W tym filmie zostaną zaprezentowane metody transuretralnego indukowania zakażeń dróg moczowych u myszy oraz sposoby ilościowego określania zakresu powstałych infekcji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Transuretralna indukcja infekcji dróg moczowych u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badane szczepy bakterii uropatogennych hoduje się na agarze. Zazwyczaj bakterie uropatogenneE. coli(UPEC) oraz inne szczepy mogą być hodowane przez noc na agarze Luria-Bertani (LB) w temperaturze 37°C w powietrzu atmosferycznym. Szczepy UPEC rosną na agarze LB w postaci żółtawo-białych, półprzezroczystych kolonii. Po potwierdzeniu odpowiedniej morfologii kolonii, pojedyncze kolonie są następnie przekładane do hodowli w pożywce płynnej. Pożywka LB może być stosowana dla większości uropatogennych szczepów bakteryjnych. W celu zwiększenia ekspresji pili typu I, będących dobrze zdefiniowanym czynnikiem wirulencji bakterii uropatogennych, można zastosować dwie seryjne, nocne hodowle w pożywce płynnej LB. Hodowle w pożywce płynnej są rozcieńczane do pożądanego stężenia w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Samice myszy w wieku od 8 do 12 tygodni poddaje się znieczuleniu izofluranem i inokuluje bakterie przez cewkę moczową, używając strzykawek 30G z rurkami polietylenowymi. Typowe dawki inokulacyjne, które muszą zostać określone empirycznie dla każdej kombinacji szczepu bakteryjnego i myszy, wynoszą 106do 108cfu na mysz w 10 do 50 µL PBS. Po pożądanym okresie zakażenia (od jednego dnia do kilku tygodni) pobiera się próbki moczu, pęcherz oraz obie nerki. Każdy organ jest rozdrabniany, umieszczany w PBS i homogenizowany w homogenizatorze Blue Bullet. Homogenaty moczu i tkanek są rozcieńczane seryjnie w PBS i wysiewane na odpowiedni agar. Następnego dnia zlicza się jednostki tworzące kolonie.
Protokół
I. Przygotowanie cewników moczowych
- W przypadku każdego pęcherza i nerki myszy przeznaczonych do pobrania próbek, umieść odpowiednio w jednej probówce kriogenicznej 5-6 kulek ze stali nierdzewnej (dla pęcherza, rozmiar 1,6 mm lub mieszanka 0,9-2,0 mm) lub kulek z tlenku cyrkonu (dla nerki, rozmiar 0,5 mm). Probówki z kulkami poddaj autoklawowaniu.
- Po ostygnięciu probówek do temperatury otoczenia, dodaj 20 µL sterylnego PBS do każdej probówki zawierającej kulki ze stali nierdzewnej oraz 40 µL sterylnego PBS do każdej probówki zawierającej kulki z tlenku cyrkonu.
- Przygotowujemy cewniki moczowe zgodnie z opisem Hunga i Hultgrena13. Autoklawuj czystą parę pęsety płaskiej oraz precyzyjne nożyczki (typu irydowego lub podobne) i pozwól instrumentom ostygnąć do temperatury otoczenia. Przetrzyj powierzchnie kaptury z laminarnym przepływem powietrza 70% etanolem. W kapturze odetnij odcinek rurki polietylenowej o długości ok. 30 cm. Aseptycznie nałóż sterylną igłę o rozmiarze 30 G (długość 1/2 cala) na sterylną strzykawkę 3 cc. Chwyć jeden koniec odciętej rurki polietylenowej za pomocą autoklawowanej pęsety i nasuń rurkę na igłę aż do piasty. Odetnij rurkę tak, aby około 2 cm wystawało poza końcówkę igły. Wyjmij cewnik ze strzykawki i umieść go w sterylnej szalce Petriego.
