Selekcja aptamerów bez użycia starterów z wykorzystaniem losowej biblioteki DNA

Podsumowanie

Protokoły SELEX obejmują wiele rund selekcji, z których każda wymaga regeneracji związanych ligandów, co z kolei wymaga stałych sekwencji starterów flankujących regiony losowej biblioteki. Te stałe sekwencje starterów mogą zakłócać proces selekcji (powodując wyniki fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne). Przedstawiamy tutaj protokół bez użycia starterów.

Streszczenie

Aptamery to silnie ustrukturyzowane oligonukleotydy (DNA lub RNA), które mogą wiązać się z celami z powinowactwem porównywalnym do przeciwciał ¹. Są one identyfikowane poprzez proces selekcji in vitro zwany SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment), aby rozpoznawać szeroką gamę celów, od małych cząsteczek po białka i inne makrocząsteczki ^2-4. Aptamery posiadają właściwości, które dobrze nadają się do diagnostycznych i/lub terapeutycznych zastosowań in vivo: poza dobrą swoistością i powinowactwem, są one łatwo syntetyzowane, wytrzymują bardziej rygorystyczne warunki przetwarzania, charakteryzują się niską immunogennością, a ich stosunkowo niewielki rozmiar może skutkować łatwiejszą penetracją tkanek.

Aptamery identyfikowane za pomocą standardowego procesu SELEX zazwyczaj składają się z około 80 nukleotydów (nt), ponieważ są one typowo selekcjonowane z bibliotek kwasów nukleinowych z randomizowanymi regionami o długości ok. 40 nt oraz stałymi miejscami dla starterów o długości ok. 20 nt po każdej stronie. Stałe sekwencje starterów mogą zatem stanowić blisko 50% sekwencji biblioteki, co może w sposób pozytywny lub negatywny wpływać na identyfikację aptamerów w procesie selekcji ³, choć podejścia bioinformatyczne sugerują, że stałe sekwencje nie przyczyniają się znacząco do struktury aptameru po selekcji ⁵. Aby rozwiązać te potencjalne problemy, sekwencje starterów blokowano za pomocą komplementarnych oligonukleotydów lub zmieniano na inne sekwencje w połowie rund SELEX ⁶, bądź przycinano je do 6-9 nt ^{7, 8}. Wen i Gray ⁹ opracowali metodę genomowego SELEX bez użycia starterów, w której sekwencje starterów zostały całkowicie usunięte z biblioteki przed selekcją, a następnie zregenerowane, aby umożliwić amplifikację wybranych fragmentów genomowych. Jednakże, aby zastosować tę technikę, należy skonstruować unikalną bibliotekę genomową o ograniczonej różnorodności, a regeneracja po rundach selekcji opiera się na liniowym etapie reamplifikacji. Alternatywnie, próby uniknięcia problemów spowodowanych stałymi sekwencjami starterów poprzez zastosowanie wysokowydajnego rozdziału napotykają trudności związane z amplifikacją PCR ¹⁰.

Opracowaliśmy metodę selekcji bez użycia starterów (primer-free, PF), która znacznie upraszcza procedury SELEX i skutecznie eliminuje problemy związane z interferencją starterów ^{11, 12}. Protokoły te działają w sposób bezpośredni. Centralny randomowy region biblioteki jest oczyszczany bez dodatkowych sekwencji flankujących, a następnie wiązany z odpowiednim celem (na przykład z oczyszczonym białkiem lub złożonymi mieszaninami, takimi jak linie komórkowe). Następnie otrzymuje się sekwencje związane, łączy się je ponownie z sekwencjami flankującymi i przeprowadza reamplifikację w celu wygenerowania wybranych podbibliotek. Jako przykład wyselekcjonowaliśmy aptamery do białka S100B, będącego markerem czerniaka. Analizy wiązania wykazały wartości Kd w zakresie 10^-7 - 10^-8 M po kilku rundach selekcji; wykazujemy również, że aptamery te działają efektywnie w formacie wiązania typu kanapkowego (sandwich).

