Ocena funkcji i energetyki serca w izolowanych sercach myszy z wykorzystaniem spektroskopii 31P NMR

Podsumowanie

Perfuzja izolowanego serca w trybie Langendorffa, w połączeniu ze spektroskopią NMR ³¹P, łączy dziedziny biochemii i fizjologii w jednym eksperymencie. Protokół ten umożliwia dynamiczny pomiar zawartości i obrotu fosforanów wysokoenergetycznych w sercu przy jednoczesnym monitorowaniu funkcji fizjologicznych. Prawidłowo wykonana, technika ta stanowi cenne narzędzie w ocenie energetyki serca.

Streszczenie

Bioinżynieryjne modele mysie stały się potężnymi narzędziami badawczymi w określaniu związków przyczynowo-skutkowych między zmianami molekularnymi a modelami chorób układu sercowo-naczyniowego. Chociaż biologia molekularna jest niezbędna do zidentyfikowania kluczowych zmian w szlakach sygnalizacyjnych, nie może ona zastąpić oceny znaczenia funkcjonalnego. Podczas gdy fizjologia pozwala odpowiedzieć na pytania dotyczące funkcji, połączenie fizjologii z biochemiczną oceną metabolitów w nienaruszonym, bijącym sercu pozwala na uzyskanie pełnego obrazu funkcji i energetyki serca. Przez lata w naszym laboratorium wykorzystywaliśmy perfuzję izolowanego serca w połączeniu ze spektroskopią rezonansu magnetycznego jądrowego (NMR) do realizacji tego zadania. Funkcję lewej komory ocenia się za pomocą perfuzji izolowanego serca w trybie Langendorffa, natomiast energetykę serca mierzy się poprzez wykonanie³¹spektroskopia rezonansu magnetycznego P w perfundowanych sercach. Dzięki tym technikom możliwe jest jednoczesne pomiarowanie wskaźników funkcji serca w połączeniu z poziomami fosfokreatyny i ATP w bijących sercach. Ponadto parametry te mogą być monitorowane podczas wprowadzania stresorów fizjologicznych lub patologicznych. Można na przykład zastosować protokoły niedokrwienia/reperfuzji lub obciążenia wysokim wysiłkiem. Odpowiednie jest również zastosowanie opaski aortycznej lub innych modeli patologii serca. Niezależnie od wariantów protokołu, znaczenie funkcjonalne i energetyczne modyfikacji molekularnych w transgenicznych modelach mysich może zostać odpowiednio opisane, co prowadzi do nowych spostrzeżeń na temat powiązanych szlaków enzymatycznych i metabolicznych. W związku z tym,³¹Spektroskopia 31P NMR w izolowanym preparacie perfundowanego serca jest cenną techniką badawczą w modelach zwierzęcych chorób układu sercowo-naczyniowego.