- Aby zmniejszyć ryzyko kontaminacji krzyżowej, przygotowujemy jeden cewnik dla każdej myszy. Po przygotowaniu wszystkich cewników wysterylizuj je, wystawiając w nieprzykrytej szalce Petriego na promieniowanie UV przez co najmniej 30 minut. Nie patrz bezpośrednio w lampy UV i nie wystawiaj żadnej części ciała w kapturze podczas ich działania. Po naświetlaniu UV cewniki można przechowywać przez dłuższy czas w szalce Petriego. Zalecamy uszczelnienie szalki Parafilmem, aby pomóc zachować sterylność.
II. Inokulacja zwierząt
- Myszy powinny trafić do laboratorium co najmniej tydzień przed rozpoczęciem manipulacji eksperymentalnych, aby uniknąć stresogennych czynników zakłócających. Wykorzystuje się samice myszy, ponieważ cewka moczowa samców jest niezwykle trudna do kaniulacji. CBA/J to powszechnie stosowana, podatna na ZUM inbredowa linia myszy. Należy używać myszy w wieku od 8 do 12 tygodni, ponieważ jest to okno dojrzałości immunologicznej przed wystąpieniem starzenia się organizmu. Pierwszego dnia eksperymentu należy zanurzyć końcówkę sterylnej pętli szczepielniczej w fiolce z zamrożonym stokiem bakterii. Zebrać niewielką ilość inokulum i wysiać je na odpowiednią płytkę z agarem. Zazwyczaj bakterie uropatogenne E. coli (UPEC) oraz inne szczepy można hodować przez noc na agarze Luria-Bertani (LB) w temperaturze 37°C w powietrzu otoczenia. Szczepy UPEC rosną w postaci stałych, żółto-białych, półprzezroczystych kolonii na agarze LB. Natychmiast przenieś zapas bakterii z powrotem do zamrażarki. Szczepy bakterii uropatogennych mogą z czasem tracić zjadliwość w wyniku wielokrotnych, seryjnych pasażowań. Dlatego zaleca się wysiewanie nowej płytki z agarem przed każdym eksperymentem.
- W drugim dniu eksperymentu, po potwierdzeniu prawidłowej morfologii kolonii, należy wyizolować pojedyncze kolonie z płytek agarowych i przenieść je do co najmniej 5 ml pożywki płynnej na noc. W przypadku większości szczepów bakterii uropatogennych można stosować bulion LB (37°C, 20 obr./min w powietrzu otoczenia). Nakrętki probówek z pożywką płynną należy pozostawić lekko poluzowane, aby umożliwić napowietrzanie.
- W 3. dniu eksperymentu należy pobrać 10% pierwszej hodowli w pożywce płynnej i ponownie inkubować w pożywce płynnej przez noc (zazwyczaj 37°C oraz 20 obr./min), aby zwiększyć ekspresję pili typu I. Seryjne hodowle w bulionie pomagają zoptymalizować uropatogenność bakterii, ponieważ wykazano, że pili typu I są krytycznym czynnikiem wirulencji dla uropatogenów in vivo1. Nakrętki probówek z kulturą w bulionie należy pozostawić lekko poluzowane, aby umożliwić napowietrzanie.
- W 4. dniu eksperymentu zmierz wartość OD600 hodowli płynnej z 3. dnia. Jeśli nie jest to znane dla badanego szczepu bakteryjnego, należy przeprowadzić seryjne rozcieńczenia dziesięciokrotne z wysiewem na płytki w zakresie co najmniej 7 logów (rozcieńczenia wykonane w PBS, hodowle na agarze LB, 37°C inkubacja przez noc) w celu określenia zależności między OD600 oraz jcf/ml. Przyjmując ogólną zasadę, wartość OD600 wynosząca 0,4–0,5 zazwyczaj odpowiada wartości 1–2x107 jtk na 50 mikrolitrów. Gdy zostanie ustalona zależność między OD600 a po wyznaczeniu wartości jtk/ml można dostosować kulturę w bulionie do wartości OD600 odpowiadającej pożądanej liczbie jtk na mysz w 50 mikrolitrach PBS. W niektórych pracach zasugerowano, że inokulacja 10 mikrolitrów, a nie 50, prowadzi do mniejszego cofania się płynu do nerek6. Jednak większość publikacji donosi o stosowaniu 50 mikrolitrów na mysz. Zazwyczaj pożądana liczba jtk mieści się w zakresie od 10^6 do 10^8 jtk/mysz, jednak każda kombinacja szczepu bakteryjnego i linii myszy wymaga empirycznego sprawdzenia. in vivo.