Protokół

1. Krótki opis protokołów selekcji bez użycia starterów

Bibliotekę dwuniciowego DNA przygotowano za pomocą PCR z zastosowaniem odpowiednich oligonukleotydów (Rycina 1 i 2, Krok a), które zawierają centralną losową domenę o długości 30 nt, flankowaną przez dwa regiony starterowe. Opracowano dwa nieco różniące się protokoły „bezstarterowe” (PF). W bibliotece dsDNA region 5' zawiera miejsce nacięcia (nicking site) dla endonukleazy Nt.BstNBI; enzym ten rozpoznaje dsDNA, ale przecina tylko jedną nić substratu DNA. Region 3' biblioteki dsDNA zawiera kolejne miejsce nacięcia dla endonukleazy Nt.BbvCI, która również rozpoznaje dsDNA, ale przecina tylko jedną nić, pozostawiając CC na końcu 3' (PF₁), a także miejsce restrykcyjne dla endonukleazy BspMI, która przecina obie nici, nie pozostawiając dodatkowych nukleotydów na końcu 3' (PF₂). Zazwyczaj początkowo stosujemy protokół PF₁ (ponieważ łatwiej jest oddzielić fragmenty powstałe podczas procesu selekcji; patrz poniżej), a następnie stosujemy protokół PF₂ w kolejnych rundach selekcji.

Fragment 32 nt 5'-pN30-CC-3' (oznaczony jako fragment 32+) oraz fragment 30 nt 5'-pN30-3' (oznaczony jako fragment 30+) zostały odpowiednio wygenerowane poprzez cięcie biblioteki dsDNA za pomocą Nt.BbvCI/Nt.BstNBI lub BspMI/Nt.BstNBI, a następnie oczyszczone za pomocą elektroforezy żelowej. Fragment 32+ zawiera randomową domenę 30 nt z flankującą sekwencją CC na końcu 3' (PF₁). Fragment 30+ (PF₂) składa się wyłącznie z sekwencji randomowej domeny 30 nt. Fragment „self-bridge” 66- (zawierający randomowy region N30 z flankującymi sekwencjami 5' i 3') uzyskano poprzez oczyszczanie żelowe (Nt.BbvCI lub Nt.BstNBI tną tylko górną nić „+”). Ten self-bridge jest otrzymywany bezpośrednio w protokole PF₁ lub może zostać wygenerowany i wyizolowany po cięciu DNA biblioteki za pomocą wyłącznie NtBbv.CI lub Nt.BstNBI w protokole PF₂ (Rycina 1 i 2, Krok b). Fragmenty 32+ lub 30+ inkubowano z oczyszczonymi białkami lub hodowanymi komórkami czerniaka, aby umożliwić wiązanie fragmentów z białkami lub komórkami, a następnie niewiązane fragmenty wypłukano (Rycina 1 i 2, Krok c). Związane lub wyselekcjonowane fragmenty wykorzystano do regeneracji regionów starterowych.

W reakcji hybrydyzacji/ligacji samomostek został wytworzony i oczyszczony jednocześnie z oczyszczaniem fragmentów 32+ i 30+; starter końca 5' był taki sam jak podczas konstrukcji biblioteki, a startery końca 3' zastąpiono dopasowanymi starterami, które zawierały również dodatkowy promotor transkrypcji Sp6 na końcu 3' (Rycina 1 i 2, Krok d). Produkty reakcji hybrydyzacji/ligacji zostały następnie wykorzystane do transkrypcji RNA in vitro (Rycina 1 i 2, Krok e). Po transkrypcji RNA zligowane DNA (w tym niewyselekcjonowany fragment DNA samomostka) zostały poddane trawieniu DNazą I w celu usunięcia interferujących sekwencji tła. Dane z RT-PCR (reakcji łańcuchowej polimerazy po odwrotnej transkrypcji) wykazały, że produkty zregenerowane za pomocą starterów zostały efektywnie reamplifikowane, co stanowiło „rundę” selekcji (Rycina 1 i 2, Krok f). Amplifikacja tła widoczna przy wysokiej liczbie cykli w kontrolnym PCR bez odwrotnej transkrypcji (no-RT) może zostać całkowicie usunięta poprzez dodatkowe trawienie DNazą I i nie jest wykrywalna przy niższej liczbie cykli, którą stosujemy rutynowo.

