W niniejszym artykule przedstawiamy metodę wykonywania szklanych igieł kapilarnych o świetle 50-μm. Technika ta znacząco ogranicza uszkodzenia mózgu, minimalizuje pasywną dyfuzję leków i pozwala na precyzyjne celowanie w mózg gryzonia.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Celowanie w głębokie struktury mózgu za pomocą mikroiniekcji w celu dostarczania leków, wektorów wirusowych lub przeszczepów komórkowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroiniekcje do miąższu mózgu są istotnymi procedurami służącymi do podawania leków, wektorów wirusowych lub przeszczepów komórkowych. Uszkodzenie mózgu powstające w wyniku przemieszczania się igły jest poważnym problemem, szczególnie w przypadku mózgu myszy, ze względu nie tylko na jego niewielki rozmiar, ale również na fakt, że czasami konieczne jest wykonanie wielu iniekcji. Przedstawiamy tutaj metodę wytwarzania igieł z kapilar szklanych o świetle 50 $\mu$m, co znacząco ogranicza uszkodzenia mózgu i pozwala na precyzyjne celowanie w obszary mózgu gryzonia. Metoda ta umożliwia podawanie małych objętości (od 20 do 100 nl), zmniejsza ryzyko krwawienia oraz minimalizuje pasywną dyfuzję leków do miąższu mózgu. Dzięki zastosowaniu szklanych rurek kapilarnych o różnych rozmiarach lub zmianie średnicy światła igły można wstrzykiwać różne rodzaje substancji i komórek. Mikroiniekcje z użyciem szklanej kapilary stanowią znaczną poprawę w technikach iniekcji i precyzyjnym celowaniu w głębokie struktury mózgu przy minimalnych uszkodzeniach pobocznych u małych gryzoni.
Protokół
- Przygotowanie szklanych igieł przed operacją myszy:
- Umieść szklaną rurkę kapilarną w wyciągaczu mikropipet.
- Ogrzej środkową część rurki szklanej, aby zmiękczyć szkło w obszarze lokalnym.
- Rozciągnij rurkę szklaną wzdłuż jej osi podłużnej o odległość początkową wystarczającą do spowodowania zmniejszenia średnicy rurki w obszarze lokalnym.
- Kontynuuj rozciąganie rurki szklanej aż do jej pęknięcia. W ten sposób otrzymuje się dwie identyczne igły jednokanałowe.
- Umieść szklaną igłę w mikrokuźni. Kąt 30° jest wystarczający do sfazowania końcówki.
- Sprawdź pod mikroskopem, czy każda igła ma prawidłową średnicę wewnętrzną. Dla większości leków hydrofilowych idealna średnica wewnętrzna to 30-50 μm (rycina 1).
- Napełnij igłę olejem mineralnym od jej szerszego końca. Pozwól, aby olej mineralny (MSDS, Cat. M7700) wnikał kapilarnie, aż osiągnie ok. 50% długości rurki kapilarnej. Nałóż smar wysokopróżniowy (Dow Corning, Cat. 05054-AB) wokół tłoka, aby uszczelnić szerszy koniec igły.
- Wsuń tłok od szerszego końca igły i delikatnie wypchnij olej mineralny, aż z końcówki szklanej igły pojawi się mała kropla oleju.
- Zamocuj szklaną igłę w uchwycie mikroinjektora.
- Uśpij mysz 2,5% roztworem Avertinu (2,2,2-tribromoetanol + tert-amylol, 1:1 w/v). Dawka 25-30 μL na gram podawanat dopasowawsko.
- Umieść matę grzewczą na urządzeniu stereotaktycznym, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37°C.
- Umieść i zabezpiecz głowę myszy w urządzeniu stereotaktycznym za pomocą prętów usznych i uchwytu do zębów.
- Oczyść głowę myszy 0,1% roztworem gluconianu chlorheksydyny, następnie 70% etanolem i ponownie 0,1% roztworem gluconianu chlorheksydyny.
- Wykonaj nacięcie skóry skalpelem nr 15 od uszu myszy do linii Lambda czaszki.
- Przetrzyj czaszkę patyczkiem bawełnianym, aby ją osuszyć, i odsunie skórę z pola operacyjnego.
- Użyj końcówki szklanej igły, aby wskazać wierzchołek szwu Bregma. W tym miejscu należy ustawić pozycję początkową injektora (współrzędną „zero”).
- Wyznacz punkt do wywiercenia, przesuwając osie „X” i „Y” urządzenia stereotaktycznego nad czaszką.
- Bardzo ostrożnie wywierć otwory we wskazanej współrzędnej. Mikrowiertła i inne narzędzia metalowe zostały wcześniej wysterylizowane w temperaturze 250°C przez 60 sekund w suchym sterylizatorze do szklanych kulek (Cole Palmer, Cat. No. EW-10779-00).
- Za pomocą precyzyjnej pęsety ostrożnie usuń najgłębszą warstwę kości i przerwij błonę omiaki twardej (pojawi się wyciek płynu mózgowo-rdzeniowego).
- Potwierdź, że igła może przejść przez wywiercone otwory.
- Nabierz pipetą 1 μl leku przeznaczonego do wstrzyknięcia i umieść go na małym kawałku parafilmu.
- Połóż parafilm na czaszce.
- Zaciągnij lek, obracając pokrętłem mikroinjektora, kontrolując pod mikroskopem, czy ciecz wznosi się do szklanej igły.
- Usuń parafilm i ponownie ustaw współrzędną zero.
- Przesuń igłę do wybranych współrzędnych, opuszczając uchwyt, aż końcówka szklanej igły delikatnie dotknie powierzchni mózgu, i ustaw współrzędną „Z” na zero.
