Ocena funkcji i energetyki serca w izolowanych sercach myszy za pomocą spektroskopii 31P NMR

Summary

Izolowana perfuzja serca w trybie Langendorffa, w połączeniu ze spektroskopią ³¹P NMR, łączy dziedziny biochemii i fizjologii w jednym eksperymencie. Protokół pozwala na dynamiczny pomiar wysokoenergetycznej zawartości fosforanów i obrotu w sercu przy jednoczesnym monitorowaniu funkcji fizjologicznych. Przy prawidłowym wykonaniu jest to cenna technika w ocenie energetyki serca.

Abstract

Bioinżynieryjne modele myszy stały się potężnymi narzędziami badawczymi w określaniu związków przyczynowych między zmianami molekularnymi a modelami chorób sercowo-naczyniowych. Chociaż biologia molekularna jest niezbędna do identyfikacji kluczowych zmian w szlaku sygnałowym, nie jest substytutem znaczenia funkcjonalnego. Podczas gdy fizjologia może dostarczyć odpowiedzi na pytanie o funkcję, połączenie fizjologii z biochemiczną oceną metabolitów w nienaruszonym, bijącym sercu pozwala na uzyskanie pełnego obrazu funkcji i energetyki serca. Do realizacji tego zadania nasze laboratorium od lat wykorzystuje izolowane perfuzje serca w połączeniu ze spektroskopią magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Czynność lewej komory ocenia się za pomocą izolowanych perfuzji serca w trybie Langendorffa, natomiast energetykę serca mierzy się, wykonując spektroskopię rezonansu magnetycznego ³¹P perfundowanych serc. Dzięki tym technikom wskaźniki czynności serca w połączeniu z poziomami fosfokreatyny i ATP mogą być mierzone jednocześnie w bijącym sercu. Co więcej, parametry te mogą być monitorowane podczas ustanawiania fizjologicznych lub patologicznych czynników stresogennych. Na przykład można przyjąć protokoły niedokrwienia/reperfuzji lub dużego obciążenia pracą. Zastosowanie opaski aortalnej lub innych modeli patologii serca jest również trafne. Niezależnie od wariantów w ramach protokołu, funkcjonalne i energetyczne znaczenie modyfikacji molekularnych transgenicznych modeli myszy można odpowiednio opisać, co prowadzi do nowego wglądu w powiązane szlaki enzymatyczne i metaboliczne. Dlatego spektroskopia ³¹P NMR w izolowanym perfundowanym sercu jest cenną techniką badawczą w zwierzęcych modelach chorób sercowo-naczyniowych.

