Samopodawanie leku oraz wokalizacje ultradźwiękowe (USV) są wykorzystywane jako oceny behawioralne w badaniach na zwierzętach, lecz rzadko w połączeniu. Celem niniejszego artykułu jest opisanie zalet rejestrowania USV podczas procedur samopodawania leków w celu oceny odpowiedzi afektywnych na doświadczenie związane z przyjmowaniem substancji.
Artykuł metodologiczny
Ocena wokalizacji ultradźwiękowych podczas samopodawania leku u szczurów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Procedury samopodawania narkotyków są powszechnie stosowane do badania zmian behawioralnych i neurochemicznych związanych z nadużywaniem substancji psychoaktywnych, uzależnieniem i nawrotami u ludzi. Do pomiaru motywacji do przyjmowania narkotyków u zwierząt często wykorzystuje się różne rodzaje aktywności behawioralnej. Jednak kluczowym elementem nawrotów nadużywania narkotyków u osób w stanie abstynencji od kokainy jest „głód narkotykowy” (drug craving), który jest trudny do zamodelowania u zwierząt, ponieważ często występuje on wyłącznie bez jawnych zachowań. Niemniej jednak możliwe jest, że klasa wokalizacji ultradźwiękowych (USVs) u szczurów może stanowić przydatny marker reakcji afektywnych na podanie narkotyku, oczekiwanie na narkotyk, a nawet głód narkotykowy. Szczury wokalizują na częstotliwościach ultradźwiękowych, które pełnią funkcję komunikacyjną i wyrażają subiektywne stany emocjonalne. Kilka badań wykazało, że różne zakresy częstotliwości sygnałów są związane z negatywnymi i pozytywnymi stanami emocjonalnymi. Na przykład sygnały o wysokiej częstotliwości („50 kHz”) wiążą się z afektem pozytywnym, natomiast sygnały o niskiej częstotliwości („22 kHz”) reprezentują negatywny stan emocjonalny. Niniejszy artykuł opisuje procedurę oceny USVs u szczurów związanych z codziennym samopodawaniem kokainy. W tej procedurze wykorzystano standardowe jednoważykowe komory operacyjne umieszczone w boksach dźwiękochłonnych do sesji samopodawania kokainy, a także mikrofony ultradźwiękowe, wielokanałowy sprzęt rejestrujący oraz specjalistyczne programy komputerowe do detekcji i analizy USVs. Pomiary USVs odzwierciedlają emocjonalność szczurów przed, w trakcie i po dostępności narkotyku i mogą być korelowane z powszechnie ocenianymi danymi behawioralnymi dotyczącymi samopodawania narkotyków, takimi jak reakcje na dźwignię, odstępy między reakcjami oraz aktywność lokomotoryczna. Ponieważ USVs mogą być oceniane w odstępach czasu przed dostępnością narkotyku (np. antycypacyjne USVs) oraz podczas prób wygaszania reakcji na narkotyk, można również określić zmiany w afekcie związane z oczekiwaniem na narkotyk i abstynencją. Dodatkowo określenie zmian USVs w przebiegu krótkotrwałej i długotrwałej ekspozycji na narkotyk może dostarczyć bardziej szczegółowej interpretacji wpływu ekspozycji na narkotyk na funkcjonowanie afektywne.
Protokół
*= ważne punkty
- Oswojone samce szczurów Sprague-Dawley są trenowane do naciskania dźwigni w celu otrzymania nagrody pokarmowej (granulki sacharozy 45 mg; Bio-Serv, Frenchtown, NJ).
- *Cewniki dożylne konstruuje się z kaniul ze stali nierdzewnej (Plastics One, VA) oraz rurek silastowych. Szczury zostają poddane chirurgicznemu zabiegowi kaniulacji żyły szyjnej, aby umożliwić samopodawanie leku. Po operacji drożność cewnika utrzymuje się poprzez codzienne przemywanie 0,1 ml roztworu soli fizjologicznej 0,9%, heparyny i Timentinu.
- Kokaina (NIDA Drug Inventory and Supply and Control Program; RTI International, Research Triangle Park, NC) użyta w tym doświadczeniu została rozpuszczona w izotonicznym roztworze soli fizjologicznej (0,9%) w odpowiednich stężeniach dawek dostosowanych do masy zwierząt (0,75 mg/kg/iniekcja), tak aby każda iniekcja wynosiła 0,1 ml. Zwierzęta kontrolne otrzymywały roztwór soli fizjologicznej w tej samej objętości na iniekcję.
