Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aby zrozumieć mechanizm, dzięki któremu żywe komórki wyczuwają siły mechaniczne oraz sposób, w jaki reagują i adaptują się do swojego środowiska, opracowano nową technologię umożliwiającą badanie zachowania komórek na poziomie subkomórkowym z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. W tym celu mikroskop sił atomowych (AFM) zintegrowano z mikroskopią fluorescencyjną z całkownym wewnętrznym odbiciem (TIRF) oraz konfokalną mikroskopią z szybkoobrotowym dyskiem (FSD). Zintegrowany system znajduje szerokie zastosowanie w szerokim zakresie badań dynamiki molekularnej w dowolnych przylegających żywych komórkach, umożliwiając bezpośrednie obrazowanie optyczne reakcji komórek na stymulację mechaniczną w czasie rzeczywistym. Wykazano znaczną reorganizację filamentów aktynowych i adhezji ogniskowych w wyniku lokalnej stymulacji mechanicznej na apikalnej powierzchni komórki, co wywołało zmiany w strukturze komórkowej w całym ciele komórki. Te innowacyjne techniki dostarczą nowych informacji służących zrozumieniu restrukturyzacji i dynamiki żywych komórek w odpowiedzi na siłę mechaniczną. Przedstawiono szczegółowy protokół oraz reprezentatywny zestaw danych wykazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.
Protokół
1. Przegląd zintegrowanego systemu mikroskopowego
System mikroskopowy wykorzystany w tych badaniach został opisany szczegółowo 1. W skrócie, odwrócony mikroskop Olympus IX-81 z przystawką TIRF (Olympus, Center Valley, PA) został połączony z głowicą skanującą CSU-22 Yokogawa (Yokogawa Electric Inc, Japan). Mikroskop sił atomowych Bioscope SZ (Veeco Instruments Inc, Santa Barbara, CA) jest zamontowany na górze optycznego mikroskopu odwróconego, a cały układ został umieszczony na stole optycznym klasy badawczej (Newport, irvine, CA).
Układ konfokalny składający się ze skanera z dyskiem obrotowym, zewnętrznego koła filtrów i kamery EMCCD (Roper Scientific-Photometrics, Tucson, AZ) jest sztywno połączony z aluminiową płytą podstawową umieszczoną na silikonowej podkładce niezbędnej do tłumienia drgań. Skaner konfokalny łączy się z mikroskopem za pomocą kołnierza z gwintowaną obręczą, która może zostać odłączona od mikroskopu podczas pomiarów AFM, tak aby drgania pochodzące ze skanera z dyskiem obrotowym nie wpływały na pomiary AFM. Laser argonowo-kryptonowy (Spectra Physics, Mountain View, CA) służy jako źródło wzbudzenia zarówno dla trybu obrazowania TIRF, jak i konfokalnego, i może być alternatywnie sprzężony z dwoma światłowodami, które dostarczają wiązkę lasera odpowiednio do przystawki TIRF lub głowicy skanującej. Systemem sterują dwa komputery: oprogramowanie Slidebook kontroluje obrazowanie optyczne, a oprogramowanie Nanoscope steruje AFM.
2. Hodowla komórkowa
Żywe komórki wykazujące ekspresję konstruktów GFP nakierowanych na specyficzne białka należy umieścić w szalku hodowlanym z szklanym dnem na 24 godziny przed eksperymentem zycie stymulacji mechanicznej. W dniu eksperymentu należy wymienić pożywkę hodowlaną na pożywkę bez czerwieni fenolowej. Szalkę hodowlaną montuje się na stoliku AFM za pomocą magnetycznego pierścienia mocującego.