Protocol

1. W tych eksperymentach wykorzystuje się jednocześnie dwa oddzielne systemy. W celu uzyskania widm ³¹P, magnes Bruker 14T jest sprzężony z konsolą Avance III i komputerem wyposażonym w oprogramowanie TopSpin V2.1. Do oceny czynności serca podłączony jest specjalnie zbudowany system perfuzji serca z akwizycją danych PowerLab 4/30, wyposażony w oprogramowanie LabChartPro 6 do analizy danych.
2. W dniu eksperymentu 1 litr buforu Krebs-Henseleit przygotowuje się w następujący sposób: 0,5 mM EDTA, 5,3 mM KCl, 1,2 mM_MgSO4, 118 mM NaCl i 25 mM_NaHCO3. Mieszaninę następnie bulgocze się 5% CO₂ / 95% O₂ przez 10-15 minut przed dodaniem 2mM CaCl₂. Na koniec dodaje się substraty w postaci 10 mM glukozy i 0,5 mM pirogronianu.
3. Regulacja temperatury podczas eksperymentu ma kluczowe znaczenie. Podgrzewane cyrkulatory służą do utrzymywania temperatury w zakresie 37,0 - 37,5°C, gdy serce znajduje się wewnątrz magnesu. Temperatura jest monitorowana przez cały czas trwania eksperymentu za pomocą światłowodowej sondy temperatury.
4. Ciśnienie perfuzyjne i ciśnienie w lewej komorze są monitorowane za pomocą przetworników ciśnienia podłączonych do systemu akwizycji danych i wyświetlane za pomocą dołączonego oprogramowania. Są one kalibrowane za pomocą standardowego ciśnieniomierza przed eksperymentem. Ponadto przewody ciśnieniowe są odpowiednio przepłukiwane w celu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza.
5. Standardowa próbka 150 mM fosforanu sodu (co odpowiada sile jonowej buforu KH) jest używana do "kalibracji" sondy przed wprowadzeniem serca. Ułatwia to sygnał i skraca czas niezbędny do rozpoczęcia okresu akwizycji po umieszczeniu serca w sondzie.
6. Aby zmniejszyć krzepliwość, myszowi wstrzykuje się 200 jednostek heparyny IP. Po 5 minutach podaje się pentobarbital sodu (175 mg/kg) I.P.
7. Serce zostaje szybko wycięte (z nienaruszonymi płucami i grasicą) i zatrzymane w lodowatym buforze KH.
8. Podczas trzymania na lodzie płuca są szybko usuwane. Płaty grasicy są identyfikowane i delikatnie odklejane, aby odsłonić aortę. Grasica jest usuwana. Aorta jest następnie izolowana poprzez ostrożne usunięcie otaczającej tkanki.
9. Kleszczyki do szycia mikro służą do delikatnego przytrzymywania obu ścian aorty w celu odsłonięcia światła. Aorta jest ostrożnie umieszczana na kaniuli wykonanej z rurki polietylenowej o średnicy zewnętrznej 0,965 mm (PE50). Aorta jest utrzymywana na miejscu za pomocą zacisku mikronaczyniowego, podczas gdy szwy są szybko wiązane wokół aorty. Klips jest usuwany, a kleszcze są używane do dokładnego sprawdzenia, czy kaniula znajduje się powyżej korzenia aorty. W razie potrzeby dodawane są dodatkowe wiązania, aby utrzymać serce na miejscu.
10. Wszelkie dodatkowe tkanki są usuwane za pomocą kleszczy i mikronożyczek. W lewej małżowinie usznej wykonuje się małe nacięcie. Rurka polietylenowa o średnicy zewnętrznej 0,61 mm (PE10) jest ostrożnie wkładana przez lewe przedsionki, jamę lewej komory i wyjmowana przez wierzchołek, delikatnie trzymając serce. Nadmiar rurki jest przycinany.
11. Opróżniony balon wypełniony wodą jest wprowadzany przez przedsionek do lewej komory i jest utrzymywany na miejscu za pomocą taśmy klejącej lub szwów. Prędkość pompy perystaltycznej jest stopniowo zwiększana, aby zapewnić wystarczający przepływ do serca. Dopóki serce nie zostanie umieszczone w sondzie NMR, serce będzie nadal perfundowane ze stałym przepływem równym około 2 ml / min. Balon niskiego napięcia jest nadmuchiwany niewielką objętością za pomocą strzykawki mikrometrycznej w celu sprawdzenia, czy przetwornik ciśnienia niskiego napięcia działa.
12. Serce jest ostrożnie wkładane do 10-milimetrowej rurki NMR. "Kołpak" o szerokim otworze służy do prowadzenia rurki do właściwej pozycji w sondzie. Cały aparat jest następnie mocno przymocowany do "pępowiny" za pomocą taśmy klejącej.
13. Pępowina jest powoli opuszczana do górnego otworu magnesu, aż rurka serca/NMR znajdzie się wewnątrz cewki sondy NMR 10 mm.
14. Gdy serce znajdzie się we właściwej pozycji w sondzie, przepływ pompy perystaltycznej jest regulowany w celu osiągnięcia ciśnienia perfuzyjnego 80 mmHg. (Pamiętaj, że do tego momentu serce było przepełnione stałym przepływem około 2 ml/min). Ciśnienie perfuzji jest następnie utrzymywane poprzez włączenie mechanizmu "wstrzymania" na sterowniku pompy. Serce ma wtedy 15-20 minutowy okres równowagi. W tym czasie objętość balonu LV jest dostosowywana tak, aby osiągnąć ciśnienie rozkurczowe 8-10 mmHg.
15. W okresie równowagi konieczna jest optymalizacja parametrów spektrometru w celu uzyskania jak najlepszego sygnału fosforowego. Osiąga się to poprzez ustawienie impulsu radiowego na częstotliwość, przy której rezonuje jądro fosforu ("strojenie") i ujednolicenie pola magnetycznego ("shimming").
16. Po okresie równowagi można uzyskać wielokrotne widma ³¹P NMR. Okres akwizycji dla każdego widma zależy od natężenia pola magnesu, wielkości próbki i stosunku sygnału do szumu wymaganego dla konkretnego eksperymentu. Widma uzyskuje się za pomocą magnesu o mocy 14 Telsa poprzez uśrednienie sygnału uzyskanego z 256 impulsów o częstotliwości radiowej o długości 20 μs z kątem odwrócenia 60 stopni i opóźnieniami 2,0 sekundy. Ten eksperyment będzie trwał około 10 minut.

