukanymi buforem selekcyjnym, a następnie przechowuj w RT do momentu użycia.

3.2.2. Przygotowanie S100B związanego z ziarnami agarozy Ni-NTA w temperaturze pokojowej

1. Odwirować 400 μL kulek agarozowych Ni-NTA przez 3 sec i usunąć nadsącz.
2. Przemyć kulki 400 μL buforu wiążącego (50 mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄, pH7.2, 150 mM NaCl), delikatnie pipetując 5 razy, a następnie odwirować i usunąć nadsącz.
3. Powtórzyć krok 2 dwukrotnie.
4. Dodać 400 μL oczyszczonego S100B (5 μg/μL, zawieszonego w buforze wiążącym) i delikatnie pipetować 5 razy co 3 min przez łącznie 15 min.
5. Odwirować i usunąć nadsącz.
6. Przemyć związane z kulkami białko S100B 400 μL buforu wiążącego, delikatnie pipetując 3 razy, a następnie odwirować i usunąć nadsącz.
7. Powtórzyć krok 6 dwukrotnie.

3.2.3. Wybór aptamerów wiążących S100B

1. Przenieś fragmenty 32+ i 30+ z etapu 3.2.1 do S100B związanego z kuleczkami.
2. Inkubuj przez 15 min, delikatnie mieszając co 3 min poprzez ostrożne pipetowanie.
3. Przemyj kompleks S100B-DNA 800 μL buforu wiążącego, delikatnie pipetując, następnie odwiruj i odlej supernatant.
4. Powtórz krok 3 dwukrotnie.

3.2.4. Odzyskiwanie aptamerów wyselekcjonowanych pod kątem S100B

1. Dodaj 200 μL 20 mM Tris-HCl (pH7.4), podgrzewaj przez 3 min w 85°C, mieszaj w vortexie przez 1 min i odwiruj, a następnie przenieś nadsącz do nowej probówki.
2. Powtórz krok 1 raz, a następnie połącz nadsącze.
3. Oczyść wybrane fragmenty DNA zgodnie z krokami 9-12 z poprzednich publikacji (11, 12).

3.2.5. Klonowanie TOPO i analiza sekwencjonowania w celu identyfikacji konsensusowych sekwencji aptamerów

1. Klonowanie produktów PCR wyselekcjonowanych w 10^th rundzie do wektora pCR2.1-TOPO (firmy Invitrogen). Dodatkowe klonowanie można przeprowadzić w miarę wykonywania kolejnych selekcji.
2. Sekwenowanie 40-50 pojedynczych kolonii z użyciem forwardowego startera M13 (korzystamy z usług Molecular Genetics Core Facility w Hershey Medical Center).
3. Wyrównanie wybranych sekwencji przy użyciu oprogramowania Vector NTI od Informax (Invitrogen).
4. Wyznaczenie sekwencji konsensusowych na podstawie uzyskanych wyrównań.
5. Następnie zamówiono aptamery konsensusowe z firmy Integrated DNA Technologies.

3.3. Testy wiązania typu kanapkowego z parami wybranych aptamerów

3.3.1. Format mikromacierzy z wykorzystaniem znakowanych fluorescencyjnie 2^nd aptamery

1. Aptamery Consensus 1^st zsyntezowano z grupą 5'-aminową C6. Zawieszono je w buforze do drukowania do końcowego stężenia 15 μM i naniesiono na płytki aktywowane Codelink (GE Healthcare/Amersham Biosciences) przy użyciu systemu Apogent Discoveries MicroGrid Arrayer w pracowni mikromacierzy DNA PSU (University Park), zgodnie z zalecanymi protokołami Codelink. Na każdej płytce wydrukowano 12 macierzy.
2. Hybrydyzację przeprowadzono w kasecie do hybrydyzacji mikromacierzy w formacie 2 x 8 (Array It, TeleChem International). Kaseta do mikromacierzy została uszczelniona wolną od nukleaz folią uszczelniającą (AlumaSeal II, Research Products International), aby zapobiec parowaniu.
3. Białko S100B rozcieńczono w PBS do odpowiedniego stężenia w objętości 70 μl i naniesiono do studzienek kasety mikromacierzy. Wiązanie z aptamerami wydrukowanymi na płytce Codelink trwało 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Studzienki kasety płukano następnie indywidualnie 3 razy buforem PBS + 5 mM MgCl₂ (PBSM), a nadmiar buforu do płukania odsączano. Aptamery znakowane fluorescencyjnie rozcieńczono w PBSM do stężenia 0,125 μM w objętości 70 μl, a następnie podgrzano do 85 °C przez 3 minuty, po czym inkubowano przez 3 minuty na lodzie. Aptamery naniesiono do studzienek kasety mikromacierzy i inkubowano przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Studzienki ponownie płukano indywidualnie 3 razy buforem PBSM. Następnie rozdzielono kasetę, a całą płytkę opłukano w PBSM. Płytkę dokładnie osuszono przez wirowanie, a następnie przeskanowano za pomocą skanera Packard Biosciences ScanArray 4000XL (Perkin Elmer).