Po 7 rundach selekcji zcharakteryzowano właściwości wiązania aptamerów. Wartości Kd mieściły się w zakresie 10^-7 10^-8 M (Rycina 3). W testach wiązania różne pary aptamerów wykazały wiązanie addytywne, co wskazuje, że celują one w odrębne miejsca białka S100B. Przetestowano zatem pary aptamerów w testach wiązania typu „sandwich”, zarówno na szklanych mikromacierzach (slajdy Codelink) przy użyciu drugich aptamerów znakowanych fluorescencyjnie, jak i na zderywatyzowanych nanodrutach złota z drugimi aptamerami sprzężonymi z 50 nm nanocząstkami złota (AuNPs; Rycina 3). W obu przypadkach swoistość wiązania była wysoka: na mikromacierzach Codelink nie zaobserwowano wiązania typu sandwich w przypadku aptamerów, które nie wykazywały wiązania addytywnego w oznaczeniach Kd. W przypadku zderywatyzowanych nanodrutów nie zaobserwowano praktycznie żadnego wiązania z białkami niebędącymi celem, a poszczególne kompleksy typu sandwich można było zaobserwować dzięki sprzężonym z aptamerami AuNPs (Rycina 3).

2. Materiały

2.1. Generowanie biblioteki DNA PF i ponowna amplifikacja związanych fragmentów

Szczegóły opisano w pracy Pan i Clawson, 2009; Pan et al., 2008.

2.2. Selekcja oparta na oczyszczonym białku

1. 20 mM Tris-HCl, pH 7.4
2. Fragment 32+ oraz Fragment 30+
3. Bufor do selekcji (2.5 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂ w 1X soli fizjologicznej z buforem fosforanowym, pH 7.4, Gibco)
4. Kuleczki agarozowe Ni-NTA (Qiagen)
5. Kolumna polipropylenowa (Qiagen)
6. Bufor wiążący (50 mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄, pH7.2, 150 mM NaCl)
7. Wyekspresowane, oczyszczone białko S100B w buforze wiążącym (5 μg/μL)
8. Fenol:ChCl3:IAA (pH 7.9, Ambion)
9. 3 M NaAc, pH 5.2
10. Etanol 100% oraz 70%

2.3. Klonowanie TOPO i analiza sekwencjonowania wybranych bibliotek dsDNA

1. produkty PCR wybrane w 7^mej rundzie (można przeprowadzić dodatkowe rundy w celu dalszej optymalizacji wiązania aptameru)
2. Wektor pCR2.1-TOPO (Invitrogen)
3. Komórki DH5 Component (Invitrogen)
4. Zestaw Plasmid Mini Kit (Qiagen)
5. Starter M13 forward
6. Oprogramowanie Informax's Vector NTI (Invitrogen)

2.4. Charakterystyka wiązania aptamerów

1. Aptamery i oligonukleotydy kontrolne (N₃₀CC i N₃₀, IDT)
2. Kinaza polinukleotydowa T4 (New England Biolabs)
3. γ-³²P-ATP (3000 Ci/mmol; 10 μCi/ml)
4. Oczyszczone białko S100B w buforze wiążącym (5 μg/μL)

2.5. Testy wiązania typu kanapkowego z oczyszczonym białkiem S100B i wybranymi aptamerami

1. 1^st aptamer sprzęgnięto albo z a.) płytkami do mikromacierzy Codelink, albo z b.) nanodrutami Au.
2. Oczyszczone białko S100B, rozcieńczone do stężenia 0,125 μM w 70 μl dla a) lub 1 μM w 50 μl dla b).
3. 2^nd aptamer oznakowano albo a.) barwnikiem Alexafluor 546 w przypadku szkiełek do matryc Codelink, albo b.) sprzęgnięto z 50 nm AuNP na potrzeby badań z wykorzystaniem zderwatyzowanych nanodrutów Au.

