Pomiar aktywności kalpain w komórkach utrwalonych i żywych za pomocą cytometrii przepływowej

Podsumowanie

W niniejszym artykule szczegółowo opisano protokół pomiaru aktywności kalpainy w komórkach utrwalonych i żywych z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Kalpainy są powszechnie występującymi wewnątrzkomórkowymi, wapniozależnymi, neutralnymi cysteinowymi proteazami¹Kalpainy odgrywają kluczowe role w wielu procesach fizjologicznych, w tym w sygnalizacji, przebudowie cytoszkieletu, regulacji ekspresji genów, apoptozie oraz progresji cyklu komórkowego¹Kalpainy są zaangażowane w wiele patologii, w tym w dystrofie mięśniowe, nowotwory, cukrzycę, chorobę Alzheimera oraz stwardnienie rozsiane¹Regulacja kalpain jest złożona i nie do końca poznana. Poziomy mRNA i białek słabo korelują z aktywnością, co ogranicza zastosowanie technik ekspresji genów lub białek do pomiaru aktywności kalpain. Ten protokół wideo szczegółowo opisuje opracowany w naszym laboratorium test cytometrii przepływowej do pomiaru aktywności kalpain w komórkach utrwalonych i żywych. Metoda ta wykorzystuje fluorescencyjny substrat BOC-LM-CMAC, który jest specyficznie rozszczepiany przez kalpainę, w celu pomiaru jej aktywności.²W tym filmie aktywność kalpainy w utrwalonych i żywych mysich komórkach białaczki 32Dkit, samodzielnie lub jako część populacji splenocytów, jest mierzona przy użyciu analizatora LSRII (BD Bioscience). Wykazano, że komórki 32Dkit wykazują podwyższoną aktywność w porównaniu do prawidłowych splenocytów.

Protokół

Przygotowanie odczynników

Uwaga: Wszystkie roztwory PBS zawierają Ca²⁺ i Mg²⁺

1. Odczyn detekcyjny
   Do PBS o temperaturze pokojowej dodać 20µM 7-amino-4-chlorometylokumaryny, t-BOC-leucyno-metioniny amidu (BOC-LM-CMAC). Każda zawiesina komórkowa będzie wymagać 2mL odczynu detekcyjnego.
2. 1% Paraformaldehyd (utrwalone komórki)
   Rozcieńczyć 4% roztwór zapasowy paraformaldehydu w PBS o temperaturze pokojowej. Do każdej probówki do FACS dodać 1mL 1% paraformaldehydu. Dla każdego warunku eksperymentalnego wymagane są trzy probówki do FACS (np. 32Dkit, 32Dkit + PD150606, 32Dkit + PD98059 wymagają 9 probówek do FACS)
3. PD150606 (inhibitor kalpainy)
   Rozpuścić PD150606 w DMSO do stężenia końcowego 100mM. Ten odczyn oraz wszystkie potraktowane nim komórki należy chronić przed światłem przez cały czas trwania eksperymentu.
4. PD98059 (inhibitor MEK1)
   Rozpuścić PD98059 w DMSO do stężenia końcowego 50mM.

Przygotowanie komórek

1. Hodować komórki 32Dkit w zagęszczeniu 5 x 10⁵ do 1 x 10⁶ komórek na ml w pożywce Opti-MEM uzupełnionej o 5% płodowej surowicy bydlęcej, supernatant z komórek WEHI-3 jako źródło IL-3 (lub dowolne inne źródło IL-3, np. białko rekombinowane), 0,1% 2-merkaptoetanolu oraz antybiotyki.
2. Pobrać 12 x 10⁶ komórki 32Dkit do trzech probówek Falcon o pojemności 15 ml (4 x 10⁶ komórek na probówkę).
3. Odwirować komórki z prędkością 1000 obr./min przez 5 minut przy 15°C.
4. Odssać supernatant. Resuspendować komórki w 2 mL PBS o temperaturze pokojowej.
5. poddać zawiesinę pojedynczych komórek działaniu 50μM PD150606. Należy zabezpieczyć próbkę przed światłem, owijając probówkę Falcon folią aluminiową. Krótko wymieszać na wstrząsarce typu vortex, a następnie inkubować przez dwadzieścia do trzydziestu minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
6. Poddać drugą zawiesinę komórek działaniu 20μM PD98059. Wysiać komórki do 35-milimetrowej szalki do hodowli tkankowej i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37°C.