- *Aparat wykorzystywany do samopodawania leku składa się z komory operantowej z jedną dźwignią (28 x 22 x 21 cm), wyposażonej w oświetlenie pomieszczenia i światła stymulujące oraz 3 zestawy fotokomórek. Komora operantowa znajduje się wewnątrz większej komory dźwiękochłonnej (Med Associated, St. Albans, VT), aby ograniczyć hałas i światło z zewnątrz. Podczas sesji podawania leku zwierzęta są połączone dożylnie za pomocą rurek ze strzykawką zamontowaną na pompie zmotoryzowanej (Razel Scientific Instruments, Model A, St. Albans, VT), zawierającą roztwór kokainy (0,75 mg/kg/iniekcja) lub sterylną sól fizjologiczną. Po każdym naciśnięciu dźwigni zapala się światło stymulujące nad dźwignią, a kokaina lub sól fizjologiczna jest podawana w czasie infuzji wynoszącym 6 s. Aktywność lokomotoryczną ocenia się jako liczbę przerwań wiązki fotokomórek. Program samopodawania leku jest kontrolowany, a reakcje behawioralne (np. reakcje na dźwignię i aktywność lokomotoryczna) są rejestrowane przy użyciu komputera Med Pentium wyposażonego w oprogramowanie Med PC (Med Associates).
- *Do detekcji i rejestracji USV niezbędne są mikrofony ultradźwiękowe, sprzęt do akwizycji danych, oprogramowanie do rejestracji (Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany) oraz systemy komputerowe PC. W obecnym doświadczeniu mikrofony ultradźwiękowe (zakres odpowiedzi częstotliwościowej = 10-100 kHz) są bezpiecznie zamontowane w centrum komór operantowych. Mikrofony są podłączone do sprzętu do akwizycji danych (Avisoft-Ultrasoundgate) znajdującego się poza komorą operantową, a nagrania są zbierane na systemie komputerowym PC (Dell Optiplex GX270, Windows XP Professional, Intel(R) Pentium(R) 4 CPU, 2,60 GHz, 1 GB RAM) przy użyciu wielokanałowego oprogramowania do rejestracji RECORDER (Avisoft Bioacoustics).
- *Każda sesja samopodawania leku/rejestracji USV przebiega następująco:
- Zwierzęta są delikatnie wyjmowane z klatki domowej, a ich wszczepiony cewnik dożylny jest przemywany 0,05 ml heparynowanego roztworu soli fizjologicznej w celu wykrycia ewentualnych awarii cewnika.
- *Szczury są podłączone do obrotowego złącza zamontowanego na komorze operantowej, które umożliwia podawanie leku lub nośnika podczas sesji samopodawania. Zwierzęta są delikatnie umieszczane w komorze operantowej, a drzwi są cicho zamykane. Program samopodawania leku (Med PC) i oprogramowanie do rejestracji USV (RECORDER) znajdują się na dwóch oddzielnych systemach komputerowych. Dlatego, aby móc powiązać zachowania w komorze operantowej z detekcją USV, oba programy muszą zostać uruchomione jednocześnie (np. może być potrzebne dwie osoby, w zależności od rozmieszczenia komputerów).
- *Poszczególne USV są rejestrowane i znaczone czasem w sposób ciągły przez całą sesję. Program MedPC sterujący i rejestrujący zdarzenia w komorze operantowej może być napisany zgodnie z dowolną specyfikacją. Program MedPC zamyka się automatycznie na koniec sesji. Rejestrację USV należy zatrzymać ręcznie na systemie komputerowym dedykowanym do rejestracji USV.
- Na koniec sesji zwierzęta są delikatnie wyjmowane z komory operantowej, odłączane od złącza obrotowego i przemywane 0,05 ml heparynowanej soli fizjologicznej, aby oczyścić cewnik z pozostałości leku.
- *Ze względów logistycznych do analizy USV wykorzystaliśmy oddzielny system komputerowy (Dell Optiplex 745, Windows XP Professional, Intel(R) Core(TM), 2 CPU, 2,40 GHz, 2 GB RAM), jednak oprogramowanie analityczne może być zainstalowane na tym samym systemie co oprogramowanie do rejestracji. Analizy USV muszą być przeprowadzane starannie, aby zapewnić dokładność:
- *Oprogramowanie analityczne SASLab Pro (Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany) sprawia, że zarejestrowane USV są widoczne i słyszalne dla badaczy, wyświetlane w formie spektrogramu.