Reprezentatywne wyniki

Z poziomu sprzętu do akwizycji danych i oprogramowania LabChart, kilka parametrów funkcji serca może być mierzonych w całym protokole eksperymentalnym. Typową miarą czynności serca, ciśnieniem rozwiniętym w lewej komorze (LVDevP), uzyskuje się przez odjęcie ciśnienia końcoworozkurczowego (EDP) od ciśnienia skurczowego (ryc. 1). Miara ta może się różnić w zależności od obciążenia myszy i stanu serca (tj. przeciążenia ciśnieniowego). Jednak w normalnym sercu myszy C57BL6 LVDevP wynosi zwykle między 100-110 mmHg przy stałym ciśnieniu końcoworozkurczowym 8-10 mmHg. Dodatkowo program LabChart pozwala na pomiar tętna w oparciu o cykliczne pomiary fal ciśnienia nn. Ponownie, ta miara może się różnić, ale typowe wartości to 350-400 uderzeń na minutę, gdy serca mogą bić w tempie wewnętrznym. Jednak serce można ustandaryzować za pomocą systemu stymulacji, w którym tętno jest utrzymywane na poziomie 420 uderzeń na minutę. Ponadto miary kurczliwości (+dP/dt) i relaksacji (-dP/dt) można oszacować przy użyciu pierwszej pochodnej fali ciśnienia LV. Podczas protokołu eksperymentalnego łatwo jest ocenić mechanizm Starlinga poprzez uwzględnienie zależności ciśnienie-objętość. Osiąga się to poprzez stopniowe zwiększanie objętości balonu nn i odnotowywanie LVDevP oraz EDP. Wartości te można następnie wykreślić, jak pokazano na rysunku 2. Chociaż krzywa Starlinga jest optymalna, odnotowanie objętości niezbędnej do osiągnięcia EDP na poziomie 8-10 mmHg może dać pośrednie wyobrażenie o wymiarze komory LV. Można to zastosować w modelach pasma aortalnego, ponieważ przerośnięte serca zazwyczaj wymagają mniejszej objętości balonu, podczas gdy rozszerzone serca wymagają większej objętości w porównaniu z grupą kontrolną. Tabela 1 przedstawia reprezentatywne dane dotyczące czynności serca uzyskane podczas protokołu perfuzji.