Oznaczenie kalpainy w utrwalonych komórkach

1. Podczas inkubacji próbek z PD150606 rozpocząć analizę kalpainy w próbkach niepoddanych działaniu inhibitora. W pierwszej kolejności dodać 2 mL odczynnika detekcyjnego do każdej zawiesiny komórkowej. Natychmiast przenieść 1 mL mieszaniny zawiesiny komórkowej z odczynnikiem detekcyjnym do wcześniej przygotowanych probówek do FACS zawierających 1% paraformaldehydu (punkt czasowy 0 minut).
2. Inkubować zawiesiny komórkowe z odczynnikiem detekcyjnym przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieść 1 mL zawiesiny komórkowej do probówki FACS zawierającej 1 mL 1% paraformaldehydu.
3. Kontynuować inkubację zawiesin komórkowych z mieszaniną detekcyjną przez kolejne 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieść 1 mL zawiesiny komórkowej do probówki FACS zawierającej 1 mL 1% paraformaldehydu.
4. Powtórzyć analizę kalpainy w komórkach 32Dkit poddanych działaniu inhibitorów.
5. Utrwalić komórki przez noc w ciemności w temperaturze 4°C.
6. Następnego dnia odwirować komórki przy 1800 RPM przez 5 minut w temperaturze 15°C.
7. Odssać supernatant. Resuspendować komórki w 750 µL PBS. Umieścić komórki na lodzie i przechowywać w ciemności.

Pozyskiwanie danych dla utrwalonych komórek

1. Przeanalizuj komórki przy użyciu cytometru LSR II (BD Bioscience). Filtry należy ustawić dla lasera Lightwave Xcyte (UV), linia wzbudzenia 355nm i moc lasera 25mW, emisja odpowiednio 405 i 450 nm dla substratu i produktu. Filtry pasmowe dla substratu i produktu to 405/20 oraz 450/50. Filtry długoprzepustowe dla substratu i produktu to 405 i 450. Napięcie PMT ustawiono na 350-375 dla substratu oraz 325-350 dla produktu.
2. Skonfiguruj eksperyment w programie BD FACSDiva z następującymi parametrami: forward scatter; side scatter; Indo-1 Blue (log); Indo-1 Violet (log). W arkuszu roboczym ustaw następujące wykresy: wykres kropkowy forward scatter vs. side scatter z bramkowaniem żywych komórek (Rycina 1a), histogram Indo-1 Blue, histogram Indo-1 Violet oraz wykres kropkowy Indo-1 Blue vs. Indo-1 Violet.
3. Zkalibruj urządzenie LSR II za pomocą kuleczek fluorescencyjnych AlignFlow i AlignFlow plus (Invitrogen). Przed każdym eksperymentem należy dostosować napięcie PMT tak, aby szczyt histogramu fluorescencji kuleczek znajdował się w tym samym kanale.
4. Rozpocznij akwizycję danych dla komórek 32Dkit w punkcie czasowym 0 min. W razie potrzeby dostosuj napięcia parametrów. Zdobądź i zarejestruj 10 000 zdarzeń na próbkę.
5. Powtórz akwizycję dla każdej próbki, płucząc urządzenie buforem FACS pomiędzy każdą probówką.
6. Wyeksportuj dane. Upewnij się, że urządzenie LSR II zostało wyczyszczone zgodnie z wytycznymi instytutu.

Analiza aktywności kalpain w żywych komórkach

1. Przygotować zawiesiny komórek jak opisano powyżej, z pominięciem PD150606. Przenieść próbki do urządzenia LSR II i ustawić filtry oraz parametry zgodnie z powyższymi instrukcjami. Przygotować arkusz roboczy jak opisano powyżej. Dołączyć duży wykres kropkowy (dot plot) przedstawiający Indo-1 Blue w funkcji czasu. Ustawić program na zbieranie maksymalnej liczby zdarzeń (bez bramki zatrzymującej).
2. Do jednej zawiesiny komórek 32Dkit dodać 50μM PD150606. Próbkę przechowywać w ciemności i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20-30 minut.
3. Rozpocząć zbieranie danych z zawiesiny komórek 32Dkit bez PD150606. Zastosować niski przepływ na poziomie 200-300 zdarzeń na sekundę. Po 30 sekundach do 1 minuty wyjąć probówkę z urządzenia. Do komórek dodać 20μM BOC-LM-CMAC. Krótko wymieszać w wirówce Vortex, a następnie kontynuować zbieranie danych.
4. Zbierać dane przez 10-20 minut lub do momentu osiągnięcia plateau aktywności kalpain.
5. Powtórzyć kroki 3 i 4 dla komórek 32Dkit traktowanych PD150606.
6. Wyeksportować dane. Upewnić się, że urządzenie LSR II zostało wyczyszczone zgodnie z wytycznymi instytucji.