Protokół

1. W tych eksperymentach jednocześnie wykorzystuje się dwa oddzielne systemy. Do pozyskiwania widm ³¹P stosuje się magnes Bruker 14T połączony z konsolą Avance III i komputerem z oprogramowaniem TopSpin V2.1. Do oceny funkcji serca wykorzystuje się specjalnie zbudowany system perfuzji serca połączony z systemem akwizycji danych PowerLab 4/30, wyposażonym w oprogramowanie LabChartPro 6 do analizy danych.
2. W dniu eksperymentu przygotowuje się 1 litr buforu Krebsa-Henseleita w następujący sposób: 0,5mM EDTA, 5,3mM KCl, 1,2mM MgSO₄, 118mM NaCl oraz 25mM NaHCO₃. Mieszaninę napowietrza się 5% CO₂/95% O₂ przez 10-15 minut przed dodaniem 2mM CaCl₂. Na koniec dodaje się substraty w postaci 10 mM glukozy i 0,5mM pirogronianu.
3. Regulacja temperatury podczas eksperymentu jest krytyczna. Do utrzymania temperatury w zakresie 37,0 - 37,5°C podczas przebywania serca w magnesie stosuje się grzałki cyrkulacyjne. Temperaturę monitoruje się przez cały czas trwania eksperymentu za pomocą światłowodowej sondy temperatury.
4. Ciśnienie perfuzyjne i ciśnienie w lewej komorze monitoruje się za pomocą przetworników ciśnienia podłączonych do systemu akwizycji danych, a wyniki wyświetla się w dołączonym oprogramowaniu. Przetworniki te są kalibrowane za pomocą standardowego sfigmomanometru przed rozpoczęciem eksperymentu. Dodatkowo linie ciśnieniowe są odpowiednio przepłukiwane w celu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza.
5. Do „kalibracji” sondy przed wprowadzeniem serca wykorzystuje się standardową próbkę 100 mM fosforanu sodu (co odpowiada sile jonowej buforu KH). Ułatwia to uzyskanie sygnału i skraca czas niezbędny do rozpoczęcia akwizycji po umieszczeniu serca w sondzie.
6. Aby zmniejszyć krzepliwość, myszy wstrzykuje się 200 jednostek heparyny d.o. Po 5 minutach podaje się pentobarbital sodu (175 mg/kg) d.o.
7. Serce jest szybko wycinane (z zachowaniem płuc i grasicy) i zatrzymywane w lodowatym buforze KH.
8. Podczas przechowywania na lodzie szybko usuwa się płuca. Identyfikuje się płaty grasicy i delikatnie odsuwa je, aby odsłonić aortę. Grasicę usuwa się. Następnie izoluje się aortę, ostrożnie usuwając każdą otaczającą ją tkankę.
9. Za pomocą mikropincety delikatnie rozsuwa się obie ściany aorty, aby odsłonić jej światło. Aortę ostrożnie nasuwa się na kaniulę wykonaną z rurki polietylenowej o średnicy zewnętrznej 0,965 mm (PE50). Aortę unieruchamia się mikroklemą naczyniową, podczas gdy wokół aorty szybko zawiązuje się szwy. Klemę zdejmuje się, a za pomocą pincety ostrożnie sprawdza, czy kaniula znajduje się powyżej pierścienia aorty. W razie potrzeby dodaje się kolejne wiązania, aby unieruchomić serce.
10. Nadmiar tkanki usuwa się za pomocą pincety i mikronożyczek. W prawym przedsionku wykonuje się niewielkie nacięcie. Rurkę polietylenową o średnicy zewnętrznej 0,61 mm (PE10) ostrożnie wprowadza się przez lewy przedsionek, jamę lewej komory i wyprowadza przez wierzchołek, delikatnie trzymając serce. Nadmiar rurki odcina się.
11. Wypuszczony z powietrza balon wypełniony wodą wprowadza się przez przedsionek do lewej komory i unieruchamia za pomocą taśmy klejącej lub szwów. Prędkość pompy perystaltycznej stopniowo zwiększa się, aby zapewnić odpowiedni przepływ do serca. Do momentu umieszczenia serca w sondzie NMR, jest ono perfundowane ze stałym przepływem wynoszącym około 2 ml/min. Balon w lewej komorze pompuje się niewielką objętością za pomocą strzykawki mikrometrycznej, aby zweryfikować działanie przetwornika ciśnienia w lewej komorze.
12. Serce ostrożnie wprowadza się do 10 mm probówki NMR. Szeroka końcówka pomocnicza („spinner”) służy do prawidłowego poprowadzenia probówki do odpowiedniej pozycji w sondzie. Cały aparat mocuje się następnie stabilnie do „pępowiny” za pomocą taśmy klejącej.
13. „Pępowinę” powoli opuszcza się do górnego otworu magnesu, aż serce/probówka NMR znajdzie się wewnątrz cewki 10 mm sondy NMR.
14. Po umieszczeniu serca w odpowiedniej pozycji w sondzie, reguluje się przepływ pompy perystaltycznej w celu uzyskania ciśnienia perfuzyjnego 80 mmHg (należy pamiętać, że do tego momentu serce było perfundowane ze stałym przepływem około 2 ml/min). Ciśnienie perfuzyjne jest następnie utrzymywane poprzez aktywację mechanizmu „hold” na sterowniku pompy. Następnie sercu pozwala się na 15-20 minutowy okres ekwilibracji. W tym czasie reguluje się objętość balonu w lewej komorze, aby uzyskać ciśnienie koniec-rozkurczowe na poziomie 8-10 mmHg.
15. Podczas okresu ekwilibracji konieczna jest optymalizacja parametrów spektrometru w celu uzyskania jak najlepszego sygnału fosforu. Osiąga się to poprzez ustawienie impulsu radiowego na częstotliwości, przy której rezonuje jądro fosforu („strojenie”) oraz ujednorodnienie pola magnetycznego („shimming”).
16. Po okresie ekwilibracji można uzyskać wiele widm ³¹P NMR. Czas akwizycji dla każdego widma zależy od natężenia pola magnesu, wielkości próbki i stosunku sygnału do szumu wymaganego dla konkretnego eksperymentu. Widma pozyskuje się przy użyciu magnesu 14 T poprzez uśrednienie sygnału otrzymanego z 256 impulsów częstotliwości radiowej o czasie trwania 20 μs, kącie odchylenia 60 stopni i opóźnieniach wynoszących 2,0 sekundy. Eksperyment ten trwa około 10 min.

