Wybór aptamerów bez podkładów przy użyciu losowej biblioteki DNA

Summary

Protokoły SELEX składają się z wielu rund selekcji, z których każda wymaga regeneracji związanych ligandów, które z kolei wymagają stałych sekwencji starterów flankujących losowe regiony biblioteki. Te stałe sekwencje starterów mogą zakłócać proces selekcji (wyniki fałszywie dodatnie i ujemne). Poniżej przedstawiamy protokół bez podkładów.

Abstract

Aptamery to oligonukleotydy o wysokiej strukturze (DNA lub RNA), które mogą wiązać się z celami o powinowactwie porównywalnym do przeciwciał ¹. Są one identyfikowane w procesie selekcji in vitro zwanym systematyczną ewolucją ligandów przez wzbogacanie rozszerzające (SELEX) w celu rozpoznania szerokiej gamy celów, od małych cząsteczek po białka i inne makrocząsteczki ^2-4. Aptamery mają właściwości, które dobrze nadają się do zastosowań diagnostycznych i/lub terapeutycznych in vivo: oprócz dobrej specyficzności i powinowactwa łatwo się syntetyzują, przeżywają bardziej rygorystyczne warunki przetwarzania, są słabo immunogenne, a ich stosunkowo mały rozmiar może powodować łatwą penetrację tkanek.

Aptamery, które są identyfikowane za pomocą standardowego procesu SELEX, zazwyczaj składają się z ~80 nukleotydów (nt), ponieważ zazwyczaj są wybierane z bibliotek kwasów nukleinowych z losowo wybranymi regionami o długości ~40 nt oraz stałymi miejscami starterów ~20 nt z każdej strony. Stałe sekwencje starterów mogą zatem stanowić prawie ~50% sekwencji bibliotecznych, a zatem mogą pozytywnie lub negatywnie zagrozić identyfikacji aptamerów w procesie selekcji ³, chociaż podejścia bioinformatyczne sugerują, że ustalone sekwencje nie przyczyniają się znacząco do struktury aptamerów po selekcji ⁵. Aby rozwiązać te potencjalne problemy, sekwencje starterów zostały zablokowane przez komplementarne oligonukleotydy lub przełączone na inne sekwencje w połowie rundy SELEX ⁶, lub zostały przycięte do 6-9 nt ^{7, 8}. Wen i Gray ⁹ zaprojektowali metodę SELEX bez starterów genomowych, w której sekwencje starterów zostały całkowicie usunięte z biblioteki przed selekcją, a następnie zregenerowane, aby umożliwić amplifikację wybranych fragmentów genomu. Jednak, aby zastosować tę technikę, należy zbudować unikalną bibliotekę genomiczną, która ma ograniczoną różnorodność, a regeneracja po rundach selekcji opiera się na liniowym etapie reamplifikacji. Alternatywnie, próby obejścia problemów spowodowanych przez ustalone sekwencje starterów przy użyciu partycjonowania o wysokiej wydajności napotykają na problemy dotyczące amplifikacji PCR ¹⁰.

Opracowaliśmy metodę selekcji bez podkładu (PF), która znacznie upraszcza procedury SELEX i skutecznie eliminuje problemy z zakłóceniami starterów ^{11, 12}. Protokoły działają w prosty sposób. Centralny losowy obszar biblioteki jest oczyszczany bez obcych sekwencji flankujących i jest związany z odpowiednim celem (na przykład z oczyszczonym białkiem lub złożonymi mieszaninami, takimi jak linie komórkowe). Następnie sekwencje powiązane są uzyskiwane, ponownie łączone z sekwencjami flankującymi i ponownie wzmacniane w celu wygenerowania wybranych podbibliotek. Jako przykład wybraliśmy aptamery do S100B, markera białkowego czerniaka. Testy wiązania wykazały Kd s w zakresie ^10-7 - ^10-8 M po kilku rundach selekcji, a my wykazaliśmy, że aptamery działają skutecznie w formacie wiązania warstwowego.