- Aby zapobiec natychmiastowemu wydaleniu inokulum po instylacji, myszy powinny być pozbawione wody przez co najmniej 30 minut przed wprowadzeniem w znieczulenie ogólne. Innym kluczowym zabiegiem jest doprowadzenie do mikcji przed indukcją znieczulenia poprzez chwycenie myszy za kark i delikatne uciśnięcie dolnej części brzucha. Bezpieczną dawką indukcyjną dla 8–12-tygodniowych samic myszy szczepu CBA jest 2–2,5% izofluranu, a następnie podtrzymanie znieczulenia przy użyciu 1,8–2% izofluranu.
- Po uzyskaniu znieczulenia myszy ułożone są w pozycji wyprostowanej na plecach, z głową umieszczoną w masce nosowej podłączonej do tlenu z izofluranem. Dolną część brzucha masuje się, aby opróżnić pęcherz moczowy z moczu. Jeśli pęcherz jest względnie pusty, ten zabieg może nie przynieść efektu. Dolną część brzucha oraz krocze przemywa się 70% etanolem.
- Do pobrania pożądanej ilości inokulum bakteryjnego używa się sterylnej strzykawki o pojemności 1 cm³ bez igły. Następnie na strzykawkę w sposób aseptyczny nakłada się sterylny cewnik moczowy. Nadmiar rurki cewnika odcina się nożyczkami tak, aby dystalnie od końcówki igły pozostało jedynie 1–2 milimetry rurki. Następnie należy opukać strzykawkę i w pozycji pionowej wcisnąć tłok, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza. Porcję bakteriostatycznego żelu nawilżającego wyciska się na sterylną płytkę Petriego lub wewnętrzną stronę sterylnego opakowania strzykawki. Końcówkę cewnika (z przymocowaną strzykawką) zanurza się w żelu. W przypadku testowania wielu szczepów bakteryjnych w ramach jednego eksperymentu należy uważać, aby nie używać tej samej kropli żelu do nawilżania cewników zawierających różne szczepy.
- Przy użyciu stereomikroskopu (zakres powiększeń od 0,8x do 5x) sromowe przysłony łyszeczki łonecznej znieczulonej myszy są delikatnie chwytane niedominującą ręką za pomocą pęsety z drobnymi zębami i uniesione w kierunku głowowym, aby odsłonić ciemnoróżowy ujście cewki moczowej (Rycina 1). Strzykawka (z dołączonym cewnikiem) jest trzymana w dominującej ręce chwytem pisarskim, a końcówka cewnika zostaje wprowadzona do ujścia cewki moczowej pod kątem 45 stopni. Przysłona łyszeczki łonecznej jest rozciągana wzdłuż osi podłużnej strzykawki, co w efekcie „nakłada” cewkę moczową na cewnik. Manewr ten jest niezbędny, ponieważ cewka moczowa myszy jest nadmiarowa. Cewnik powinien łatwo wsunąć się do pęcherza (aż do stopki, Rycina 2); można go delikatnie obracać, aby pomóc w pokonaniu nadmiarowych fałdów cewki moczowej. Po dotarciu cewnika do stopki strzykawkę można opuścić, aż znajdzie się ona równolegle do osi podłużnej ciała myszy. Niedominująca ręka może zwolnić pęsetę, aby pomóc w stabilizacji pozycji cewnika i strzykawki, podczas gdy dominująca ręka jest wykorzystywana do powolnego wstrzykiwania inokulum (przez co najmniej 5 sekund). Jeśli podczas wtryskiwania widoczny jest wyciek płynu wokół cewnika, oznacza to, że pęcherz jest pełny lub cewnik znajduje się w pochwie (bezpośrednio za cewką moczową). Wtryskiwanie należy natychmiast przerwać i dokładnie sprawdzić położenie cewnika. Jeśli cewnik znajdował się w cewce moczowej, dana mysz nie powinna być włączona do eksperymentu. Z kolei cewnik błędnie wprowadzony do pochwy można repositionować i ponownie podjąć próbę wstrzyknięcia. Po zakończeniu procedury cewnik i strzykawka są powoli wycofywane z organizmu myszy.
- Aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wczesnego mikczenia po inokulacji, który może doprowadzić do usunięcia podanych bakterii i w konsekwencji do zmiennego poziomu infekcji, niektórzy badacze utrzymują myszy w znieczuleniu przez 30 minut po inokulacji przezcewkowej10. Po zabiegu myszy powinny regenerować się na czystym termoforze/podgrzewaczu pod ciągłą obserwacją w celu potwierdzenia powrotu do prawidłowego rytmu oddychania i aktywności. Po całkowitym odzyskaniu zdolności do pełzania zwierzęta mogą zostać przeniesione do klatek z podścieliskiem.
III. Pomiar CFU w zakażonej tkance
- W różnych publikacjach dotyczących infekcji dróg moczowych (UTI) u myszy zgłaszano wyniki hodowli od 6 godzin do jednego tygodnia lub dłużej po inokulacji. Optymalne punkty czasowe muszą zostać określone empirycznie dla każdej kombinacji szczepu bakteryjnego i szczepu myszy. Mocz oddany naturalnie pobiera się do hodowli, trzymając mysz za kark nad sterylną płytką Petriego. Zebrany mocz powinien być przez cały czas przechowywany w lodzie. Może być konieczne przeprowadzenie wielu prób pobrania moczu w ciągu wielu godzin, ponieważ oddawanie moczu przez myszy jest częste, odbywa się w małych objętościach (30-10 microliters na raz) i zależy od poziomu stresu zwierzęcia.
- Po pobraniu próbek moczu oddanego naturalnie, uśmiercamy myszy przy użyciu izofluranu i zwichnięcia kręgów szyjnych. Brzuszek otwiera się aseptycznie. Jeśli wcześniej nie udało się pobrać próbki moczu oddanego naturalnie, niewielką ilość moczu można często aspiratorowo pobrać przez ścianę pęcherza za pomocą strzykawki z igłą 30G.
- Wycinamy jedną lub obie nerki, siekamy je na co najmniej 4 części (każda część powinna ważyć mniej niż 50 micrograms) na sterylnej płytce Petriego i umieszczamy w probówkach kriogenicznych zawierających kulki cyrkonowe oraz PBS, przechowywanych w lodzie. Wycinamy pęcherz moczowy, siekamy go na co najmniej 4 części i umieszczamy w probówkach kriogenicznych zawierających kulki ze stali nierdzewnej oraz PBS, przechowywanych w lodzie. Probówki z tkanką, kulkami i PBS umieszczamy w homogenizatorze Bullet Blender i homogenizujemy tkanki przy ustawieniu prędkości „8” przez jedną minutę. Po homogenizacji często pozostają niektóre fragmenty tkanki. Dopóki można pipetować 50-10 microliters ciekłego homogenatu, fragmenty stałe nie stanowią problemu. Jeśli czas homogenizacji zostanie wydłużony dla niektórych próbek, jest krytyczne, aby zrobić to dla wszystkich tkanek w celu zachowania spójności procesu. Używamy homogenizatora Bullet Blender, ponieważ zapobiega on możliwości kontaminacji krzyżowej, jest szybszy niż przetwarzanie poszczególnych próbek jedna po drugiej za pomocą standardowego homogenizatora i nie powoduje znacznego nagrzewania homogenizowanych próbek.