3. Przygotowanie sondy AFM i konfiguracja mikroskopu
Końcówkę AFM zmodyfikowaną 2 micron biotynilowaną kuleczką szklaną należy przemyć pięciokrotnie DPBS, a następnie inkubować przez 5 min z awidyną (1 mg/ml), ponownie przemyć pięciokrotnie DPBS i inkubować przez 5 min z 1 mg/mL biotynilowaną fibronektyną. Na koniec końcówkę należy przemyć jeszcze pięć razy 2, zamontować na skanerze AFM, a następnie wokół uchwytu umieścić ochronną silikonową osłonę. Należy ustawić mikroskop w trybie podglądu wideo, aby wycentrować końcówkę AFM w polu widzenia. Należy skalibrować dźwignię optyczną, kierując wiązkę lasera na sam koniec wspornika, a następnie zmienić obiektyw na obiektyw o dużym powiększeniu odpowiedni do obrazowania pojedynczych komórek. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy wyznaczyć stałą sprężystości końcówki. Parametr ten zostanie zmierzony metodą szumu termicznego (thermal tune) dostępną w oprogramowaniu Nanoscope. Należy przełączyć kamerę z trybu wideo na kamerę EMCCD, aby umożliwić obrazowanie fluorescencyjne. Następnie należy wybrać komórkę i doprowadzić końcówkę AFM do kontaktu z tą konkretną komórką. Po 20 min oczekiwania, niezbędnym do uformowania się silnej adhezji ogniskowej w punkcie kontaktu końcówki AFM z powierzchnią komórki, rozpocznie się procedura stymulacji mechanicznej.
4. Stymulacja mechaniczna żywej komórki
Obrazowanie TIRF 3-4 będzie preferowaną metodą wizualizacji i kwantyfikacji adhezji ogniskowych, natomiast obrazowanie konfokalne z dyskiem obrotowym (spinning-disk) 5 zostanie wykorzystane do wizualizacji cytoszkieletu aktynowego w całym ciele komórki. AFM 6 zostanie użyty w trybie obrazowania kontaktowego w cieczy.
Przed rozpoczęciem procedury stymulacji mechanicznej zostanie wykonany obraz komórki przy użyciu mikroskopii TIRF lub konfokalnej. Stymulację mechaniczną wywoła funkcjonalizowana sonda AFM, która będzie przemieszczać się w górę w dyskretnych krokach co 3-5 min przez określony czas (1-1,5 godziny). Reakcja komórki będzie rejestrowana w sposób ciągły w oprogramowaniu Nanoscope jako seria obrazów wysokości, gdzie każda linia na obrazie reprezentuje jednostkę czasu wynoszącą 1 sec. Podczas pozyskiwania danych AFM operator stale monitoruje pozycję z końcówki AFM, aby określić właściwy moment kolejnego pociągnięcia.
Po każdej stymulacji mechanicznej możliwe jest wykonanie obrazu TIRF lub konfokalnego komórki w oprogramowaniu Slidebook, przy jednoczesnym ciągłym pozyskiwaniu danych AFM. Obrazy optyczne mogą być przetwarzane w trybie off-line w celu stworzenia filmów pokazujących reorganizację cytoszkieletu aktynowego i adhezji ogniskowych. Ponadto każdy obraz może zostać poddany analizie ilościowej w celu określenia powierzchni komórki, powierzchni konkretnych białek oraz analizy ogólnej morfologii komórki.
Po zakończeniu eksperymentu końcówka AFM zostaje wycofana z komory, a następnie w oprogramowaniu Nanoscope dokonuje się pomiaru czułości końcówki AFM.
Eksperyment jest bardzo wrażliwy na zakłócenia! Należy unikać rozmów oraz dotykania mikroskopu w trakcie jego przeprowadzania. Aby zminimalizować poziom szumów w pomiarach AFM, konfokalny mikroskop z dyskiem obrotowym powinien zostać odseparowany od mikroskopu. Czas oczekiwania na utworzenie silnej adhezji ogniskowej między powierzchnią komórki a końcówką AFM może się różnić w zależności od zastosowanego typu komórek oraz macierzy naniesionej na końcówkę.
5. Reprezentatywne wyniki
Rycina 1. Ta sama komórka mięśni gładkich naczyń (VSMC) przetransfekowana actin-mRFP i vinculin-GFP została zobrazowana za pomocą: (A) AFM na apikalnej powierzchni komórki; (B) TIRF na bazalnej powierzchni komórki; oraz (C) konfokalnej mikroskopii z dyskiem obrotowym w całej objętości komórki. Obraz konfokalny przedstawiono jako projekcję maksymalną stosu 3-D. Dobre nakładanie się obrazów AFM i TIRF lub obrazów konfokalnych z dyskiem obrotowym pokazano odpowiednio w (D) i (E). Rozmiar obrazu wynosi 64 x 50 micron.