Protocol

1. Krótki opis protokołów selekcji bez podkładów

Dwuniciowa biblioteka DNA została skonstruowana za pomocą PCR z odpowiednimi oligonukleotydami (Rysunek 1 i 2, Krok a), które zawierają centralną domenę losową 30 nt, otoczoną dwoma regionami starterowymi. Opracowano dwa nieco różniące się protokoły "wolne od starterów" (PF). W bibliotece dsDNA region 5' zawiera miejsce "nacięcia" endonukleazy dla endonukleazy Nt.BstNBI; enzym ten rozpoznaje dsDNA, ale rozszczepia tylko jedną nić substratu DNA. Region 3' biblioteki dsDNA zawiera inne miejsce "nacięcia" dla endonukleazy Nt.BbvCI, która również rozpoznaje dsDNA, ale rozszczepia tylko jedną nić, pozostawiając CC na końcu 3' (PF₁), a także miejsce restrykcyjne endonukleazy BspMI, które rozszczepia obie nici, nie pozostawiając żadnych dodatkowych nukleotydów 3' (PF₂). Zazwyczaj na początku stosujemy protokół PF₁ (ponieważ łatwiej jest oddzielić fragmenty powstałe podczas procesu selekcji; patrz poniżej), a następnie stosujemy protokół PF₂ w kolejnych rundach selekcji.

32 nt fragmentu 5'-pN30-CC-3' (oznaczonego jako 32+-fragment) i 30 nt fragmentu 5'-pN30-3' (oznaczonego jako 30+-fragment) zostały odpowiednio wygenerowane przez Nt.BbvCI/Nt.BstNBI lub BspMI/Nt.BstNBI rozszczepienie biblioteki dsDNA i oczyszczanie żelu. Fragment 32+ zawiera losową domenę 30 nt, z sekwencją flankującą CC na końcu 3' (PF₁). Fragment 30+ (PF₂) składa się tylko z 30 nt losowej sekwencji domenowej. "Samo-mostek" 66--fragment (zawierający losowy region N30 z sekwencjami flankującymi 5' i 3') uzyskano przez oczyszczanie żelem (Nt.BbvCI lub Nt.BstNBI przecina tylko górne pasmo "+"). Ten samo-mostek uzyskuje się bezpośrednio w protokole PF₁ lub można go wygenerować i wyizolować po przecięciu DNA biblioteki tylko za pomocą NtBbv.CI lub Nt.BstNBI dla protokołu PF₂ (Rysunek 1 i 2, Krok b). Fragmenty 32 + lub 32 + inkubowano z oczyszczonymi białkami lub hodowanymi komórkami czerniaka, aby umożliwić fragmentom związanie się z białkami lub komórkami, a następnie niezwiązane fragmenty wypłukano (ryc. 1 i 2, krok c). Oprawione lub wybrane fragmenty wykorzystano do regeneracji regionów startera.

W reakcji hybrydyzacji/ligacji, samo-mostek został wyprodukowany i oczyszczony w tym samym czasie, co oczyszczanie 32+- i 30+-fragmentów; 5'-końcowy starter był taki sam jak konstrukcja biblioteki, a 3'-końcowe startery zostały zastąpione pasującymi starterami, które również zawierały dodatkowy promotor transkrypcji Sp6 na końcu 3' (Rysunek 1 i 2, Krok d). Produkty reakcji hybrydyzacji/ligacji wykorzystano następnie do transkrypcji RNA in vitro (ryc. 1 i 2, krok e). Po transkrypcji RNA zligowane DNA (w tym niewybrany fragment DNA samopomostowego) zostały strawione przez DNazę I w celu usunięcia zakłócających sekwencji tła. Dane z odwrotnej transkrypcji (RT)-PCR wykazały, że produkty regenerowane starterem były skutecznie reamplifikowane, stanowiąc "rundę" selekcji (Figura 1 i 2, Krok f). Wzmocnienie tła wykazywane przy wysokich liczbach cykli w kontrolnym PCR bez RT może być całkowicie usunięte przez dodatkowe trawienie DNazy I i nie jest wykrywalne po niższych numerach cykli, które rutynowo stosujemy.

