Artykuł metodologiczny

Reakcja żywych komórek na stymulację mechaniczną badana za pomocą zintegrowanej mikroskopii sił optycznych i atomowych

DOI:

10.3791/2072

⸱

4 października 2010

 , 
1Department of Systems Biology and Translational Medicine, College of Medicine, Cardiovascular Research Institute, Texas A&M Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł ma na celu zapoznanie czytelnika z działaniem zintegrowanego mikroskopu do obrazowania optycznego siły atomowej do mechanicznej stymulacji żywych komórek w hodowli. Przedstawiono protokół krok po kroku. Przedstawiono reprezentatywny zestaw danych, który pokazuje odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zrozumieć mechanizm, za pomocą którego żywe komórki odczuwają siły mechaniczne oraz jak reagują i dostosowują się do swojego środowiska, opracowano nową technologię zdolną do badania zachowania komórek na poziomie subkomórkowym z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. W ten sposób mikroskop sił atomowych (AFM) został zintegrowany z mikroskopią fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) i mikroskopią konfokalną z szybko obracającym się dyskiem (FSD). Zintegrowany system ma szerokie zastosowanie w szerokim zakresie badań dynamiki molekularnej we wszystkich przylegających żywych komórkach, umożliwiając bezpośrednie obrazowanie optyczne reakcji komórek na stymulację mechaniczną w czasie rzeczywistym. Wykazano znaczące przegrupowanie włókien aktynowych i zrostów ogniskowych spowodowane miejscową stymulacją mechaniczną na powierzchni komórki wierzchołkowej, która indukowała zmiany w strukturze komórkowej w całym ciele komórki. Te innowacyjne techniki dostarczą nowych informacji potrzebnych do zrozumienia restrukturyzacji i dynamiki żywych komórek w odpowiedzi na siłę mechaniczną. Przedstawiono szczegółowy protokół i reprezentatywny zestaw danych, które pokazują odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przegląd zintegrowanego systemu mikroskopowego

System mikroskopowy, który jest używany do tych badań, został szczegółowo opisany 1. Krótko mówiąc, odwrócony mikroskop Olympus IX-81 z przystawką TIRF (Olympus, Center Valley, PA) jest połączony z głowicą skanującą CSU-22 Yokogawa (Yokogawa Electric Inc, Japonia). Mikroskop sił atomowych Bioscope SZ (Veeco Instruments Inc, Santa Barbara, CA) jest zamontowany na górze optycznego mikroskopu odwróconego, a cały system jest umieszczony na stole optycznym klasy badawczej (Newport, irvine, CA).

Zestaw konfokalny składający się ze skanera wirującego dysku, zewnętrznego koła filtrów i jego kamery EMCCD (Roper Scientific-Photometrics, Tucson, AZ) jest sztywno połączony z aluminiową płytą bazową umieszczoną na silikonowej podkładce niezbędnej do tłumienia drgań. Skaner konfokalny łączy się z mikroskopem za pomocą kołnierza z bieżnikowanym kołnierzem, który można odłączyć od mikroskopu podczas pomiarów AFM, dzięki czemu żadne wibracje ze skanera z wirującym dyskiem nie będą miały wpływu na pomiary AFM. Laser argonowo-kryptonowy (Spectra Physics, Mountain View, CA) jest używany jako źródło wzbudzenia zarówno w trybach obrazowania TIRF, jak i konfokalnego, i może być alternatywnie sprzężony w dwa włókna światłowodowe, które dostarczają laser odpowiednio do przystawki TIRF lub głowicy skanującej. Dwa komputery sterują systemem: oprogramowanie Slidebook steruje obrazowaniem optycznym, a oprogramowanie Nanoscope steruje AFM.

2. Hodowla komórkowa

Żywe komórki wyrażające konstrukty GFP skierowane przeciwko określonym białkom powinny być umieszczone w naczyniu do hodowli komórek ze szklanym dnem na 24 godziny przed eksperymentem stymulacji mechanicznej. W dniu eksperymentu należy zastąpić pożywkę do hodowli komórkowej pożywką wolną od czerwieni fenolowej. Naczynie do hodowli komórkowych jest zamontowane na stoliku AFM za pomocą kołnierza magnetycznego.