- *Korzystając z dostępnych ustawień konfiguracji, wynikowy spektrogram można zmodyfikować zgodnie z indywidualnymi preferencjami. Ponadto szumy tła o niskich częstotliwościach (np. generowane przez wentylator komór operantowych) mogą zostać odcięte, aby oprogramowanie mogło automatycznie wykrywać dźwięki powyżej tej częstotliwości w spektrogramie. Funkcje te wspomagają analizę danych, czyniąc pliki dźwiękowe krótszymi i szybszymi do oceny.
- W spektrogramie czasami wykrywane są szumy tła o częstotliwościach identycznych z USV. Ponieważ pliki dźwiękowe są rejestrowane w formacie .wav, badacz musi odsłuchać pliki dźwiękowe podczas oceny, aby potwierdzić i odróżnić USV od szumu tła.
- *Oprogramowanie analityczne może tworzyć pliki Excel z parametrami takimi jak częstotliwości sygnałów, szerokość pasma, czas trwania i dokładny czas emisji USV. To ostatnie pozwala na korelację USV z dokładnym czasem przed lub po samopodaniu leku. Umożliwia to wykorzystanie USV jako pomiarów w czasie rzeczywistym odpowiedzi emocjonalnej szczura w konkretnych momentach procedury eksperymentalnej.
Reprezentatywne wyniki:
Rycina 1: Wyświetlenie spektrogramu USV w zakresie 22 kHz. Długie wołania w zakresie 22 kHz są wywoływane w połączeniu z bodźcami awersyjnymi i uważa się, że odzwierciedlają negatywny stan emocjonalny.
Rycina 2: Wyświetlenie spektrogramu USV o częstotliwości 50 kHz. Krótkie „płaskie” i „modulowane częstotliwościowo” USV o częstotliwości 50 kHz są wywoływane w oczekiwaniu na samopodanie kokainy oraz w jego trakcie. Są one powiązane z afektem pozytywnym.
Rysunek 3: USV w zakresie 50 kHz indukowane kokainą. Wykres przedstawia USV (interwały 10-sekundowe) wywołane przed i po samopodanych iniekcjach kokainy (0.75 mg/kg/inj) u reprezentatywnego szczura w dniu 5. sesji samopodawania kokainy. Natychmiast po umieszczeniu w komorze operantowej i przed udostępnieniem kokainy wystąpiły USV antycypacyjne względem kokainy, a podczas samopodawania emitowane były USV indukowane kokainą.
Dyskusja
Szczury wydają wokalizacje w częstotliwościach ultradźwiękowych, które pełnią funkcje społecznościowe i komunikacyjne oraz wyrażają subiektywne stany emocjonalne 1,2. USV o częstotliwości 22 kHz są wyzwalane przez zdarzenia powodujące lęk i stres, takie jak sygnały poprzedzające wstrząsy stóp, obecność drapieżników, leki awersyjne oraz porażki społeczne 2,3. W związku z tym uważa się, że te zazwyczaj długie USV (>0.3s) reprezentują stan negatywnego afektu zwierzęcia. Przeciwnie, krótsze USV o częstotliwości 50 kHz (>0.3s) są emitowane podczas i w oczekiwaniu na pozytywne interakcje, takie jak karmienie, kopulacja i zabawy społeczne, a zatem zostały powiązane z pozytywnym stanem emocjonalnym zwierzęcia 2,4. Wołania te kojarzono również z wydarzeniami wzmacniającymi związanymi z aktywacją systemu dopaminergicznego 5. Na przykład zwiększoną liczbę USV o częstotliwości 50 kHz wywołano poprzez systemowe wstrzyknięcia kokainy 6 lub d-amfetaminy 7 oraz przebywanie w środowiskach wcześniej parowanych z narkotykami 8-10.
Zasugerowano, że wzrost aktywności lokomotorycznej u gryzoni wiąże się ze zwiększoną motywacją i zachowaniem apetytywnym 11-14. Relacja ta jest jednak w najlepszym razie pośrednia. Badając pojawianie się i trwałość USVs o określonych częstotliwościach, możliwe jest uzyskanie wglądu w efekty emocjonalne różnych aspektów doświadczeń związanych z przyjmowaniem leków.