Spektrometr ³¹P NMR dostarczy sygnały fosfokreatyny (PCr) i trzech fosforanów z ATP (γ-ATP, α-ATP i β-ATP), a także fosforanu nieorganicznego (Pi), jak pokazano na rysunku 2. Analiza każdego z tych pików dostarcza wartości dla obszaru pod krzywą. Ilość ATP szacuje się poprzez uśrednienie obszarów γ-ATP i β-ATP. (α-ATP nie jest używany, ponieważ cząsteczki NAD przyczyniają się do nieznanej części całkowitego sygnału). Stan energetyczny serca zależy od ilorazu obszarów PCr i ATP (stosunek PCr:ATP). Wartość ta wynosi zwykle 1,5 - 1,7 w sercu myszy zaopatrzonym w glukozę jako główny substrat. Chociaż ³¹P NMR nie zapewnia bezpośrednich pomiarów ATP lub PCr, powierzchnia pików jest proporcjonalna do ilości związków zawierających fosfor w próbce. Wartości tych sygnałów można oszacować przy użyciu innych metod. Na przykład bezpośrednie pomiary ATP za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w kohorcie serc mogą dać średnie stężenie. Wartość ta może być następnie wykorzystana do kalibracji średnich obszarów ATP obserwowanych w widmach. Stężenie PCr można obliczyć na podstawie powierzchni PCr w stosunku do obszaru ATP. Możliwe jest również oszacowanie pH poprzez analizę względnego przesunięcia chemicznego sygnału fosforanu nieorganicznego (Pi) do sygnału PCr. ¹ Za pomocą różnych sekwencji impulsów radiowych można również zmierzyć prędkość reakcji kinazy kreatynowej lub prędkość reakcji syntezy ATP. ^{cyfra arabska}

Tabela 1. Wyjściowa czynność serca z izolowanych perfuzji serc. LVDevP: ciśnienie w lewej komorze rozwinięte; LVEDP: ciśnienie końcoworozkurczowe lewej komory; HR: tętno; RPP: iloczyn ciśnienia szybkościowego; +dP/dt: pierwsza pochodna dodatniego ciśnienia NN; -dP/dt: pierwsza pochodna ujemnego ciśnienia LV; PP: ciśnienie perfuzyjne; CF: przepływ wieńcowy.

Rysunek 1. Reprezentatywne fale ciśnienia nn z oprogramowania LabChart Pro.

Rysunek 2. Reprezentatywne krzywe szpaka od myszy kontrolnych (linia ciągła) i aortalnych (linia przerywana). A) Funkcja skurczowa reprezentowana przez LVDevP przy rosnących objętościach lewej wysokości, określona przez objętość balonu niskiego napięcia. B) Funkcja rozkurczowa reprezentowana przez EDP przy rosnących objętościach lewej wysokości, określona przez objętość balonu niskiego napięcia. LVDevP: ciśnienie rozwinięte w lewej komorze (ciśnienie skurczowe minus rozkurczowe); EDP: ciśnienie końcoworozkurczowe.

Rysunek 3. Reprezentatywne widma ³¹P NMR izolowanego perfundowanego serca myszy. Zwróć uwagę na stosunkowo mały szczyt liczby Pi. W sercu poddanym perfuzji tlenowej zaopatrzonemu w pirogronian lub kwasy tłuszczowe oprócz glukozy pik ten powinien być minimalny. W okresach niedokrwienia pik ten wzrasta, podczas gdy pik PCr maleje. Zwróć uwagę na ramię po prawej stronie szczytu α-ATP. Jest to wkład cząsteczek NAD. Pi: fosforan nieorganiczny; PCr: fosfokreatyna; ATP: adenozynotrifosforan.

Discussion

^{Rozdział 31}Spektroskopia P NMR w izolowanym sercu myszy z perfuzją Langendorffa dostarcza wiarygodnych i powtarzalnych danych. ^{3, 4} Konieczne jest jednak, aby kaniulacja aorty i wprowadzenie balonu LV były wykonane prawidłowo, aby umożliwić stabilną pracę serca wewnątrz rurki NMR. Ponadto regulacja temperatury ma zasadnicze znaczenie dla osiągnięcia prawidłowej funkcji linii bazowej. Jednym z ważnych czynników w uzyskaniu dobrych, możliwych do analizy widm NMR jest zwiększenie stosunku sygnału do szumu. Można to osiągnąć poprzez zapewnienie optymalnego "strojenia" i "podkładania" na próbce. Jak wspomniano w tekście protokołu, zastosowanie standardowej próbki przed wprowadzeniem serca może to ułatwić. Pomocne jest również posiadanie odpowiedniej wielkości "próbki". Serca ważące mniej niż 100 mg zazwyczaj dostarczają niższe sygnały PCr i ATP, więc wydłużenie czasu akwizycji będzie konieczne do uzyskania dobrych widm fosforu.