Reprezentatywne wyniki

Za pomocą sprzętu do akwizycji danych oraz oprogramowania LabChart można mierzyć kilka parametrów funkcji serca w trakcie protokołu eksperymentalnego. Typowa miara funkcji serca, czyli ciśnienie rozwinięte lewej komory (LVDevP), jest uzyskiwana poprzez odjęcie ciśnienia koniec-rozkurczowego (EDP) od ciśnienia skurczowego (Rysunek 1). Wartość ta może się różnić w zależności od szczepu myszy i stanu serca (np. przeciążenia ciśnieniowego). Jednak w normalnym sercu myszy C57BL6 LVDevP wynosi zazwyczaj od 100-110 mmHg przy stałym ciśnieniu koniec-rozkurczowym 8-10 mmHg. Ponadto program LabChart umożliwia pomiar częstości akcji serca na podstawie cyklicznych pomiarów fal ciśnienia w LV. Ta miara również może być zmienna, ale typowe wartości to 350-400 bpm, gdy serca biją z własną częstością. Serce można jednak zestandaryzować za pomocą systemu stymulacji, w którym częstość akcji serca jest utrzymywana na poziomie 420 bpm. Dodatkowo, miary kurczliwości (+dP/dt) i rozkurczu (-dP/dt) można oszacować, korzystając z pierwszej pochodnej fali ciśnienia w LV. W trakcie protokołu eksperymentalnego łatwo jest ocenić mechanizm Starlinga, uwzględniając zależność ciśnienie-objętość. Osiąga się to poprzez stopniowe zwiększanie objętości balonika w LV i odnotowywanie wartości LVDevP oraz EDP. Wartości te można następnie przedstawić na wykresie, jak pokazano na Rysunku 2. Choć krzywa Starlinga jest rozwiązaniem optymalnym, odnotowanie objętości niezbędnej do osiągnięcia EDP na poziomie 8-10 mmHg może pośrednio wskazać wymiary komory LV. Może to być wykorzystane w modelach przewiązania aorty (aortic banding), ponieważ serca przerostowe zazwyczaj wymagają mniejszej objętości balonika, natomiast serca rozszerzone wymagają większej objętości w porównaniu z grupą kontrolną. Tabela 1 przedstawia reprezentatywne dane dotyczące funkcji serca pozyskane podczas protokołu perfuzji.