3.3.2. Format nanodrutu z pochodną przy użyciu 2^nd aptamerów sprzężonych z 50 nm AuNPs

Złote NW (~5 μM długości, 320 nm średnicy) zsyntetyzowano metodą elektrodepozycji galwanostatycznej w porowatych membranach tlenkowych glinu zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami (13, 14). Po rozpuszczeniu porowatej membrany nanodruty zawieszono ponownie w 1 mL etanolu.

Jak wspomniano, DNA zakupiono od Integrated DNA Technologies. Nanocząsteczki złota (50 nm) zakupiono od Ted Pella. DNA tiolowane poddano odszczepieniu za pomocą 100 mM DTT w 0.1 M fosforanie sodu o pH 8.3 przez jedną godzinę, a następnie oczyszczono przy użyciu kolumny Centri-spin 10.

Przyłączanie aptamerów do złotych nanodrutów i nanocząsteczek

Aliquot 50 μL nanodrutów Au przeniesiono do nieprzylegającej probówki wirówkowej o pojemności 0,5 mL i przepłukano w 10 mM buforze fosforanowym, 300 mM NaCl, pH 7.4. DNA tiolowane na końcu 5' (z 10 T spacerem na końcu 5') dodano do drutów do końcowego stężenia 0,4 μM. Próbkę mieszano w wortexie przez 30 min, a następnie przepłukano poprzez wirowanie (8100 g) trzykrotnie w 10 mM buforze fosforanowym, 300 mM NaCl, pH 7.4 oraz trzykrotnie w 50 mM buforze fosforanowym, 5 mM MgCl₂, pH 7.2. Druty pokryte DNA resuspendowano w 100 μL buforu, aby dwukrotnie rozcieńczyć zawiesinę.

Nanocząsteczki złota (AuNPs) z pochodnymi DNA przygotowano poprzez dodanie 50 μl 100 mM 2^nd aptamer (z łącznikiem składającym się z 10 reszt T na końcu 5') do 1 ml AuNP o rozmiarze 50 nm i podgrzano do 37°C przez jedną godzinę. Po podgrzewaniu dodano 10 mM bufor fosforanowy sodu, 1M NaCl, pH 7,4 (25 μL dwukrotnie, a następnie 100 μL, 150 μLoraz 128 μL) w odstępach 0,5 godziny. Konjugaty pozostawiono na 37°C blok grzejny przez noc przed użyciem. Próbki płukano 3 razy buforem fosforanowym 50 mM, 5 mM MgCl2₂, pH 7,2. Konjugaty zawieszono ponownie w 120 μL bufor

Hybrydyzacja typu kanapkowego na NWs

Do buforu w probówkach do PCR dodano 1 μL rozcieńczonych drutów pokrytych DNA. Dodano białko S100B lub białko kontrolne HtrA1 (1 μg/μL), aby uzyskać końcowe stężenie 1 μM w 50 μL buforu (~ 10-12 cząsteczek białka na nanometr kwadratowy powierzchni nanodrutu Au). Próbki mieszano w wortexie przez ~ 2 h. Druty płukano poprzez wirowanie (8100 g) trzykrotnie buforem fosforanowym 50 mM, 5 mM MgCl₂, pH 7.2, a następnie każdą porcję resuspenderowano w 20 μL koniugatów AuNP/DNA. Druty mieszano w koniugatach w wortexie przez 2 h, a następnie płukano 5 razy poprzez wirowanie (1300 g) buforem fosforanowym 50 mM, 5 mM MgCl₂, pH 7.2, aby usunąć nadmiar nanocząsteczek. Próbki resuspenderowano w 20 μL buforu i osuszono na waflach krzemowych pokrytych Au do analizy FE-SEM.