3. Przygotowanie końcówki AFM i ustawienie mikroskopu

Końcówka AFM dostosowana za pomocą biotynilowanego szklanego koralika o grubości 2 mikronów zostanie przemyta pięć razy DPBS, a następnie inkubowana przez 5 minut z awidyną (1 mg/ml), ponownie przemyta DPBS pięć razy, a następnie inkubowana 5 minut z biotynilowaną fibronektyną 1 mg/mL. Końcówka zostanie umyta jeszcze pięć razy na końcu 2, zamontowana na skanerze AFM, a następnie silikonowa osłona ochronna zostanie umieszczona wokół uchwytu. Ustaw mikroskop do oglądania wideo, aby wyrównać końcówkę AFM w środku pola view. Ustaw dźwignię optyczną, umieszczając wiązkę laserową na samym końcu wspornika, a następnie zmień obiektyw na obiektyw o dużym powiększeniu, właściwy do obrazowania pojedynczych komórek. Stała sprężystości końcówki musi zostać określona przed rozpoczęciem eksperymentu. Parametr ten będzie mierzony za pomocą metody strojenia termicznego dostępnej w oprogramowaniu Nanoscope. Przełącz się z kamery wideo na kamerę EMCCD, aby umożliwić obrazowanie kwiatowe. Następnie wybierz komórkę i doprowadź końcówkę AFM do kontaktu z tą konkretną komórką. Po 20 minutowym czasie oczekiwania, który jest niezbędny do wytworzenia się silnej zrostu ogniskowego w miejscu styku AFM z powierzchnią komórki, rozpocznie się procedura stymulacji mechanicznej.

4. Mechaniczna stymulacja żywej komórki

Obrazowanie TIRF 3-4 będzie metodą z wyboru do wizualizacji i ilościowego oznaczania zrostów ogniskowych, a obrazowanie konfokalne z wirującym dyskiem 5 będzie używane do wizualizacji cytoszkieletu aktynowego w całym ciele komórki. AFM 6 będzie używany w obrazowaniu w trybie kontaktowym pod płynem.

Obraz TIRF lub konfokalny komórki zostanie uzyskany przed rozpoczęciem procedury stymulacji mechanicznej. Stymulacja mechaniczna będzie indukowana przez funkcjonalizowaną sondę AFM, która będzie przesuwana w górę w dyskretnych krokach co 3-5 minut przez pewien czas (1-1,5 godziny). Odpowiedź reaktywna komórki będzie rejestrowana w sposób ciągły w oprogramowaniu Nanoscope jako seria obrazów wysokości, przy czym każda linia na obrazie reprezentuje jednostkę czasu 1 sek. Podczas zbierania danych AFM operator przez cały czas monitoruje pozycję Z końcówki AFM, aby określić właściwy czas na następne pociągnięcie.

Po każdej mechanicznej stymulacji możliwe jest uzyskanie obrazu TIRF lub konfokalnego komórki w oprogramowaniu Slidebook, przy jednoczesnym ciągłym pozyskiwaniu danych AFM. Obrazy optyczne mogą być przetwarzane w trybie off-line w celu tworzenia filmów pokazujących reorganizację cytoszkieletu aktynowego i zrostów ogniskowych. Ponadto każdy obraz może być przetwarzany ilościowo w celu określenia obszaru komórki, określonego obszaru białka i analizy ogólnej morfologii komórki.

Na końcu eksperymentu końcówka AFM jest wyjmowana z komórki, a czułość końcówki AFM jest mierzona w oprogramowaniu Nanoscope.

Eksperyment jest bardzo wrażliwy na hałas! Podczas eksperymentu należy unikać mówienia lub dotykania mikroskopem. Aby zminimalizować szumy w pomiarach AFM, konfokalny dysk wirujący powinien być oddzielony od mikroskopu. Czas oczekiwania na wytworzenie silnej przyczepności ogniskowej między powierzchnią ogniwa a końcówką AFM może się różnić w zależności od zastosowanego typu ogniwa i matrycy pokrytej końcówką.

5. Reprezentatywne wyniki

figure-protocol-1
Rysunek 1. Ta sama komórka mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) transfekowana aktyną-mRFP i winkuliną-GFP została zobrazowana przez: (A) AFM na powierzchni komórki wierzchołkowej; (B) TIRF na powierzchni komórki podstawnej; oraz (C) mikroskopia konfokalna z wirującym dyskiem w całym ciele komórki. Obraz konfokalny jest pokazany jako maksymalna projekcja stosu 3D. Dobre nakładanie się obrazów konfokalnych AFM i TIRF lub wirującego dysku pokazano odpowiednio w (D) i (E). Rozmiar obrazu to 64 x 50 mikronów.

figure-protocol-2
Rysunek 2. VSMC transfekowany aktyną-mRFP był mechanicznie stymulowany przez AFM i obrazowany za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem. Strzałki wskazują włókna aktynowe, które: (a) polimeryzują/zagęszczają się, (b) depolimeryzują/znikają lub (c) łączą się ze sobą w wyniku restrukturyzacji aktyny. Białe przerywane linie reprezentują końcówkę AFM nad komórką. Rozmiar obrazu: 91 x 91 mikronów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytoszkielet 7-10 i zrosty ogniskowe 11-16 to dynamiczne struktury, które gromadzą się, rozpraszają i przewracają, gdy komórki migrują lub reagują na siłę mechaniczną 17. Pełnią one znaczące funkcje w regulacji wzrostu komórek, przeżycia i ekspresji genów. Znajomość ich specyficznego rozmieszczenia i dynamiki pozwala lepiej zrozumieć, w jaki sposób komórki komunikują się z macierzą i między sobą.