Spektrometr NMR ³¹P dostarczy sygnałów fosfokreatyny (PCr) i trzech fosforanów z ATP (γ-ATP, α-ATP i β-ATP), a także fosforanu nieorganicznego (Pi), jak pokazano na Rysunku 2. Analiza każdego z tych piku pozwala wyznaczyć wartość pola pod krzywą. Ilość ATP szacuje się poprzez uśrednienie pól γ-ATP i β-ATP. (Z α-ATP nie korzysta się, ponieważ cząsteczki NAD wnoszą nieznaną część do całkowitego sygnału). Stan energetyczny serca określa się poprzez iloraz pól PCr i ATP (stosunek PCr:ATP). Wartość ta wynosi zazwyczaj 1,5 - 1,7 w sercu myszy, w którym głównym substratem jest glukoza. Chociaż NMR ³¹P nie zapewnia bezpośrednich pomiarów ATP lub PCr, pole pików jest proporcjonalne do ilości związków zawierających fosfor w próbce. Wartości tych sygnałów można oszacować za pomocą innych metod. Na przykład bezpośrednie pomiary ATP za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w kohorcie serc mogą pozwolić na wyznaczenie średniego stężenia. Wartość tę można następnie wykorzystać do kalibracji średnich pól ATP zaobserwowanych w widmach. Stężenie PCr można obliczyć na podstawie pola PCr w stosunku do pola ATP. Możliwe jest również oszacowanie pH poprzez analizę względnego przesunięcia chemicznego sygnału fosforanu nieorganicznego (Pi) względem sygnału PCr.¹ Przy zastosowaniu różnych sekwencji impulsów radiowych można również zmierzyć prędkość reakcji kinazy kreatynowej lub prędkość reakcji syntezy ATP.²

Tabela 1. Wyjściowa funkcja serca w izolowanych perfundowanych sercach. LVDevP: ciśnienie rozwinięte lewej komory; LVEDP: ciśnienie końcoworozkurczowe lewej komory; HR: częstość akcji serca; RPP: produkt ciśnienia i częstości; +dP/dt: pierwsza pochodna ciśnienia w LV dodatnia; -dP/dt: pierwsza pochodna ciśnienia w LV ujemna; PP: ciśnienie perfuzji; CF: przepływ wieńcowy.

Rycina 1. Reprezentatywne fale ciśnienia w LV z oprogramowania LabChart Pro.

Rycina 2. Reprezentatywne krzywe Starlinga dla myszy z grupy kontrolnej (linia ciągła) i z przymięciem aorty (linia przerywana). A) Funkcja skurczowa przedstawiona jako LVDevP w funkcji rosnących objętości LV, określonych na podstawie objętości balonu LV. B) Funkcja rozkurczowa przedstawiona jako EDP w funkcji rosnących objętości LV, określonych na podstawie objętości balonu LV. LVDevP: ciśnienie rozwinięte lewej komory (ciśnienie skurczowe minus rozkurczowe); EDP: ciśnienie koniec-rozkurczowe.

Rycina 3. Reprezentatywne widma ³¹P NMR izolowanego perfundowanego serca myszy. Zwróć uwagę na stosunkowo mały pik Pi. W sercu perfundowanym tlenowo, któremu oprócz glukozy podano pirogronian lub kwasy tłuszczowe, pik ten powinien być minimalny. W okresach niedokrwienia pik ten wzrasta, podczas gdy pik PCr maleje. Zwróć uwagę na ramię po prawej stronie piku α-ATP. Jest to wkład cząsteczek NAD. Pi: fosforan nieorganiczny; PCr: fosfokreatyna; ATP: trifosforan adenozyny.

Dyskusja

Spektroskopia ³¹P NMR w izolowanym sercu myszy poddanym perfuzji w układzie Langendorffa dostarcza wiarygodnych i powtarzalnych danych.^{3, 4} Niezbędne jest jednak, aby kaniulacja aorty oraz wprowadzenie balonu do lewej komory (LV) zostały wykonane prawidłowo, tak aby zapewnić stabilną pracę serca podczas przebywania w probówce NMR. Ponadto kluczowa jest regulacja temperatury w celu osiągnięcia właściwej funkcji bazowej. Ważnym czynnikiem w uzyskaniu dobrych, możliwych do analizy widm NMR jest zwiększenie stosunku sygnału do szumu. Można to osiągnąć poprzez zapewnienie optymalnego „strojenia” (tuning) i „symetryzowania” (shimming) próbki. Jak wspomniano w tekście protokołu, zastosowanie próbki standardowej przed wprowadzeniem serca może w tym pomóc. Przydatne jest również posiadanie próbki o odpowiedniej wielkości. Serca o masie poniżej 100 mg zazwyczaj dają słabsze sygnały PCr i ATP, dlatego konieczne będzie wydłużenie czasu akwizycji w celu uzyskania dobrych widm fosforowych.