Obrazy FE-SEM nanodrutów uzyskano za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z emisją polową Leo 1530, wykorzystując źródło elektronów z emisją polową Schottky’ego przy napięciu roboczym 5.00 kV.

4. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. Protokoły bez startera 5' (PF₁) oraz bez startera (PF₂).

(A) Protokół selekcji aptamerów DNA PF₁. Oligonukleotydy z biblioteki są wyżarzane, a następnie poddawane amplifikacji PCR w celu uzyskania dwuniciowej biblioteki DNA (a). Losowy region pozbawiony primera na końcu 5' (PF₁) z jednoniciowych bibliotek DNA PF jest przygotowywany poprzez trawienie enzymami Nt.BstNBI /Nt.BbvCI (miejsca cięcia zaznaczono czerwonymi grotami strzałek) oraz oczyszczanie w żelu, a sam mostek (czarna strzałka) jest izolowany poprzez oczyszczanie w żelu (b). Po selekcji (c), wyselekcjonowane sekwencje (oznaczone jako pS30-CC) są hybrydyzowane z odpowiadającymi im oligomerami oraz mostkiem, a następnie ligowane w celu regeneracji wcześniej usuniętych regionów primerów. Na tym etapie wprowadza się primery zawierające promotor Sp6 na końcu 3' (d). Są one następnie wykorzystywane do transkrypcji RNA zawierającego wyselekcjonowane regiony (e). Na koniec RNA jest wyłącznie reamplifikowane (matrycowe DNA jest trawione) za pomocą RT-PCR (f), a wyselekcjonowana subbiblioteka jest gotowa do kolejnej rundy selekcji.

(B) Protokół selekcji DNA-aptamerów PF₂. Oligonukleotydy biblioteki są ze sobą hybrydyzowane i poddawane amplifikacji PCR w celu uzyskania dwuniciowej biblioteki DNA (a). Pozbawiony starterów (PF₂) region losowy z jednoniciowej biblioteki DNA PF jest przygotowywany poprzez trawienie enzymami Nt.BstNBI/BspMI (miejsca cięcia zaznaczono grotami strzałek) oraz oczyszczanie w żelu. Samomostek (self-bridge) jest izolowany albo z protokołu PF₁, i/lub poprzez pojedyncze trawienie biblioteki wyjściowej enzymem Nt.BstNBI (b), w połączeniu z oczyszczaniem w żelu. Po selekcji (c), wyselekcjonowane sekwencje (oznaczone jako pS30) są hybrydyzowane z odpowiadającymi im oligomerami oraz samomostkiem, a następnie ligowane w celu odtworzenia wcześniej usuniętych regionów starterów. Podobnie jak w PF₁, wprowadza się startery zawierające promotor Sp6 na końcu 3' (d). Jest on następnie wykorzystywany do transkrypcji RNA zawierającego wyselekcjonowane regiony (e). RNA jest następnie reamplifikowane wyłącznie za pomocą RT-PCR (f), a wybrana subbiblioteka jest gotowa do kolejnej rundy selekcji.

Rysunek 2. Przedstawienie schematyczne i wyniki eksperymentalne/wdrożenie do praktyki protokołu selekcji PF. Wyznaczone kroki odpowiadają tym przedstawionym na Rysunku 1. Po trawieniu biblioteki PF stworzonej metodą PCR (krok a) za pomocą endonukleaz restrykcyjnych (zgodnie z oznaczeniem), produkty trawienia rozdzielono za pomocą PAGE na żelu 10% w warunkach denaturujących. Przedstawiono odpowiednie fragmenty otrzymane za pomocą protokołów selekcji PF₁ i PF₂ (krok b). Po selekcji (krok c), związane aptamery są hybrydyzowane z odpowiadającymi im oligomerami oraz automostkiem, a następnie ligowane w celu regeneracji uprzednio usuniętych regionów starterów. Na końcu 3' wprowadzono startery zawierające promotor Sp6 na końcu 3' (krok d). RNA znakowane ³²P transkrybowano, wykorzystując ligowane produkty w ilościach 1, 0,5, 0,25, 0,125 μl z reakcji o objętości 5 μl, a następnie rozdzielono za pomocą PAGE na żelach 6% w warunkach denaturujących (krok e). Transkrypty poddano następnie działaniu DNazy w celu usunięcia nie wybranych losowych regionów DNA, przeprowadzono odwrotną transkrypcję do cDNA, a następnie ponownie amplifikowano przez 7, 14, 21 lub 28 cykli PCR. Produkty rozdzielono za pomocą PAGE na żelach 8% w warunkach niedenaturujących. Fragment o długości 66 nt reprezentuje produkt o pełnej długości zawierający wyselekcjonowane sekwencje pS30-CC i pS30 ponownie osadzone w obrębie flankujących sekwencji 5' i 3'. Migrację markerów PhiX174/HinfI przedstawiono po lewej stronie (krok f). Kontrole obejmowały pominięcie etapu odwrotnej transkrypcji (RT). W takich próbkach przy wysokiej liczbie cykli można było zaobserwować niewielką ilość produktu; prawdopodobnie można to całkowicie wyeliminować poprzez drugi (lub przedłużony) etap trawienia DNazą.