- W płytce mikrotitracyjnej należy wykonać co najmniej dwa lub trzy dziesięciokrotne rozcieńczenia zebranego moczu i homogenatów tkankowych. W przypadku eksperymentów wstępnych zasadne może być wykonanie co najmniej siedmiu dziesięciokrotnych rozcieńczeń. Do odpowiedniego agaru wysiewa się do 10 microliters moczu, homogenatów pęcherza i/lub nerek. Ponieważ objętość próbek moczu może być ograniczona, konieczne może być uzupełnienie ich objętości do 100 microliters przed wykonaniem dziesięciokrotnych rozcieńczeń. Jeśli jest to wymagane, początkowe rozcieńczenie (przed rozcieńczeniem dziesięciokrotnym) musi zostać uwzględnione w końcowych obliczeniach wydajności bakteryjnej. Preferujemy hodowlę UPEC na agarze z błękitem metylenowym i eozyną lub agarze MacConkey (inkubacja nocna w 37°C), ponieważ podłoża te są selektywne dla organizmów Gram-ujemnych. Szczepy UPEC rosną na agarze MacConkey jako centralnie pęknięte, czerwono-różowe kolonie ze względu na zdolność do fermentacji laktozy.
- Po nocnej inkubacji należy policzyć cfu dla każdej płytki. W przypadku próbek rozcieńczanych seryjnie, za najbardziej dokładny uznaje się wynik z płytki o rozcieńczeniu zawierającym 50-10 kolonii. Należy obliczyć wstecznie cfu na tkankę, na milligram tkanki lub na ml.
IV. Reprezentatywne wyniki
Rycina 1. Zewnętrzny otwór cewki moczowej (tkanka ciemnoróżowa) odsłonięty poprzez uniesienie wobecu kaptura łoneczkowego pęsetą (powyżej górnej krawędzi zdjęcia)
Rysunek 2. Cewnikowana cewka moczowa. Rozdwojony łysik jest widoczny bezpośrednio nad cewnikiem.
Rysunek 3. Liczba jednostek tworzących kolonie (CFU) w pęcherzu 2 dni po zakażeniu przezcewkowym 8-tygodniowych samic myszy CBA/J szczepem uropatogennym E. coliPęcherze poddano homogenizacji, a liczbę jtk/ml określono poprzez seryjne rozcieńczenia i posiew na agar MacConkey. Romby wskazują liczbę jtk/ml dla poszczególnych myszy, pozioma kreska oznacza medianę jtk/ml.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Indukcja zakażenia dróg moczowych u myszy poprzez przezcewkowe inokulowanie bakterii jest uznaną, lecz wymagającą technicznie procedurą11. Hung i Hultgren opublikowali niedawno doskonały przegląd technik przezcewkowych indukowania zakażeń dróg moczowych u myszy13. W niniejszej pracy staramy się dokładniej omówić szczegóły tego podejścia eksperymentalnego.