W tej konfiguracji eksperymentalnej rejestrowano USV bezpośrednio przed oraz w trakcie sesji samopodawania leku. Pozwoliło to na zbadanie rozwoju oczekiwania na lek w okresie bezlekowym bezpośrednio przed rozpoczęciem sesji oraz ocenę bezpośredniego wpływu kokainy na USV. Metoda samopodawania leku umożliwia szczurom bezpośrednią kontrolę poziomu przyjmowanego leku, co pozwala zwierzętom wykształcić dokładne oczekiwania co do czasu i częstotliwości podawania substancji. W rezultacie USV wykryte podczas tych sesji odzwierciedlają precyzyjne oczekiwania dotyczące podania leku. Ponadto USV mogą być oceniane w odstępach czasu poprzedzających dostępność leku (np. antycypacyjne USV), u szczurów otrzymujących leki podawane przez eksperymentatora oraz podczas prób wygaszania reakcji na lek. Dzięki temu można również określić zmiany w stanie afektywnym związane z antycypacją leku, podawaniem leku niezależnym od zachowania zwierzęcia oraz abstynencją od leku. Analizy zmian USV w przebiegu krótkotrwałej i długotrwałej ekspozycji na lek mogłyby dostarczyć bardziej szczegółowej interpretacji wpływu ekspozycji na lek na funkcjonowanie afektywne.
Oprócz eksperymentów z samopodawaniem leków, rejestracje USV w komorach operantowych mogą być również wykorzystywane w różnych innych manipulacjach behawioralnych związanych z nagrodą lub awersją, takich jak spożywanie alkoholu, wzmocnienie pokarmowe oraz procedury warunkowania i wygaszania lęku.
Ważne szczegóły metodologiczne
Ponieważ oprogramowanie MedPC pozwala na precyzyjne manipulowanie warunkami eksperymentalnymi, takimi jak dostępność dźwigni i warunki oświetlenia, jego zastosowanie w połączeniu z rejestracją i analizą USV umożliwia określenie efektów emocjonalnych wywołanych prezentacją sygnałów związanych z lekiem (np. błyskami światła lub innymi bodźcami sensorycznymi) oraz bezpośrednich skutków przyjęcia leku. Aby zapewnić pokrywanie się ram czasowych procedur samopodawania i rejestracji USV, kluczowe jest, aby oba programy (np. MedPC i RECORDER) zostały aktywowane jednocześnie na początku każdej sesji.
Ze względu na ogromną ilość miejsca cyfrowego wymaganego do przechowywania danych USV (np. 10-minutowy plik dźwiękowy zajmuje ok. 250 MB), należy zachować ostrożność w przypadku badania wielu zwierząt jednocześnie na jednym systemie komputerowym. Aby uniknąć błędów podczas rejestracji, komputer rejestrujący musi posiadać znaczną ilość pamięci RAM (1-2 GB). Inne sposoby ograniczania błędów rejestracji obejmują obniżenie rozdzielczości USV podczas nagrywania i/lub zmniejszenie liczby zwierząt badanych w jednym czasie. Ponadto ważne jest, aby badacz zachował czujność wobec wszystkich aspektów gromadzenia danych podczas całej procedury eksperymentalnej. Na przykład nagromadzenie dużej ilości danych rejestracyjnych na dysku twardym może spowodować zatrzymanie programu do rejestracji USV. W takim przypadku program nagrywający musi zostać natychmiast zrestartowany, aby uniknąć utraty danych USV oraz desynchronizacji USV z innymi miarami behawioralnymi.