3. Metody

3.1. Generowanie biblioteki DNA PF

Szczegółowe metody i protokoły selekcji aptamerów można znaleźć w publikacjach Pan i Clawson, 2009; Pan et al., 2008.

3.2. Selekcja aptamerów z wykorzystaniem oczyszczonego białka S100B

Jako cel wykorzystano ludzkie białko wiążące wapń S100B (S100B, Gene ID#6285). Białko S100B z dodatkiem znacznika His₆ (o długości 98 aminokwasów) wyprodukowano i oczyszczono przy użyciu systemu QIAexpressionist (QIAGEN). W razie potrzeby lub wskazań, znacznik His₆ można usunąć enzymatycznie. W trakcie kolejnych rund selekcji pobierano próbkę o objętości 1 μL z każdego etapu do pomiaru w cieczscyntylacyjnym liczniku w celu określenia całkowitej wydajności wiązania.

3.2.1. Przygotowanie fragmentów DNA biblioteki PF

1. Resuspender fragmenty 32⁺ i 30⁺ w 40 μL 20 mM Tris-HCl, pH 7.4.
2. Ogrzewać przez 3 min w temperaturze 85°C, a następnie schłodzić do 37°C przez 3 min w inkubatorze ustawionym na 37°C.
3. Dodać 760 μL buforu selekcyjnego (2.5 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂ w 1X roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym, pH 7.4, GIBCO) i inkubować przez 3 min w 37°C, a następnie pozostawić w temperaturze pokojowej (RT) na 10 min.
4. Przepuścić przez kolumnę zawierającą koraliki agarozowe Ni-NTA (QIAGEN) uprzednio przemyte buforem selekcyjnym, a następnie przechowywać w RT do momentu użycia.

3.2.2. Przygotowanie S100B związanego z kuleczkami agarozy Ni-NTA w temperaturze pokojowej

1. Odwiruj 400 μL kulek agarozowych Ni-NTA przez 3 s i odlej nadsącz.
2. Przemyj kulki 400 μL buforu wiążącego (50 mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄, pH7.2, 150 mM NaCl), delikatnie pipetując 5 razy, następnie odwiruj i odlej nadsącz.
3. Powtórz krok 2 dwukrotnie.
4. Dodaj 400 μL oczyszczonego białka S100B (5 μg/μL, zawieszonego w buforze wiążącym) i delikatnie pipetuj 5 razy co 3 min przez łącznie 15 min.
5. Odwiruj i odlej nadsącz.
6. Przemyj związane z kulkami białko S100B 400 μL buforu wiążącego, delikatnie pipetując 3 razy, następnie odwiruj i odlej nadsącz.
7. Powtórz krok 6 dwukrotnie.

3.2.3. Wybór aptamerów wiążących S100B

1. Przenieś fragmenty 32+ oraz 30+ z etapu 3.2.1 do S100B związanego z kuleczkami.
2. Inkubuj przez 15 min, mieszając delikatnie co 3 min za pomocą pipetowania.
3. Przemyj kompleks S100B-DNA 800 μL buforu wiążącego, delikatnie pipetując, następnie odwiruj i odlej nadsącz.
4. Powtórz krok 3 dwukrotnie.