Rycina 3. Charakterystyka wiązania wybranych aptamerów i ich zastosowanie w układzie kanapkowym.
A. Zależne od stężenia wiązanie aptamerów znakowanych ³²P w celu wyznaczenia Kd. Aptamery zostały znakowane na końcach 5' przy użyciu g- ³²P-ATP (3000Ci/mmol, ~ 10 mCi) oraz kinazy polinukleotydowej T4 (New England Biolabs), a wiązanie określono zgodnie z opisem.

B. 1 z pochodną 5'-aminową^st Aptamery sprzężono z mikromacierzami Codelink. Oczyszczone białko S100B związano z 1^{Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.} aptameru, preparaty dokładnie wypłukano, a następnie zastosowano znakowany AlexaFluor546 2^nd aptamer został związany z 1^st kompleksy aptamer:S100B. Po dokładnym płukaniu natężenie fluorescencji zmierzono za pomocą skanera ScanArray.

C. 5'-tiolowany 1^st Aptamery połączono z nanodrutami Au, wykorzystując standardową chemię tiolową. 2^nd aptamery sprzęgnięto z 50 nm AuNP w ten sam sposób. Następnie do zderunkcjonowanych nanodrutów przywiązano najpierw oczyszczone białko S100B (lewo) lub oczyszczone białko kontrolne HtrA1 (prawo). Po dokładnym przemyciu 2^nd następnie związano aptamer-50 nm AuNPs z 1^{Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.}kompleksy aptamer-nanodrut:S100B. Po dokładnym przemyciu związane kompleksy kanapkowe zwizualizowano przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej z emisją polową. Paski skali = 1 μm.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tris-HCl
Polimeraza DNA HotMaster TAQ	5 PRIME
Mieszanka dNTP	Sigma-Aldrich
Akrylamid	Fisher Scientific
Bufor UltraPure 10X TBE	Invitrogen
Persiarczan amonu	Bio-Rad
TEMED	Fisher Scientific
Marker DNA PhiX174 DNA/Hinf I	Promega Corp.
Bro מקid etydynyum
α-32P-dCTP
Fenol:CHCl3:IAA	Ambion
NaCl
Etanol
Enzymy restrykcyjne	New England Biolabs
Mocznik	Fisher Scientific
Film fotograficzny	ECE Scientific
PBS	GIBCO, by Life Technologies
CaCl2	GIBCO, by Life Technologies
MgCl2	GIBCO, by Life Technologies
Kuleczki agarozowe Ni-NTA	Qiagen
Kolumna polipropylenowa	Qiagen
NaHPO4
NaAc
Komórki Detroit-551
Komórki SK-MEL-31
MEM
TrypLE Express	GIBCO, by Life Technologies
Ligaza DNA T4	New England Biolabs
Dimetylosulfotlenek	Promega Corp.
Polimeraza RNA Sp6	Promega Corp.
DNaza I wolna od RNaz	Promega Corp.
Inhibitor RNazy	Promega Corp.
SensiScript odwrotna transkryptaza	Qiagen
Wektor pCR-2.1-TOPO	Invitrogen
Komórki kompetentne DH5α	Invitrogen
Zestaw do minipreparatykiki plazmidów	Qiagen
Vector NTI	Invitrogen
Polinukleotydowa kinaza T4	New England Biolabs
γ-32P-ATP