Warunki środowiskowe mogą wpływać na emitowanie USV. Na przykład dotyk przez nieznanego człowieka może spowodować, że zwierzę zacznie emitować negatywne wołania o częstotliwości 22 kHz, co mogłoby zostać błędnie zinterpretowane jako awersja wobec warunków eksperymentalnych. Dlatego intensywna habituacja poprzez częste obchodzenie się ze zwierzętami przed manipulacjami eksperymentalnymi jest istotnym elementem eksperymentów behawioralnych. Ponadto, ponieważ nowe środowisko może również wywoływać niespecyficzne wołania USV, zwierzęta powinny, jeśli to możliwe, zostać przyzwyczajone do środowiska testowego.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Niniejsza praca została sfinansowana z grantów NIH RO1DA014640 i 3R01DA014640-05S1, Biura Wiceprezesa ds. Badań Uniwersytetu Teksańskiego (C.L.D), Programu Dostaw Leków NIDA oraz stypendium doktoranckiego Bruce-Jones w Centrum Badań nad Alkoholem i Uzależnieniami Waggoner na Uniwersytecie Teksańskim (E.Y.M). Dziękujemy Leah McAleer, Mohamedowi Abdallie, Neha Thakore, Byronowi Barksdale'owi, Tiffany Nguyen, Tian Tian, Hunterowi Owenowi, Proy Phongsawad, Helen Reed, Rachel Chavana, Lindzie Ju i Rosie Maddox za pomoc w analizie danych USV.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pakiet testowy do badania warunkowania instrumentalnego (samopodawania leku) u szczurów |  Med Associates, Inc. | MED-008-CT-B1 | |
| Źródło i detektor podczerwieni (fotowiązki) | Med Associates, Inc. | ENV-253SD ENV-253 | |
| Oprogramowanie Med PC | Med Associates, Inc. | SOF-735 | |
| Jednoprzepływowa pompa strzykawkowa | Razel Scientific Instruments | Model R-E | |
| pelety sacharozowe 45 mg | Bio-Serv | F0042 | |
| Kaniula cewnikowa | Tworzywa sztuczne 1 | C313G-5UP | |
| Avisoft-UltraSoundGate 416H | Avisoft BioAcoustics | Część nr 34163 | |
| Mikrofony ultradźwiękowe | Avisoft BioAcoustics | Część nr 40011 | |
| Oprogramowanie Avisoft-RECORDER | Avisoft BioAcoustics | Część nr 10302 | |
| Oprogramowanie Avisoft-SASLab | Avisoft BioAcoustics | Część nr 10101 | |
| Komputer PC do rejestracji USV | Dell | ||
| Komputer PC do analiz danych z USV | Dell | ||
| Kokaina | RTI International |
Bibliografia
- Brudzynski, S. M. Communication of adult rats by ultrasonic vocalization: biological, sociobiological, and neuroscience approaches. ILAR J. 50 (1), 43-43 (2009).
- Knutson, B., Burgdorf, J., Panksepp, J. Ultrasonic vocalizations as indices of affective states in rats. Psychol Bull. 128 (6), 961-961 (2002).
- Wohr, M., Schwarting, R. K. Maternal care, isolation-induced infant ultrasonic calling, and their relations to adult anxiety-related behavior in the rat. Behav Neurosci. 122 (2), 310-310 (2008).
- Knutson, B., Burgdorf, J., Panksepp, J. Anticipation of play elicits high-frequency ultrasonic vocalizations in young rats. J Comp Psychol. 112 (1), 65-65 (1998).
- Burgdorf, J., Panksepp, J. The neurobiology of positive emotions. Neurosci Biobehav Rev. 30 (2), 173-173 (2006).
- Mu, P. Repeated cocaine exposure induces sensitization of ultrasonic vocalization in rats. Neurosci Lett. 453 (1), 31-31 (2009).
- Ahrens, A. M. Repeated intravenous amphetamine exposure: rapid and persistent sensitization of 50-kHz ultrasonic trill calls in rats. Behav Brain Res. 197, 205-205 (2009).
- Burgdorf, J. Neurobiology of 50-kHz ultrasonic vocalizations in rats: electrode mapping, lesion, and pharmacology studies. Behav Brain Res. 182 (2), 274-274 (2007).
- Knutson, B., Burgdorf, J., Panksepp, J. High-frequency ultrasonic vocalizations index conditioned pharmacological reward in rats. Physiol Behav. 66 (4), 639-639 (1999).
- Anagnostaras, S. G., Schallert, T., Robinson, T. E. Memory processes governing amphetamine-induced psychomotor sensitization. Neuropsychopharmacology. 26 (6), 703-703 (2002).
- Ferrario, C. R. Neural and behavioral plasticity associated with the transition from controlled to escalated cocaine use. Biol Psychiatry. 58 (9), 751-751 (2005).
- Flagel, S. B., Robinson, T. E. Quantifying the psychomotor activating effects of cocaine in the rat. Behav Pharmacol. 18 (4), 297-297 (2007).
- Pierce, R. C., Kalivas, P. W. Locomotor behavior. Curr Protoc Neurosci. Chapter 8 (Unit 8), 1-1 (2007).
Przedruki i uprawnienia