3.2.4. Odzyskiwanie aptamerów wyselekcjonowanych pod kątem S100B

1. Dodać 200 μL 20 mM Tris-HCl (pH7.4), inkubować przez 3 min w temperaturze 85°C, mieszać w wirówce typu vortex przez 1 min i odwirować, a następnie przenieść nadsącz do nowej probówki.
2. Powtórzyć krok 1 raz, a następnie połączyć nadsącze.
3. Oczyścić wybrane fragmenty DNA zgodnie z krokami 9-12 z poprzednich publikacji (11, 12).

3.2.5. Klonowanie TOPO i analiza sekwencjonowania w celu identyfikacji konsensusowych sekwencji aptamerów

1. Klonujemy produkty PCR wybrane w 10^tej rundzie do wektora pCR2.1-TOPO (firmy Invitrogen). Dodatkowe klonowanie można przeprowadzać w miarę dalszych selekcji.
2. Sekwencjonujemy 40–50 pojedynczych kolonii przy użyciu przedłużacza M13 forward (korzystamy z usług Molecular Genetics Core Facility w Hershey Medical Center).
3. Wybrane sekwencje dopasowujemy za pomocą programu Vector NTI firmy Informax (Invitrogen).
4. Na podstawie dopasowań wyznaczamy sekwencje konsensusowe.
5. Aptamery konsensusowe zostają następnie zamówione z firmy Integrated DNA Technologies.

3.3. Testy wiązania typu kanapkowego z parami wybranych aptamerów

3.3.1. Format mikromacierzy z wykorzystaniem znakowanych fluorescencyjnie aptamerów drugich (2^nd).

1. Aptamery konsensus 1^st zsyntezowano z grupą 5'-amineC6. Zawieszono je w buforze do drukowania do stężenia końcowego 15 μM, a następnie naniesiono na płytki aktywowane Codelink (GE Healthcare/Amersham Biosciences) przy użyciu urządzenia Apogent Discoveries MicroGrid Arrayer w pracowni mikromacierzy DNA (PSU, University Park), zgodnie z zalecanymi protokołami Codelink. Na każdej płytce wydrukowano 12 macierzy.
2. Hybrydyzację przeprowadzono w kasecie do hybrydyzacji mikromacierzy w formacie 2 x 8 (Array It, TeleChem International). Kaseta do mikromacierzy została uszczelniona wolną od nukleaz folią uszczelniającą (AlumaSeal II, Research Products International), aby zapobiec parowaniu.
3. Białko S100B rozcieńczono w PBS do odpowiedniego stężenia w objętości 70 μl i naniesiono do dołków kasety mikromacierzy. Wiązanie z aptamerami naniesionymi na płytkę Codelink trwało 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie dołki kasety płukano pojedynczo 3 razy PBS + 5 mM MgCl₂ (PBSM), a nadmiar buforu płuczącego usuwano poprzez odsączanie. Aptamery znakowane fluorescencyjnie rozcieńczono w PBSM do stężenia 0,125 μM w objętości 70 μl, a następnie podgrzano do 85 °C przez 3 minuty, po czym schłodzono na lodzie przez 3 minuty. Aptamery naniesiono do dołków kasety mikromacierzy i inkubowano przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Dołki ponownie płukano pojedynczo 3 razy PBSM. Następnie rozebrano kasetę, a całą płytkę opłukano w PBSM. Płytkę dokładnie osuszono poprzez wirowanie, a następnie przeskanowano za pomocą skanera Packard Biosciences ScanArray 4000XL (Perkin Elmer).

3.3.2. Format nanowire'ów zderywatyzowanych przy użyciu 2^nd aptamerów sprzężonych z 50 nm AuNPs

Nanodruty (NWs) ze złota (o długości ~5 μM i średnicy 320 nm) zsyntezowano poprzez elektroosadzanie galwanostatyczne w porowatych membranach aluimnowych zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami (13, 14). Po rozpuszczeniu porowatej membrany nanodruty zawieszono ponownie w 1 mL etanolu.