Po 7 rundach selekcji, aptamery zostały scharakteryzowane pod kątem właściwości wiążących. Wszystkie Kd mieściły się w zakresie ^{10-7 10-8} M (ryc. 3). W testach wiązania różne pary aptamerów wykazywały wiązanie addytywne, co wskazuje, że są one ukierunkowane na różne miejsca na białku S100B. W związku z tym przetestowaliśmy pary aptamerów w "kanapkowych" testach wiązania, zarówno na szklanych mikromacierzach (szkiełka Codelink) przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych drugich aptamerów, jak i na derywatyzowanych nanodrutach złota z drugimi aptamerami sprzężonymi z nanocząstkami złota o długości 50 nm (AuNPs; Rysunek 3). W obu przypadkach swoistość wiązania była wysoka: w mikromacierzach Codelink nie zaobserwowano wiązania kanapkowego z aptamerami, które nie wykazywały wiązania addytywnego w oznaczeniach Kd. W przypadku derywatyzowanych nanodrutów zaobserwowaliśmy praktycznie brak wiązania z białkami niedocelowymi, a poszczególne kompleksy kanapkowe można zaobserwować za pośrednictwem AuNP sprzężonych z aptamerem (Figura 3).

2. Materiały

2.1. Generowanie biblioteki DNA PF i reamplifikacja związanych fragmentów

Szczegóły są opisane w Pan and Clawson, 2009; Pan i wsp., 2008.

2.2. Selekcja oparta na czystym białku

1. 20 mM Tris-HCl, pH 7,4
2. 32+-Fragment i 30+-Fragment
3. Bufor selekcyjne (2,5 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂ w 1X sól fizjologiczna buforowana fosforanami, pH 7,4, Gibco)
4. Koraliki agarozowe Ni-NTA (Qiagen)
5. Kolumna polipropylenowa (Qiagen)
6. Bufor wiążący (50 mM Na₂HPO_{4-NaH 2}PO₄, pH 7,2, 150 mM NaCl)
7. Ekspresyjne, oczyszczone białko S100B w buforze wiążącym (5 μg/μL)
8. Fenol:ChCl3:IAA (pH 7,9, Ambion)
9. 3 M NaAc, pH 5,2
10. 100% i 70% etanolu

2.3. Klonowanie TOPO i analiza sekwencjonowania wybranych bibliotek dsDNA

1. 7^runda wybranych produktów PCR (można wykonać dodatkowe rundy w celu dalszej optymalizacji wiązania aptamerów)
2. Wektor pCR2.1-TOPO (Invitrogen)
3. Komórki składowe DH5 (Invitrogen)
4. Mini zestaw plazmidu (Qiagen)
5. Podkład do przodu M13
6. Wektor NTI firmy Informax (Invitrogen)

2.4. Charakterystyka wiązania aptamerów

1. Aptamery i olikleotydy kontrolne (N₃₀CC i N₃₀, IDT)
2. Kinaza polinukleotydowa T4 (New England Biolabs)
3. ^γ-32P-ATP (3000 Ci/mmol; 10 μCi/ml)
4. Oczyszczony S100B w buforze wiążącym (5 μg/μL)

2.5. Testy wiązania kanapek z oczyszczonym białkiem S100B i wybranymi aptamerami

1. 1. aptamer był sprzężony z a.) Slajdy mikromacierzy Codelink lub b.) Au nanodruty.
2. Oczyszczone białko S100B, rozcieńczone do 0,125 μM w 70 μl dla a) lub 1 μM w 50 μl dla b).
3. Drugi aptamer był oznaczony symbolem a.) Alexafluor 546 dla slajdów z tablicą Codelink lub b.) sprzężony z AuNP 50 nm do badań z derywatyzowanymi nanodrutami Au.

3. Metody

3.1. Generowanie biblioteki DNA PF

Szczegółowe metody i protokoły wyboru aptamerów można znaleźć w Pan and Clawson, 2009; Pan i wsp., 2008.

3.2. Wybór aptamerów przy użyciu oczyszczonego białka S100B

Ludzkie białko B wiążące wapń S100 (S100B. Gene ID#6285) został użyty jako cel. Białko S100B znakowane 6-poziomowo (o długości 98 aminokwasów) zostało wyrażone i oczyszczone przy użyciu systemu QIAexpressionist. (QIAGEN). W razie potrzeby lub wskazania, znacznik His₆ można usunąć enzymatycznie. Podczas rund selekcji 1 μl próbki z każdego etapu została zapisana do zliczenia scyntylacyjnego cieczy w celu określenia ogólnej skuteczności wiązania.