Osoby początkujące mogą ćwiczyć technikę, wykonując laparotomię po linii środkowej w celu odsłonięcia pęcherza, wst...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Shelly Xie oraz Jennifer Payne za ekspercką pomoc techniczną. Praca ta była możliwa dzięki grantom przyznanym przez Society of Pediatric Urology oraz Stanford Pediatric Research Fund.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówki kriogeniczne, 2,0 ml, polipropylenowe (bez nakrętek) | E&K Scientific | 640201 | |
| Nakrętki do probówek kriogenicznych, z pierścieniem uszczelniającym ’O’ | E&K Scientific | 440011-N | |
| Homogenizator kuleczkowy (Bullet Blender) | Next Advance | BBX24 | |
| Kuleczki z tlenku cyrkonu (0,5 mm) | Next Advance | ZROB05 | |
| Kuleczki ze stali nierdzewnej (1,6 mm) | Next Advance | SSB16 | |
| Mieszanka kuleczek ze stali nierdzewnej (0,9-2,0 mm) | Next Advance | SSB14B | |
| Myszy CBA/J, samice w wieku 8-12 tygodni | Jackson Laboratory | 000656 | |
| Fosforanowy bufor solny (NaCl 137mM, KCl 2,7mM, Na2HPO4 4,3mM, KH2PO4 1,4mM) | EMD Millipore | EM-SX0420-13 (NaCl) EM-PX1405-1 (KCl) EM1.06585.0 (Na2HPO4) EM-5108-1 (KH2PO4) | |
| Agar LB | |||
| Pożywka LB (broth) | EMD Millipore | 1.10285.0500 | |
| Izofluran (Aerrane) | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
| Pętlaki do posiewu | Fisher Scientific | 22-363-601 | |
| Proszek do przygotowania agaru z eozyną i błękitem metylenowym (EMB) | Himedia Laboratories | MM022-500G | |
| Proszek do przygotowania agaru MacConkeya | Difco Laboratories | 212123 | |
| Proszek do przygotowania agaru LB | Difco Laboratories | 244520 | |
| Przeźroczyste polietylenowe rurki Intramedic, PE10 [średnica wewnętrzna 0,28 mm (0,011 cala); średnica zewnętrzna 0,61 mm (0,024 cala)] | BD Biosciences | 427401 | |
| Igły 30G, 1/2 cala | BD Biosciences | 305106 | |
| Strzykawka tuberkulinowa 1 ml, Slip-Tip | BD Biosciences | 309602 | |
| Strzykawka 3 ml Luer-Lock | BD Biosciences | 309585 |
Bibliografia
- Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice. Infect Immun. 55, 373-380 (1987).
- Rouschop, K. M. Urothelial CD44 facilitates Escherichia coli infection of the murine urinary tract. J Immunol. 177, 7225-7232 (2006).
- Malaviya, R., Ikeda, T., Abraham, S. N. Contribution of mast cells to bacterial clearance and their proliferation during experimental cystitis induced by type 1 fimbriated E. coli. Immunol LettM. 91, 103-111 (2004).
- Lane, M. C., Alteri, C. J., Smith, S. N., Mobley, H. L. Expression of flagella is coincident with uropathogenic Escherichia coli ascension to the upper urinary tract. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16669-16674 (2007).
- Hvidberg, H. Development of a long-term ascending urinary tract infection mouse model for antibiotic treatment studies. Antimicrob Agents Chemother. 44, 156-163 (2000).
- Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model. J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infect Immun. 66, 2798-2802 (1998).
- Gunther, N. W. t, Lockatell, V., Johnson, D. E., Mobley, H. L. In vivo dynamics of type 1 fimbria regulation in uropathogenic Escherichia coli during experimental urinary tract infection. Infect Immun. 69, 2838-2846 (2001).
- Bishop, B. L. Cyclic AMP-regulated exocytosis of Escherichia coli from infected bladder epithelial cells. Nat Med. 13, 625-630 (2007).
- Thumbikat, P., Waltenbaugh, C., Schaeffer, A. J., Klumpp, D. J. Antigen-specific responses accelerate bacterial clearance in the bladder. J Immunol. 176, 3080-3086 (2006).
- Hagberg, L. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Infect Immun. 40, 273-283 (1983).
- Hopkins, W. J., Hall, J. A., Conway, B. P., Uehling, D. T. Induction of urinary tract infection by intraurethral inoculation with Escherichia coli: refining the murine model. J Infect Dis. 171, 462-465 (1995).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nat Protoc. 4, 1230-1243 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