Jak wspomniano, DNA zakupiono w firmie Integrated DNA Technologies. Nanocząstki złota (50 nm) zakupiono w firmie Ted Pella. Thiolowane DNA poddano trawieniu za pomocą 100 mM DTT w 0,1 M fosforanie sodu o pH 8,3 przez jedną godzinę, a następnie oczyszczono w kolumnie Centri-spin 10.

Przyłączanie aptamerów do złotych NW i NP

Aplikację 50 μL nanodrutów Au umieszczono w 0,5 mL nieprzywierającej probówce wirówkowej i wypłukano w buforze fosforanowym 10 mM, NaCl 300 mM, pH 7,4. DNA z tiolowaną końcówką 5' (z łącznikiem 10 T na końcu 5') dodano do drutów do końcowego stężenia 0,4 μM. Próbkę mieszano w wstrząsarze wortexowym przez 30 min, a następnie płukano poprzez wirowanie (8100 g) trzykrotnie buforem fosforanowym 10 mM, NaCl 300 mM, pH 7,4 oraz trzykrotnie buforem fosforanowym 50 mM, MgCl₂ 5 mM, pH 7,2. Druty pokryte DNA resuspensionowano w 100 μL buforu, aby rozcieńczyć je dwukrotnie.

AuNP pochodne DNA przygotowano poprzez dodanie 50 μl 100 mM 2^nd aptameru (z łącznikiem z 10 T na końcu 5') do 1 mL 50 nm AuNP i inkubowanie w temperaturze 37°C przez jedną godzinę. Po podgrzewaniu dodawano 10 mM bufor fosforanowy sodu, 1M NaCl, pH 7.4 (25 μL dwukrotnie, a następnie 100 μL, 150 μL i 128 μL) w odstępach 0,5 godziny. Konjugaty pozostawiono na bloku grzejnym w temperaturze 37°C przez noc przed użyciem. Próbki płukano 3 razy buforem fosforanowym 50 mM, 5 mM MgCl₂, pH 7.2. Konjugaty resuspenderowano w 120 μL buforu.

Hybrydyzacja typu kanapkowego na nanowłóknach

Druty powlekane DNA, w ilości 1 μL roztworu, dodano do buforu w probówkach PCR. Dodano białko S100B lub białko kontrolne HtrA1 (1 μg/μL), aby uzyskać stężenie końcowe 1 μM w 50 μL buforu (~ 10-12 cząsteczek białka na nanometr kwadratowy powierzchni nanodrutu Au). Próbki mieszano w wortexerze przez ~ 2 h. Druty płukano poprzez wirowanie (8100 g) trzykrotnie buforem fosforanowym 50 mM, 5 mM MgCl₂, pH 7.2, a następnie każdą z próbek resuspendowano w 20 μL koniugatów AuNP/DNA. Druty mieszano w wortexerze w koniugatach przez 2 h, a następnie płukano 5 razy poprzez wirowanie (1300 g) buforem fosforanowym 50 mM, 5 mM MgCl₂, pH 7.2, aby usunąć nadmiar nanocząsteczek. Próbki resuspendowano w 20 μL buforu i osuszono na waflach krzemowych powlekanych Au do analizy FE-SEM.

Obrazy FE-SEM nanodrutów uzyskano za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z emiterem polowym Leo 1530, wykorzystując źródło elektronów z emisją polową Schottky’ego przy napięciu roboczym 5,00 kV.

4. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. Protokoły bez primera 5' (PF₁) oraz bez primera (PF₂).