Rycina 2. Komórka VSMC przetransfekowana aktyną-mRFP została poddana stymulacji mechanicznej za pomocą AFM i obrazowaniu za pomocą konfokalnej mikroskopii z dyskiem obrotowym. Strzałki wskazują włókna aktynowe, które: (a) polimeryzują/pogrubiają się, (b) depolimeryzują/zanikają lub (c) łączą się w pęczki w wyniku przebudowy aktyny. Białe przerywane linie reprezentują końcówkę AFM nad komórką. Rozmiar obrazu 91 x 91 micron.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Cytoszkielet 7-10 oraz adhezje ogniskowe 11-16 to dynamiczne struktury, które montują się, rozpraszają i ulegają wymianie w miarę jak komórki migrują lub reagują na siły mechaniczne 17. Pełnią one istotne funkcje w regulacji wzrostu, przeżywalności i ekspresji genów komórek. Znajomość ich specyficznego rozmieszczenia i dynamiki pozwala na lepsze zrozumienie sposobu, w jaki komórki komunikują się z macierzą oraz między sobą.
Ten nowy system mikroskopowy znajduj...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Plazmid Vinculin-GFP był darem od Kennetha Yamady z National Institutes of Health, National Institute of Dental and Craniofacial Research w Bethesda, Maryland, a plazmid actin-mRFP był darem od Michaela Davidsona z Florida State University w Tallahassee, Florida.
Praca ta była finansowana z grantu NSF Career nr 0747334 oraz AHA-National SDG nr 0835205N przyznanego Andreei Trache.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| igła AFM | Novascan Technologies, Inc. | Kulek borokrzemianowy 2 micron, 0,01N/m, powierzchnia z biotyną | |
| awidyna | Sigma-Aldrich | A9275 | 1mg/mL w DPBS |
| Fibronektyna | Sigma-Aldrich | F4759 | 1 mg/mL |
| DPBS | Invitrogen | 21600-051 | |
| Zestaw do transfekcji Amaxa dla komórek mięśni gładkich | Lonza Inc. | VPI-1004 | |
| Szybka Mattek z dnem szklanym | MatTek Corp. | P60G-1.5-30-F | Sterylne naczynia Falcon 60mm ze szkiełkiem podstawowym nr 1,5 |
Bibliografia
- Trache, A., Lim, S. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).
- Trache, A., Meininger, G. A. Atomic Force Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. Volume 2C 2.1-2.17 (2008).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J Biomed Opt. 6, 6-13 (2001).
- Trache, A., Meininger, G. A. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. 2B 2.1-2.22 (2008).
- Inoue, S., Inoue, T. Direct-view high-speed confocal scanner: the CSU-10. Methods Cell Biol. 70, 87-127 (2002).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. H. Atomic force microscope. Phys Rev Lett. 56, 930-933 (1986).
- Stamenović, D. Cytoskeletal mechanics in airway smooth muscle cells. Respir Physiol Neurobiol. 163, 25-32 (2008).
- Gunst, S. J., Tang, D. D., Opazo Saez, A. Cytoskeletal remodeling of the airway smooth muscle cell: a mechanism for adaptation to mechanical forces in the lung. Respir Physiol Neurobiol. 137, 151-168 (2003).
- Worth, N. F., Rolfe, B. E., Song, J., Campbell, G. R. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganization of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49, 130-145 (2001).
- Romer, H. R., Birukov, K. G., Garcia, J. G. N. Focal Adhesions: paradigm for a signaling nexus. Circulation Research. 98, 606-616 (2006).
- Opazo Saez, A., Zhang, W., Wu, Y., Turner, C. E., Tang, D. D., Gunst, S. J. Tension development during contractile stimulation of smooth muscle requires recruitment of paxillin and vinculin to the membrane. Am J Physiol Cell Physiol. 286, C433-C447 (2004).
- Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix and integrins. Sciences STKE. 119, pe6-pe6 (2002).
- Zamir, E., Geiger, B. Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions. J Cell Sci. 114, 3583-3590 (2001).
- Geiger, B., Bershdsky, A. Assembly and mechanosensory function of focal contacts. Curr Opin Cell Biol. 13, 584-592 (2001).
- Sastry, S. K., Burridge, K. Focal Adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics. Exp Cell Res. 261, 25-36 (2000).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Dev Cell. 10, 11-20 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