3.2.1. Przygotowanie fragmentów DNA biblioteki PF

1. Ponownie zawiesić fragmenty 32⁺ i 30⁺ w 40 μl 20 mM Tris-HCl, pH 7,4.
2. Podgrzewać przez 3 minuty w temperaturze 85°C i schładzać do 37°C przez 3 minuty w inkubatorze o temperaturze 37°C.
3. Dodać 760 μl buforu selekcyjnego (2,5 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂ w 1X soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, pH 7,4, GIBCO) i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37°C, a następnie przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut.
4. Przepuścić przez kolumnę zawierającą kulki agarozowe Ni-NTA (QIAGEN) wstępnie umyte buforem selekcyjnym, a następnie przechowywać w temperaturze RT do momentu użycia.

3.2.2. Przygotowanie Ni-NTA S100B z kulkami agarozowymi w RT

1. Odwiruj 400 μl kulek agarozy Ni-NTA przez 3 sekundy i wyrzuć supernatant.
2. Przepłukać kulki 400 μl buforu wiążącego (50 mM Na₂HPO 4-NaH₂PO ₄, pH 7,2, 150 mM NaCl), delikatnie pipetując 5 razy, a następnie odwirować i wyrzucić supernatant.
3. Powtórz krok 2 dwa razy.
4. Dodać 400 μl oczyszczonego S100B (5 μg/μl, zawieszone w buforze wiążącym) i delikatnie pipetować 5 razy co 3 minuty, w sumie 15 minut.
5. Odwirować i wyrzucić supernatant.
6. Przemyć S100B z kulkami 400 μl buforu wiążącego, delikatnie pipetując 3 razy, a następnie odwirować i wyrzucić supernatant.
7. Powtórz krok 6 dwa razy.

3.2.3. Wybór aptamerów związanych z S100B

1. Przenieś fragmenty 32+- i 30+ z 3.2.1 do S100B związanego z koralikami.
2. Inkubować przez 15 minut i delikatnie mieszać co 3 minuty, delikatnie pipetując.
3. Przemyć kompleks S100B-DNA 800 μl buforu wiążącego, delikatnie pipetując, a następnie odwirować i wyrzucić supernatant.
4. Powtórz krok 3 dwa razy.

3.2.4. Odzyskiwanie wybranych aptamerów S100B

1. Dodać 200 μl 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), podgrzewać 3 minuty w temperaturze 85°C, wirować przez 1 minutę i odwirować, a następnie przenieść supernatant do świeżej probówki.
2. Powtórz krok 1 raz i połącz supernate.
3. Oczyść wybrane fragmenty DNA zgodnie z krokami 9-12 z poprzednich publikacji (11, 12).

3.2.5. Klonowanie TOPO i analiza sekwencjonowania w celu identyfikacji uzgodnionych sekwencji aptamerów

1. Sklonuj 10. rundę wybranych produktów PCR do wektora pCR2.1-TOPO (z Invitrogen). Dodatkowe klonowanie można wykonać w miarę wykonywania dalszych wyborów.
2. Sekwencjonuj 40-50 pojedynczych kolonii za pomocą startera M13 (używamy Molecular Genetics Core Facility w Hershey Medical Center).
3. Wyrównaj wybrane sekwencje za pomocą Vector NTI (Invitrogen) firmy Informax.
4. Określ sekwencje konsensusu na podstawie wyrównań.
5. Aptamery konsensusu zostały następnie zakupione od Integrated DNA Technologies.