(A) Protokół selekcji aptamerów DNA PF₁. Oligonukleotydy biblioteczne są ze sobą hybrydyzowane i poddawane amplifikacji PCR w celu uzyskania dwuniciowej biblioteki DNA (a). Region losowy pozbawiony primera na końcu 5' (PF₁) z jednoniciowych bibliotek DNA PF jest przygotowywany poprzez trawienie enzymami Nt.BstNBI /Nt.BbvCI (miejsca cięcia zaznaczono czerwonymi grotami strzałek) oraz oczyszczanie w żelu, a sam mostek (czarna strzałka) jest izolowany poprzez oczyszczanie w żelu (b). Po selekcji (c) wybrane sekwencje (oznaczone jako pS30-CC) są hybrydyzowane z odpowiadającymi im oligomerami oraz mostkiem, a następnie ligowane w celu odtworzenia wcześniej usuniętych regionów primerów. Na tym etapie wprowadza się primery zawierające promotor Sp6 na końcu 3' (d). Służy to następnie do transkrypcji RNA zawierającego wybrane regiony (e). Na koniec RNA jest selektywnie reamplifikowane (matrycowe DNA jest trawione) przy użyciu RT-PCR (f), a wybrana podbiblioteka jest gotowa do kolejnej rundy selekcji.

(B) Protokół selekcji DNA-aptamerów PF₂. Oligonukleotydy biblioteki są denaturowane i poddawane amplifikacji PCR w celu uzyskania dwuniciowej biblioteki DNA (a). Region losowy pozbawiony starterów (PF₂) z jednoniciowej biblioteki DNA PF jest przygotowywany poprzez trawienie enzymami Nt.BstNBI/BspMI (miejsca cięcia zaznaczono grotami strzałek) oraz oczyszczanie w żelu. Samoponadmostkowiec (self-bridge) jest izolowany albo z protokołu PF₁, a/lub poprzez pojedyncze trawienie biblioteki wyjściowej enzymem Nt.BstNBI (b) wraz z oczyszczaniem w żelu. Po selekcji (c), wyselekcjonowane sekwencje (oznaczone jako pS30) są hybrydyzowane z odpowiadającymi im oligomerami oraz samoponadmostkowcem, a następnie ligowane w celu odtworzenia wcześniej usuniętych regionów starterów. Podobnie jak w PF₁, wprowadzane są startery zawierające promotor Sp6 na końcu 3' (d). Służą one następnie do transkrypcji RNA zawierającego wyselekcjonowane regiony (e). RNA jest następnie reamplifikowane wyłącznie przy użyciu RT-PCR (f), a wyselekcjonowana subbiblioteka jest gotowa do kolejnej rundy selekcji.

Rycina 2. Schematyczna reprezentacja i wyniki eksperymentalne/wdrożenie protokołu selekcji PF. Wyznaczone kroki odpowiadają tym przedstawionym na Rycinie 1. Po trawieniu biblioteki PF skonstruowanej metodą PCR (Krok a) za pomocą endonukleaz restrykcyjnych (zgodnie z oznaczeniami), produkty trawienia rozdzielono metodą PAGE na żelu 10% w warunkach denaturujących. Przedstawiono odpowiadające im fragmenty uzyskane za pomocą protokołów selekcji PF₁ i PF₂ (Krok b). Po selekcji (Krok c), związane aptamery są hybrydyzowane z odpowiadającymi im oligomerami oraz automostkiem, a następnie ligowane w celu regeneracji uprzednio usuniętych regionów starterowych. Na końcu 3' wprowadza się startery zawierające promotor Sp6 na końcu 3' (Krok d). RNA znakowane ³²P transkrybowano, wykorzystując ligowane produkty w ilościach 1, 0,5, 0,25, 0,125 μl z reakcji o objętości 5 μl, a następnie rozdzielono metodą PAGE na żelach 6% w warunkach denaturujących (Krok e). Transkrypty poddano następnie działaniu DNazy w celu usunięcia nieoselekcjonowanych losowych regionów DNA, przeprowadzono odwrotną transkrypcję do cDNA, a następnie ponownie amplifikowano przez 7, 14, 21 lub 28 cykli PCR. Produkty rozdzielono metodą PAGE na żelach 8% w warunkach niedenaturujących. Fragment o długości 66 nt reprezentuje pełnowymiarowy produkt zawierający wyselekcjonowane sekwencje pS30-CC i pS30 ponownie osadzone w sekwencjach flankujących 5' i 3'. Migracja markerów PhiX174/HinfI przedstawiona jest po lewej stronie (Krok f). Kontrole obejmowały pominięcie etapu odwrotnej transkrypcji (RT). W takich próbkach przy wysokiej liczbie cykli można było zauważyć niewielką ilość produktu; prawdopodobnie można to całkowicie wyeliminować poprzez drugi (lub przedłużony) etap trawienia DNazą.