Istnieje kilka sposobów modyfikacji istniejącego protokołu w celu uzyskania dodatkowych informacji dotyczących funkcji serca i energetyki. W naszym laboratorium mamy perfundowane serca z mieszanymi substratowymi, które mogą obejmować obecność różnych kombinacji kwasów tłuszczowych (w niskich i wysokich stężeniach), mleczanu, ketonów i insuliny. Dzięki zastosowaniu stabilnych izotopów w buforze perfuzyjnym (tj. substratów znakowanych ¹³C) posiadamy możliwość oszacowania wykorzystania substratu na podstawie względnego udziału znakowanego acetylo-CoA w cyklu TCA. ^5-7 W tym zastosowaniu przeprowadzamy analizę izotopomerów ¹³C3- i ¹³C4- glutaminianu za pomocą spektroskopii ¹³C NMR. Wymaga to zaciśnięcia serca przez zamrożenie na końcu protokołu perfuzji i wykonanie ekstrakcji zamrożonej tkanki. Będzie to dodatkowy eksperyment, ponieważ analiza wymaga użycia innej sondy z osobnymi parametrami ustawienia. Inne zastosowania obejmują substytucję glukozy deoksyglukozą w buforze przy jednoczesnym monitorowaniu zależnej od czasu akumulacji fosforanu 2-deoksyglukozy w sercu za pomocą spektroskopii ³¹P NMR. Metoda ta pozwala na pomiar wychwytu glukozy przez mięsień sercowy. ^{7, 8} Ponadto nasze laboratorium przeanalizowało czynność i energetykę serca w protokołach perfuzji składających się z niedokrwienia/reperfuzji i dużego obciążenia pracą. ^{6, 8-10}

Podsumowując, spektroskopia ³¹P NMR w izolowanych sercach myszy jest technicznie trudną procedurą wymagającą użycia zaawansowanego sprzętu. Jednak dane, które otrzymuje, są nieocenione dla badacza, który chce przeanalizować funkcję i energetykę bioinżynieryjnych modeli myszy. Dla naszego laboratorium techniki te były kluczowe w zrozumieniu konsekwencji różnych stresorów na czynność serca, energetykę i metabolizm. ^{1, 11, 12}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynnik siarczanu magnezu		Sigma-Aldrich	M7506
Odczynnik EDTA		Sigma-Aldrich	E1644
Odczynnik chlorku potasu		Sigma-Aldrich	P4505
Odczynnik wodorowęglan sodu		Sigma-Aldrich	S6297
Odczynnik chlorku sodu		Sigma-Aldrich	S7653
Odczynnik dwuwodny chlorku wapnia		Sigma-Aldrich	C5080
Odczynnik	D-glukozy	Sigma-Aldrich	G7528
Odczynnik pirogronianu sodu		Sigma-Aldrich	P2256
Bruker Ultrashield 600WB Plus	Sprzęt	Bruker Corporation
PowerLab 4/30	Equipment	ADInstruments	ML866/P
LabChart 6 Pro	Equipment	ADInstruments	MLS260/6
Quad Bridge Amp	Equipment	ADInstruments	ML224
Sterownik pompy STH	Sprzęt	ADInstruments	ML175
Pompa perystaltyczna Minipuls 3	Equipment	ADInstruments	ML172
Jednorazowy przetwornik ciśnienia krwi	Sprzęt	ADInstruments	MLT0699
10mm NMR Sample	Tube	Wilmad LabGlass	513-7PP-7
Rurki polietylenowe PE10	Sprzęt	BD Biosciences	427401
Przetwornik ciśnienia fizjologicznego	Equipment	ADInstruments	MLT844
Rurka polietylenowa PE50	Sprzęt	BD Biosciences	427411
Strzykawka mikrometryczna	Sprzęt	Gilmont Instruments	GS-1101
Kleszcze McPhersona	Sprzęt Miltex	Inc.	18-949
Mikronożyczki Castraviejo	Sprzęt	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5650
Neoptix		Neoptix, Inc.	Odruch - 1