Ten nowy system mikroskopowy ma szerokie zastosowanie w szerokim...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plazmid Winkuliny-GFP był prezentem od Kennetha Yamady, National Institutes of Health, National Institute of Dental and Craniofacial Research, Bethesda, Maryland, a plazmid actin-mRFP był prezentem od Michaela Davidsona, Florida State University, Tallahassee, Floryda.

Ta praca została wsparta przez nagrodę NSF Career Award #0747334 oraz AHA-National SDG #0835205N dla Andreei Trache.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Końcówka AFMNovascan Technologies, Inc.Koralik borokrzemianowy 2 mikrony, 0,01 N / m, Biotyna Powierzchnia
awidynaSigma-AldrichA92751 mg / ml w DPBS
FibronektynaSigma-AldrichF47591 mg / ml
DPBSInvitrogen21600-051
Zestaw do transfekcji Amaxa dla komórek mięśni gładkichLonza Inc.VPI-1004
Naczynia ze szklanym dnem MattekMatTek Corp.P60G-1.5-30-FSterylne naczynia Falcon 60mm ze szklanym dnem szkiełko nakrywkowe nr 1.5

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Trache, A., Lim, S. M. Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells. J Biomed Opt. 14, 034024-03 (2009).
  2. Trache, A., Meininger, G. A. Atomic Force Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. Volume 2C 2.1-2.17 (2008).
  3. Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J Biomed Opt. 6, 6-13 (2001).
  4. Trache, A., Meininger, G. A. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Current Protocols in Microbiology. Coico, R., Kowalik, T., Quarles, J. M., Stevenson, B., Taylor, R. K. , Wiley & Sons Inc. 2B 2.1-2.22 (2008).
  5. Inoue, S., Inoue, T. Direct-view high-speed confocal scanner: the CSU-10. Methods Cell Biol. 70, 87-127 (2002).
  6. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. H. Atomic force microscope. Phys Rev Lett. 56, 930-933 (1986).
  7. Stamenović, D. Cytoskeletal mechanics in airway smooth muscle cells. Respir Physiol Neurobiol. 163, 25-32 (2008).
  8. Gunst, S. J., Tang, D. D., Opazo Saez, A. Cytoskeletal remodeling of the airway smooth muscle cell: a mechanism for adaptation to mechanical forces in the lung. Respir Physiol Neurobiol. 137, 151-168 (2003).
  9. Worth, N. F., Rolfe, B. E., Song, J., Campbell, G. R. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganization of contractile and cytoskeletal proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 49, 130-145 (2001).
  10. Romer, H. R., Birukov, K. G., Garcia, J. G. N. Focal Adhesions: paradigm for a signaling nexus. Circulation Research. 98, 606-616 (2006).
  11. Opazo Saez, A., Zhang, W., Wu, Y., Turner, C. E., Tang, D. D., Gunst, S. J. Tension development during contractile stimulation of smooth muscle requires recruitment of paxillin and vinculin to the membrane. Am J Physiol Cell Physiol. 286, C433-C447 (2004).
  12. Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix and integrins. Sciences STKE. 119, pe6-pe6 (2002).
  13. Zamir, E., Geiger, B. Molecular complexity and dynamics of cell-matrix adhesions. J Cell Sci. 114, 3583-3590 (2001).
  14. Geiger, B., Bershdsky, A. Assembly and mechanosensory function of focal contacts. Curr Opin Cell Biol. 13, 584-592 (2001).
  15. Sastry, S. K., Burridge, K. Focal Adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics. Exp Cell Res. 261, 25-36 (2000).
  16. Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Dev Cell. 10, 11-20 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fluorescencja z ca kowitym wewn trznym odbiciemkonfokalna mikroskopia z szybkoobrotowym dyskiemobrazowanie ywych kom rekcytoszkielet aktynowyadhezje ogniskoweg adkie mi nie naczyniowebia ka fuzyjne GFPbiotynilowana fibronektyna

Powiązane artykuły