Istnieje kilka sposobów modyfikacji istniejącego protokołu w celu uzyskania dodatkowych informacji na temat funkcji i energetyki serca. W naszym laboratorium przeprowadzaliśmy perfuzję serc z użyciem buforów z mieszanymi substratami, które mogą zawierać różne kombinacje kwasów tłuszczowych (w niskich i wysokich stężeniach), mleczanu, ketonów i insuliny. Dzięki zastosowaniu stabilnych izotopów w buforze perfuzyjnym (np. substratów znakowanych ¹³C), jesteśmy w stanie oszacować wykorzystanie substratów poprzez wzgludej wkład znakowanego acetylo-CoA w cykl TCA.^5-7 W tym zastosowaniu przeprowadzamy analizę izotopomerową glutaminianu ¹³C3 i ¹³C4 za pomocą spektroskopii NMR ¹³C. Wymaga to zamrożenia serca metodą freeze-clamping na koniec protokołu perfuzji oraz przeprowadzenia ekstrakcji z zamrożonej tkanki. Będzie to dodatkowy eksperyment, ponieważ analiza wymaga użycia innej sondy z oddzielnymi parametrami ustawień. Inne zastosowania obejmują zastąpienie glukozy w buforze ksyloglukozą (deoksyglukozą) przy jednoczesnym monitorowaniu zależnej od czasu akumulacji 2-deoksyglukozo-fosforanu w sercu za pomocą spektroskopii NMR ³¹P. Metoda ta pozwala na pomiar poboru glukozy przez mięsień sercowy.^{7, 8} Ponadto w naszym laboratorium analizowano funkcję i energetykę serca w protokołach perfuzyjnych obejmujących niedokrwienie/reperfuzję oraz obciążenie wysokim wysiłkiem.^{6, 8-10}

Podsumowując, spektroskopia NMR ³¹P w izolowanych sercach myszy jest procedurą trudną technicznie, wymagającą zastosowania zaawansowanego sprzętu. Niemniej jednak, uzyskane dzięki niej dane są nieocenione dla badacza pragnącego analizować funkcje i energetykę bioinżynieryjnych modeli mysich. W naszym laboratorium techniki te okazały się kluczowe dla zrozumienia wpływu różnych stresorów na funkcję, energetykę i metabolizm serca.^{1, 11, 12}

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Siarczan magnezu	Odczynnik	Sigma-Aldrich	M7506
EDTA	Odczynnik	Sigma-Aldrich	E1644
Chlorek potasu	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P4505
Sodium bicarbonate	Odczynnik	Sigma-Aldrich	S6297
Chlorek sodu	Odczynnik	Sigma-Aldrich	S7653
Chlorek wapnia dwuwodny	Odczynnik	Sigma-Aldrich	C5080
D-glukoza	Odczynnik	Sigma-Aldrich	G7528
Pirogenan sodu	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P2256
Bruker Ultrashield 600WB Plus	Sprzęt	Bruker Corporation
PowerLab 4/30	Sprzęt	ADInstruments	ML866/P
LabChart 6 Pro	Sprzęt	ADInstruments	MLS260/6
Czwórne mostki wzmacniacza	Sprzęt	ADInstruments	ML224
Sterownik pompy STH	Wyposażenie	ADInstruments	ML175
Minipuls 3 Pompa perystaltyczna	Wyposażenie	ADInstruments	ML172
Jednorazowy przetwornik ciśnienia tętniczego	Sprzęt	ADInstruments	MLT0699
Probówka NMR o długości 10 mm	Sprzęt	Wilmad LabGlass	513-7PP-7
Wąż polietylenowy PE10	Sprzęt	BD Biosciences	427401
Przetwornik ciśnienia fizjologicznego	Sprzęt	ADInstruments	MLT844
Wąż polietylenowy PE50	Sprzęt	BD Biosciences	427411
Szyringe mikrometryczna	Sprzęt	Gilmont Instruments	GS-1101
McPhersona szczypce	Sprzęt	Miltex Inc.	18-949
Cyrkiel mikrochirurgiczne Castraviego	Sprzęt	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5650
Neoptix Signal Conditioner	Sprzęt	Neoptix, Inc.	Odruch – 1