Analiza aktywności kalpain w złożonych (mieszanych) populacjach komórek

*Niniejszy eksperyment służy do identyfikacji komórek 32Dkit w zawiesinie komórkowej uzyskanej ze śledziony myszy.

1. Pobierz śledziony od każdej myszy. Przeprowadź lizę erytrocytów za pomocą NH₄Cl przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
2. Przygotuj zawiesiny pojedynczych komórek w 2mL PBS.
3. Podziel każdą zawiesinę komórkową na dwie części. Jedną z zawiesin inkubuj z 50μM PD150606 przez 20-30 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.
4. Postępuj zgodnie z powyższym protokołem dla testu aktywności kalpain w komórkach utrwalonych (Kroki 1-6).
5. Odsuń nadsącz za pomocą aspiratora. Przemyj komórki w 500μL PBS. Odsuń nadsącz.
6. Resuspenduj komórki w 200μL buforu do barwienia z 2% BSA. Inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
7. Przygotuj przeciwciało pierwotne (FITC anty-mysi CD117). Przeciwciało należy rozcieńczyć 1:200 w buforze do barwienia. Należy zapewnić przechowywanie przeciwciała w ciemności.
8. Dodaj 200μL przeciwciała pierwotnego do komórek. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.
9. Dodaj 400μL PBS, aby zwiększyć objętość próbki do cytometrii przepływowej. Umieść komórki na lodzie i przechowuj w ciemności.
10. Postępuj zgodnie z opisem w sekcji Pozyskiwanie danych dla komórek utrwalonych. Dodaj FITC do parametrów i uwzględnij histogram dla FITC w arkuszu roboczym.

Analiza i reprezentatywne wyniki

1. Przeanalizuj dane przy użyciu programu FlowJo (Treestar). Wyznacz bramkę dla żywych komórek na podstawie profilu rozproszenia przedniego i bocznego (Rysunek 1a). Określ średnią fluorescencję dla Indo-Blue w bramce komórek żywych (Rysunek 1b).
2. a) Dla mieszanej populacji komórek
   • wykorzystaj fluorescencję FITC na histogramach i wykresach kropkowych, aby zidentyfikować populację 32Dkit
   • Określ średnią fluorescencję dla Indo-Blue w populacji 32Dkit
3. Użyj programu Microsoft Excel do przedstawienia średniej fluorescencji na wykresie (Rysunek 2a). Oblicz nachylenie linii między 5 a 10 minutą. Przedstaw nachylenie na wykresie słupkowym, aby określić aktywność kalpainy w komórkach (Rysunek 2b).

Rysunek 1a. Wyznaczanie żywych komórek na podstawie profilu rozpraszania przedniego i bocznego.

Rysunek 1b. Średnia zmiana fluorescencji w ciągu 10 minut.

Rycina 2a. Reprezentatywny wykres średniej fluorescencji.

Rysunek 2b. Aktywność kalpainy w komórkach 32Dkit z inhibitorami.

Dyskusja

W niniejszym protokole wideo określono aktywność kalpainy w utrwalonych i żywych komórkach 32Dkit. Leczenie tej linii komórkowej inhibitorem kalpainy PD150606 doprowadziło do całkowitego zahamowania aktywności kalpainy w komórkach. Ponadto zastosowanie inhibitora MEK1 PD98059 również spowodowało całkowite zahamowanie aktywności kalpainy w komórkach. ERK jest głównym aktywatorem kalpainy-2 ³. Wyniki te sugerują, że w komórkach 32Dkit dominuje aktywność kalpainy-2. Obecne prace w naszym laboratorium koncentrują ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyd	Invitrogen		Rozpuścić 4 g paraformaldehydu w 100 ml PBS. W dygestorium podgrzewać próbkę podczas mieszania, aż roztwór stanie się klarowny. Pozostawić do ostygnięcia, a następnie przechowywać w temperaturze 4°C°C
PD150606	Invitrogen		W celu maksymalnego zahamowania aktywności kalpain należy użyć świeżo zrekonstytuowanego związku PD150606.
PD98059	Cell Signaling Technology
probówki FACS AlignFlow, AlignFlow plus z kulkami fluorescencyjnymi	Invitrogen
LSR II	BD Biosciences		W eksperymentach tych jako źródło IL-3 wykorzystuje się nadsącz z hodowli komórek WEHI-3. Każda partia nadsączu z komórek WEHI-3 jest miareczkowana w celu określenia optymalnego stężenia niezbędnego do wzrostu komórek 32Dkit.