3.3. Testy wiązania kanapkowego z parami wybranych aptamerów

3.3.1. Format mikromacierzy z fluorescencyjnie znakowanymi 2 aptamerami.

1. Konsensus 1^st Aptamery zsyntetyzowano z ugrupowaniem 5'-aminyC6. Zawieszono je w buforze drukarskim do końcowego stężenia 15 μM i naniesiono na szkiełka aktywowane przez Codelink (GE Healthcare/Amersham Biosciences) za pomocą macierzy mikrosiatkowej Apogent Discoveries w PSU w zakładzie DNA Microarray w University Park), zgodnie z zalecanymi protokołami Codelink. Każdy slajd został wydrukowany z 12 tablicami.
2. Hybrydyzację przeprowadzono w kasecie hybrydyzacyjnej Microarray w formacie 2 x 8 (Array It, TeleChem International). Kaseta Microarray została uszczelniona za pomocą niezawierającej nukleaz samoprzylepnej folii uszczelniającej (AlumaSeal II, Research Products International), aby zapobiec parowaniu.
3. Białko S100B rozcieńczono w PBS do odpowiedniego stężenia w 70 μl i nałożono na studzienki kasety mikromacierzowej. Wiązanie z aptamerami wydrukowanymi na szkiełku Codelink trwało 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Studzienki kasety zostały następnie indywidualnie przemyte 3X PBS + 5 mM MgCl₂ (PBSM), a nadmiar buforu płuczącego osuszono. Znakowane fluorescencyjnie aptamery rozcieńczono w PBSM do 0,125 μM w 70 μl, a następnie podgrzano do 85 °C przez 3 minuty, a następnie 3 minuty na lodzie. Aptamery nałożono na dołki kasety z mikromacierzą i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Studnie zostały ponownie indywidualnie umyte 3X za pomocą PBSM. Kaseta została następnie rozebrana na części, a cały szkiełko przepłukano w PBSM. Szkiełko zostało następnie dokładnie wysuszone przez odwirowanie i zeskanowane za pomocą skanera Scanning Packard Biosciences ScanArray 4000XL (Perkin Elmer).

3.3.2. Derywatyzowany format nanodrutu przy użyciu 2 aptamerów sprzężonych z AuNP 50 nm

Złote NW (~5 μM długości, 320 nm średnicy) zostały zsyntetyzowane przez galwanostatyczne elektroosadzanie w porowatych membranach z tlenku glinu zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami (13, 14). Po rozpuszczeniu porowatej membrany nanodruty zostały ponownie zawieszone w 1 ml etanolu.

Jak wspomniano, DNA zostało zakupione od Integrated DNA Technologies. Nanocząstki złota (50 nm) zakupiono od Teda Pelli. Tiolowane DNA rozszczepiono 100 mM DTT w 0,1 M fosforanu sodu o pH 8,3 przez jedną godzinę, a następnie oczyszczono w kolumnie Centri-spin 10.

Przywiązanie aptameru do złotych NW i NP

A 50 μL porcji nanodrutów Au umieszczono w 0,5 ml nieprzywierającej probówce wirówkowej i przepłukano do 10 mM buforu fosforanowego, 300 mM NaCl, pH 7,4. DNA tiolowane na końcu 5' (z przekładką 10 T na końcu 5') dodano do drutów w końcowym stężeniu 0,4 μM. Próbkę wirowano przez 30 minut, a następnie przepłukiwano przez odwirowanie (8100 g) trzykrotnie z 10 mM buforem fosforanowym 300 mM NaCl, pH 7,4 i trzykrotnie z 50 mM buforem fosforanowym 5 mM MgCl₂, pH 7,2. Druty pokryte DNA zawieszono ponownie w buforze o pojemności 100 μl w celu rozcieńczenia o połowę.

Derywatyzowane DNA AuNPs zostały przygotowane przez dodanie 50 μl 100 mM 2^ndż aptameru (z odstępem 10 T na końcu 5') do 1 ml 50 nm AuNPs i podgrzewane w temperaturze 37°C przez jedną godzinę. Po podgrzaniu dodano 10 mM buforu fosforanu sodu, 1M NaCl, pH 7,4 (25 μL dwa razy, a następnie 100 μL, 150 μL i 128 μL) w odstępach 0,5 godziny. Koniugaty pozostawiono na noc w bloku grzewczym o temperaturze 37°C przed użyciem. Próbki przepłukano 3 razy 50 mM buforem fosforanowym, 5 mM MgCl₂, pH 7,2. Koniugaty zawieszono w buforze o objętości 120 μl.

Hybrydyzacja kanapkowa na NW

Druty pokryte DNA, rozcieńczone 1 μL, zostały dodane do buforu w probówkach PCR. Białko S100B lub białko kontrolne HtrA1 (1 μg/μL) dodano do końcowego stężenia 1 μM w buforze 50 μL (~ 10-12 cząsteczek białka dodanych na nanometr kwadratowy powierzchni nanodrutu Au). Próbki były wirowane przez ~ 2 godziny. Druty przepłukano trzykrotnie przez odwirowanie (8100 g) 50 mM buforem fosforanowym, 5 mM MgCl₂, pH 7,2 i zawieszono w 20 μl koniugatów AuNP/DNA. Druty wirowano w koniugatach przez 2 godziny, a następnie przepłukano 5x przez odwirowanie (1300 g) z 50 mM buforem fosforanowym 5 mM MgCl₂, pH 7,2 w celu usunięcia nadmiaru nanocząstek. Próbki zawieszono ponownie w buforze o pojemności 20 μl i wysuszono na płytkach krzemowych pokrytych Au w celu analizy FE-SEM.