- Wprowadź szklaną igłę do miąższu mózgu na wybraną głębokość.
- Wstrzykuj lek powoli z prędkością ok. 1 nl/s.
- Po wstrzyknięciu pożądanej objętości pozostaw lek na 2 min, aby dyfundował do miąższu. Następnie płynnie i powoli wyjmij igłę.
- Zklej ranę operacyjną, wyjmij zwierzę z urządzenia stereotaktycznego i umieść je w podgrzanej klatce z czystą ściółką do wybudzenia z narkozy.
- W celu zapewnienia przeciwbólowego leczenia pooperacyjnego wszystkie zwierzęta otrzymały 5 mg/kg ketorolaku podskórnie co 12 godzin przez 24 h.
Reprezentatywne wyniki:
Stosując ten protokół, uzyskuje się bardzo precyzyjny wtrysk, a bardzo wąski tor igły minimalizuje uszkodzenia mózgu. Jako reprezentatywny wynik tej metody, wstrzyknęliśmy lizofosfatydylocholinę (lizolecytynę) do ciała modzelowatego, co wywołuje demielinizację pasm istoty białej 1-4. Aby zminimalizować uszkodzenie mózgu spowodowane igłą szklaną, wstrzyknęliśmy do ciała modzelowatego jedynie 20 nl lizolecytyny, jednak w razie potrzeby tą samą metodą można wstrzyknąć większe objętości, aż do 200 nl. Demielinizację wykrywa się poprzez brak ekspresji podstawowego białka mieliny w pasmach istoty białej (Rycina 2).
Rysunek 1. Szklana igła o średnicy 50-μm. Odległość między dwiema krótkimi kreskami na skali reprezentuje długość 50-μm.
Rysunek 2. Iniekcja lysolecytyny w ciele modzelowatym. Demielinizacja jest widoczna jako brak ekspresji podstawowego białka mieliny (obszar w kropkach). Zwrócić uwagę na niewielki rozmiar toru igły szklanej (strzałki). Pasek skali = 100 μm
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metoda przedstawiona w tym filmie jest bardzo użyteczna w dostarczaniu większości leków lub wektorów wirusowych do bardzo precyzyjnych miejsc w mózgu. Do głównych zalet tej techniki należą: niezawodność wyznaczania punktu docelowego, dokładność iniekcji oraz niewielka wielkość zmiany w mózgu i uszkodzeń dróg nerwowych1, 2, 5, 6. Po standaryzacji techniki zakres błędu celowania powinien wynosić 50 μm lub mniej1, 2. Transplantacje komórek można również przeprowadzać przy użyciu szerszych igieł o średn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
O.G-P otrzymał wsparcie z grantu CONACyT (CB-2008-101476) oraz FRABA (686/10). A.Q-H otrzymał wsparcie z National Institute of Health, Howard Hughes Medical Institute, Robert Wood Johnson Foundation oraz Maryland Stem Cell Foundation.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kapilarna rurka szklana | Wiretrol I | 5-000-1001 | |
| Wytwornica pipet mikrokapilarnych | Kopf Instruments | Model 730 | |
| Mikrokuźnia | World Precision Instruments, Inc. | Model 48000 | |
| Olej mineralny | MSDS | M7700 | |
| Smar wysokopróżniowy | Dow Corning | 05054-AB | |
| Anestezja: 2,5% Avertinu | 2,2,2-tribrom–etanol + alkohol tert-amylowy, 1:1 w/v | ||
| Mata grzewcza | Mastex | Model 900 | |
| Urządzenie stereotaktyczne | Kopf Instruments | Model Kopf-900 | |
| Ostrze skalpela chirurgicznego nr 15 | Medi-Cut | ||
| Mikrowiertarka | Ideal Micro Drill | 67-1000 | |
| Precyzyjna pęseta | Fine Science Tools | ||
| Mikropipeta 1-μL | Rainin | ||
| Parafilm M. | |||
| Mikroskop chirurgiczny | Carl Zeiss, Inc. | Vasiorkop z systemem Contraves | |
| Mikrowstrzykiwacz | Narishige International | Model MO-10 |
Bibliografia
- Menn, B. Origin of oligodendrocytes in the subventricular zone of the adult brain. J Neurosci. 26, 7907-7918 (2006).
- Gonzalez-Perez, O., Romero-Rodriguez, R., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Epidermal Growth Factor Induces the Progeny of Subventricular Zone Type B Cells to Migrate and Differentiate into Oligodendrocytes. Stem Cells. 27, 2032-2043 (2009).
- Hall, S. M. Some aspects of remyelination after demyelination produced by the intraneural injection of lysophosphatidyl choline. J Cell Sci. 13, 461-477 (1973).
- Webster, G. R., Thompson, R. H. Observations on the presence of lysolecithin in nervous tissues. Biochim Biophys Acta. 63, 38-45 (1962).
- Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Subventricular Zone Astrocytes Are Neural Stem Cells in the Adult mammalian Brain. Cell. 97, 1-20 (1999).
- Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells. Neuron. 36, 1021-1034 (2002).
- Baraban, S. C. Reduction of seizures by transplantation of cortical GABAergic interneuron precursors into Kv1.1 mutant mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 15472-15477 (2009).
- Richardson, R. M., Barbaro, N. M., Alvarez-Buylla, A., Baraban, S. C. Developing cell transplantation for temporal lobe epilepsy. Neurosurg Focus. 24, E17-E17 (2008).
- Alvarez-Dolado, M. Cortical inhibition modified by embryonic neural precursors grafted into the postnatal brain. J Neurosci. 26, 7380-7389 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
