$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Zrób szklane igły przed operacją myszy:
- Umieść szklaną rurkę kapilarną w ściągaczu do mikropipet.
- Podgrzej środek szklanej rurki, aby zmiękczyć szklaną rurkę w zlokalizowanym obszarze.
- Rozciągnąć szklaną rurkę wzdłuż jej osi podłużnej o początkową odległość wystarczającą do zmniejszenia średnicy szklanej rurki w zlokalizowanym obszarze.
- Rozciągaj szklaną rurkę, aż pęknie. W ten sposób uzyskuje się dwie identyczne igły z pojedynczą lufą.
- Umieść szklaną igłę w mikrokuźni. Kąt 30° wystarczy, aby ukosować końcówkę.
- Sprawdź pod mikroskopem, czy każda igła ma odpowiednią średnicę wewnętrzną. Dla większości leków hydrofilowych idealna jest średnica wewnętrzna 30-50 μm (ryc. 1).
- Napełnij igłę olejem mineralnym z najszerszego końca szklanej igły. Niech ten olej mineralny (MSDS, Kat. M7700) wchodzi przez kapilarność, aż osiągnie ~50% długości rurki kapilarnej. Nałożyć smar wysokopróżniowy (Dow Corning, Cat. 05054-AB) wokół tłoka, aby uszczelnić najszerszy koniec igły.
- Włożyć tłok za najszerszy koniec igły i delikatnie wciskać olej mineralny, aż niewielka kropla oleju zacznie wypływać z końcówki szklanej igły.
- Zamocuj szklaną igłę w uchwycie mikrowtryskiwacza.
- Znieczulić mysz 2,5% Avertin (2,2,2-tribromoetanol + alkohol tert-amylowy, 1:1 w/v). Dawka 25-30 μl na gram dootrzewnowa.
- Umieść podkładkę grzewczą na urządzeniu stereotaktycznym, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37°C.
- Umieść i zabezpiecz główkę myszy w urządzeniu stereotaktycznym za pomocą listew nausznych i uchwytu na zęby.
- Wyczyść głowę myszy 0,1% roztworem glukonianu chlorheksydyny, a następnie 70% etanolem i 0,1% glukonianem chlorheksydyny po raz drugi.
- Naciąć skórę ostrzem chirurgicznym # 15 od uszu myszy do linii czaszki Lamba.
- Wypoleruj czaszkę bawełnianą podmianą, aby ją wysuszyć i wyciągnąć skórę z pola operacyjnego.
- Użyj końcówki szklanej igły, aby wskazać wierzchołek szwu Bregma. Tam musisz ustawić początkowe położenie wtryskiwacza (współrzędna "zero").
- Ustaw punkt, który ma być wiercony, przesuwając osie "X" i "Y" urządzenia stereotaktycznego nad czaszką.
- Wywierć bardzo ostrożnie otwory na wybranej współrzędnej. Mikrowiertła i inne metalowe narzędzia były wcześniej sterylizowane w temperaturze 250°C przez 60 sekund za pomocą suchego sterylizatora z kulkami szklanymi (Cole Palmer, Kat. Nie. EW-10779-00).
- Za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie usuń najgłębszą warstwę kości i rozbij błonę opony twardej (zobaczysz, jak wycieka płyn mózgowo-rdzeniowy).
- Upewnij się, że igła może przejść przez wywiercone otwory.
- Odpipetuj 1 μl leku, który chcesz wstrzyknąć i umieść go na małym kawałku parafilmu.
- Umieść parafilm na czaszce.
- Zassać lek, obracając kołem mikrowstrzykiwacza, sprawdzając pod mikroskopem, czy płyn dostaje się do szklanej igły.
- Usuń parafilm i ponownie zresetuj współrzędną zerową.
- Przesuń igłę do wybranych współrzędnych, w dół uchwytu, aż końcówka szklanej igły delikatnie dotknie powierzchni mózgu i ustaw współrzędną "Z" na zero.
- Wprowadzić szklaną igłę do miąższu mózgu na wybranej głębokości.
- Lek należy wstrzykiwać powoli, z szybkością ~1 nl/sek.
- Po wstrzyknięciu objętości pragnienia pozwól lekowi dyfundować do miąższu przez 2 minuty. Następnie przystąp do usuwania igły płynnie i powoli.
- Przyklej ranę pooperacyjną i wyjmij zwierzę z urządzenia stereotaktycznego, a następnie umieść zwierzę w wstępnie ogrzanej klatce zawierającej czyste łóżko w celu odzyskania znieczulenia.
- W celu zapewnienia analgezji pooperacyjnej wszystkie zwierzęta otrzymywały podskórnie Ketorolac w dawce 5 mg/kg co 12 godzin przez 24 godziny.
Reprezentatywne wyniki:
Podczas stosowania tego protokołu, uzyskuje się bardzo precyzyjny zastrzyk, a bardzo wąska ścieżka igły minimalizuje uszkodzenie mózgu. Jako reprezentatywny wynik tej metody wstrzyknęliśmy lizofosfatydylocholinę (lizolecytynę) do ciała modzelowatego, które powoduje demielinizację dróg istoty białej 1-4. Aby zminimalizować uszkodzenie mózgu wywołane przez szklaną igłę, wstrzyknęliśmy tylko 20 nl lizolecytyny do ciała modzelowatego, ale w razie potrzeby można wstrzyknąć większe objętości nawet 200 nl tą samą metodą. Demielinizacja jest wykrywana przez brak ekspresji zasadowego białka mieliny w drogach istoty białej (ryc. 2).
Rysunek 1. Szklana igła o średnicy 50 μm. Odległość między dwoma krótkimi znacznikami w skali odpowiada długości 50 μm.
Rysunek 2. Iniekcja lizolecytyny do ciała modzelowatego. Demielinizacja jest pokazana jako ekspresja białka zasadowego bez mieliny (obszar kropkowany). Zwróć uwagę na mały rozmiar szklanego przewodu igły (strzałki). Bar = 100 μm