FE-SEM obrazy nanoprzewodów uzyskano za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego Leo 1530 z emisją polową, wykorzystując źródło elektronów z emisją pola Schottky'ego przy napięciu roboczym 5,00 kV.

4. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. Protokoły 5'-Primer-Free (PF₁) i Free-Free-Primer-Free (PF₂).

(A) Protokół selekcji aptamerów DNA PF₁. Oligonukleotydy biblioteczne są wyżarzane razem i poddawane amplifikacji PCR w celu uzyskania dwuniciowej biblioteki DNA (a). Losowy region wolny od starterów (PF₁) na końcu 5' z jednoniciowych bibliotek DNA PF jest przygotowywany przez trawienie Nt.BstNBI / Nt.BbvCI (miejsca cięcia są oznaczone czerwonymi grotami strzałek) i oczyszczanie żelem, a samomostek (strzałka) jest izolowany przez oczyszczanie żelu (b). Po selekcji (c) wybrane sekwencje (oznaczone jako pS30-CC) są hybrydyzowane z odpowiadającymi im oligomerami i samomostkiem i ligowane w celu ponownego wygenerowania wcześniej usuniętych regionów starterowych. Na tym etapie wprowadza się startery, które zawierają promotor Sp6 na końcu 3' (d). Jest to następnie wykorzystywane do transkrypcji RNA zawierającego wybrane regiony (e). Na koniec RNA jest następnie wyłącznie ponownie amplifikowane (matryca DNA jest trawiona) za pomocą RT-PCR (f), a wybrana podbiblioteka jest gotowa do następnej rundy selekcji.

(B) Protokół selekcji aptamerów DNA PF₂. Oligonukleotydy biblioteczne są wyżarzane razem i poddawane amplifikacji PCR w celu uzyskania dwuniciowej biblioteki DNA (a). Losowy region wolny od starterów (PF₂) z biblioteki jednoniciowego DNA PF jest przygotowywany przez mineralizację Nt.BstNBI/BspMI (miejsca cięcia są oznaczone grotami strzałek) i oczyszczanie żelem. Samomostek jest izolowany albo od protokołu PF₁ i/lub przez pojedyncze trawienie biblioteki wyjściowej za pomocą Nt.BstNBI (b), w połączeniu z oczyszczaniem żelu. Po selekcji (c) wybrane sekwencje (oznaczone jako pS30) są hybrydyzowane z odpowiadającymi im oligomerami i samomostkiem, a następnie ligowane w celu regeneracji wcześniej usuniętych regionów starterowych. Podobnie jak w PF₁, wprowadza się startery, które zawierają promotor Sp6 na końcu 3' (d). Jest to następnie wykorzystywane do transkrypcji RNA zawierającego wybrane regiony (e). RNA jest następnie reamplifikowane wyłącznie za pomocą RT-PCR (f), a wybrana podbiblioteka jest gotowa do następnej rundy selekcji.