Rysunek 3. Charakterystyka wiązania wybranych aptamerów i ich zastosowanie w formacie kanapkowym.
A. Zależne od stężenia wiązanie aptamerów znakowanych ³²P w celu wyznaczenia Kd. Aptamery zostały znakowane na końcu 5' przy użyciu g-³²P-ATP (3000Ci/mmol, ~ 10 mCi) i kinazy polinukleotydowej T4 (New England Biolabs), a wiązanie określono zgodnie z opisem.

B. derywat 1 z grupą aminową na końcu 5'^{Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.} aptamery sprzęgnięto z mikromacierzy Codelink. Oczyszczone białko S100B związano z 1^{Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.} aptameru, preparaty wypłukano dokładnie, a następnie zastosowano znakowany AlexaFluor546 2^nd aptamer został związany z 1^st kompleksy aptamer:S100B. Po dokładnym przemyciu natężenie fluorescencji zmierzono za pomocą skanera ScanArray.

C. Aptamery 1^st z grupą tiolową na końcu 5' zostały sprzężone z nanodrutami Au przy użyciu standardowej chemii tioli. Aptamery 2^nd zostały sprzężone z 50 nm AuNP w ten sam sposób. Następnie do zmodyfikowanych nanodrutów przywiązano oczyszczone białko S100B (lewo) lub oczyszczone białko kontrolne HtrA1 (prawo). Po dokładnym płukaniu kompleksy aptamer 1^st-nanodrut:S100B zostały następnie sprzężone z AuNP 50 nm z aptamerem 2^nd. Po dokładnym płukaniu powstałe kompleksy kanapkowe zwizualizowano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej z emisją polową. Paski skali = 1 μm.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tris-HCl
Polimeraza DNA HotMaster TAQ	5 PRIME
Mieszanka dNTP	Sigma-Aldrich
Akrylamid	Fisher Scientific
Bufor UltraPure 10X TBE	Invitrogen
Persiarczan amonu	Bio-Rad
TEMED	Fisher Scientific
Marker DNA PhiX174 DNA/Hinf I	Promega Corp.
Bro מקid etydynyum
α-32P-dCTP
Fenol:CHCl3:IAA	Ambion
NaCl
Etanol
Enzymy restrykcyjne	New England Biolabs
Mocznik	Fisher Scientific
Film fotograficzny	ECE Scientific
PBS	GIBCO, by Life Technologies
CaCl2	GIBCO, by Life Technologies
MgCl2	GIBCO, by Life Technologies
Kuleczki agarozowe Ni-NTA	Qiagen
Kolumna polipropylenowa	Qiagen
NaHPO4
NaAc
Komórki Detroit-551
Komórki SK-MEL-31
MEM
TrypLE Express	GIBCO, by Life Technologies
Ligaza DNA T4	New England Biolabs
Dimetylosulfotlenek	Promega Corp.
Polimeraza RNA Sp6	Promega Corp.
DNaza I wolna od RNaz	Promega Corp.
Inhibitor RNazy	Promega Corp.
SensiScript odwrotna transkryptaza	Qiagen
Wektor pCR-2.1-TOPO	Invitrogen
Komórki kompetentne DH5α	Invitrogen
Zestaw do minipreparatykiki plazmidów	Qiagen
Vector NTI	Invitrogen
Polinukleotydowa kinaza T4	New England Biolabs
γ-32P-ATP