Rysunek 2. Schematyczne przedstawienie i wyniki eksperymentalne/redukcja do praktyki protokołu selekcji PF. Wyznaczone kroki odpowiadają tym przedstawionym na rysunku 1. Po wytrawieniu biblioteki PF zbudowanej metodą PCR (Krok a) z endonukleazami restrykcyjnymi (jak wskazano), strawione produkty oddzielono za pomocą PAGE na 10% żelu w warunkach denaturacji. Pokazano odpowiednie fragmenty uzyskane za pomocą protokołów selekcji PF₁ i_{PF 2} (krok b). Po selekcji (Krok c) związane aptamery są hybrydyzowane z odpowiadającymi im oligomerami i samomostkiem, a następnie ligowane w celu regeneracji wcześniej usuniętych regionów startera. Na końcu 3' wprowadza się startery, które zawierają promotor Sp6 na końcu 3' (krok d). ^{Rozdział 32}RNA znakowane P transkrybowano przy użyciu ligowanych produktów 1, 0,5, 0,25, 0,125 μl z 5 μl reakcji i rozdzielano za pomocą PAGE na 6% żelach w warunkach denaturacji (etap e). Transkrypty zostały następnie potraktowane DNazą w celu usunięcia niewybranych losowych regionów DNA, odwrotnej transkrypcji do cDNA, a następnie ponownie amplifikowane przez 7, 14, 21 lub 28 cykli PCR. Produkty były rozdzielane przez PAGE na 8% żeli w warunkach niedenaturujących. Fragment 66 nt reprezentuje produkt o pełnej długości zawierający wybrane sekwencje pS30-CC i pS30 ponownie osadzone w sekwencjach flankujących 5' i 3'. Migracja markerów PhiX174/HinfI jest pokazana po lewej stronie (krok f). Kontrole obejmowały pominięcie etapu odwrotnej transkrypcji (RT). Niewielką ilość produktu w takich próbkach można było zaobserwować przy dużych liczbach cykli; przypuszczalnie można to całkowicie wyeliminować za pomocą drugiego (lub przedłużonego) etapu trawienia DNazy.

Rysunek 3. Charakterystyka wiązania wybranych aptamerów i ich sparowane zastosowanie w formie kanapkowej.
A. Zależne od stężenia ^{wiązanie 32}p-aptamerów do oznaczania Kd. Aptamery znakowano końcem 5' za pomocą ^g-32P-ATP (3000Ci/mmol, ~ 10 mCi) i kinazy polinukleotydowej T4 (New England Biolabs), a wiązanie określono zgodnie z opisem.

B. 5'-aminy derywatyzowane 1^st aptamery sprzężono z mikromacierzami Codelink. Oczyszczone białko S100B związano z 1^. aptamerem, szkiełka dokładnie przepłukano, a 2^{. aptamer} znakowany AlexaFluor546 związano z kompleksami 1^{. aptamer}:S100B. Po płukaniu fluorescencję oznaczono ilościowo za pomocą skanera ScanArray.

C. 5'-tiolowe derywatyzowane^1. aptamery sprzężono z nanodrutami Au przy użyciu standardowej chemii tiolowej. W ten sam sposób sprzężono 2^{. aptamery} z AuNP o długości fali 50 nm. Oczyszczone białko S100B (po lewej) lub oczyszczone białko kontrolne HtrA1 (po prawej) następnie związano najpierw z derywatyzowanymi nanodrutami. Po dokładnym wypłukaniu, 2. nd-aptamer-50 nm AuNPs zostały następnie związane z 1^{kompleksem st-aptamer-nanowire}:S100B. Po przepłukaniu, związane kompleksy kanapkowe zwizualizowano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej z emisją pola. Podziałka = 1 μm.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl
HotMaster TAQ Polimeraza DNA	5 PRIME
dNTP Mix	Sigma-Aldrich
Akrylamid	Fisher Scientific
UltraPure 10X TBE Bufor	Invitrogen
Nadsiarczan amonu	Bio-Rad
TEMED	Marker DNA Fisher Scientific
PhiX174 / Hinf I	Promega Corp.
Bromek
i alfa;-32P-dCTP
Fenol:ChCl3:IAA	Ambion
NaCl
Enzymy restrykcyjne etanolu
Mocznik	Fisher Naukowa
Folia Fotograficzna	ECE Scientific
PBS	GIBCO, autorstwa Life Technologies
Kolumna polipropylenowa	Qiagen
NaHPO4
NaAc
ogniwa
ogniwa SK-MEL-31 MEM
TrypLE Express	GIBCO, firmy Life Technologies
T4 DNA Ligaza	New England Biolabs
Dimethylsulfoxide	Promega Corp.
Polimeraza RNA Sp6	Promega Corp.
DNaza wolna od RNaz I	Promega Corp.
Inhibitor RNazy	Promega Corp.
SensiScript Odwrotna transkryptaza	Qiagen
pCR-2.1-TOPO Wektor	Invitrogen
DH5α Komórki kompotentne	Invitrogen
Plasmid Mini Kit	Qiagen
Vector NTI	Invitrogen
T4 Kinaza polinukleotydowa	New England Biolabs
γ-32P-ATP