Niniejszy protokół wykorzystuje test pull-down do oznaczenia poziomów aktywnej GTPazy RhoC w komórkach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
GTPaza RhoC wykazuje 91% homologii do GTPazy RhoA. Ze względu na powszechność tej ostatniej w komórkach, opracowano wiele odczynników i technik dla GTPazy RhoA. Jednakże GTPaza RhoC jest wyrażana w komórkach nowotworowych przerzutowych na stosunkowo niskim poziomie. W związku z tym opracowano niewiele odczynników specyficznych dla RhoC. Zaadaptowaliśmy test aktywacji Rho w celu wykrywania GTPazy RhoC. Technika ta wykorzystuje białko fuzyjne domeny wiążącej GST-Rho do wyodrębnienia aktywnej GTPazy RhoC. Dodatkowo, na początku testu możemy pobrać całkowite białko, aby określić poziomy całkowitej GTPazy RhoC (związanej z GTP i GDP). Pozwala to na określenie stosunku aktywnej do całkowitej GTPazy RhoC w komórce. Opracowano kilka komercyjnych wersji tej procedury, jednak zestawy komercyjne są zoptymalizowane pod kątem GTPazy RhoA i zazwyczaj nie sprawdzają się w przypadku GTPazy RhoC. Zmodyfikowano niektóre elementy testu, a także opracowano przeciwciało specyficzne dla RhoC.
Protokół
1. Przygotowanie białka fuzyjnego GST
- Przygotowano zapasy glicerynowe kompetentnych bakterii JM109 zawierających pierwsze 90 aminokwasów N-końca domeny wiążącej Rho (RBD) rhotekiny, subklonowanych do wektora pGEX3x w miejscach BamH1/EcoR1.
Aby zapewnić wysoką wydajność, w każdym eksperymencie NALEŻY wykonać następujące kroki. W naszym doświadczeniu świeżo przygotowany GST-RBD jest kluczowy dla uzyskania powtarzalnego i dokładnego testu aktywacji GTPazy. - Do 50 mL pożywki LB z ampicyliną (LB amp) dodać 50 μL (w przybliżeniu, nie rozmrażać) zapasu glicerynowego i inkubować przez noc w temperaturze 37°C z wytrząsaniem.
- ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Najbardziej krytycznym etapem procedury jest otrzymywanie świeżego GST-RBD. Brak szczególnej uwagi poświęconej temu krokowi jest główną przyczyną niepowodzenia eksperymentu. Wszystkie etapy, od otrzymania GST-RBD (1.2) do inkubacji z lizatem komórkowym przez noc (2.5), powinny zostać wykonane w ciągu jednego dnia. Innym kluczowym krokiem jest upewnienie się, że dostępna jest wystarczająca liczba komórek do przygotowania lizatów. Jest to szczególnie istotne w przypadku analizy RhoC GTPase, która wykazuje tendencję do wyst.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
Ministerstwo Obrony USA (Dept. of Defense) W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 oraz W81XWH-08-1-0356
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kuleczki glutation-sepharose 4B | GE Healthcare | 17-0756-01 | |
| Żele Criterion 4-20% Tris-HCl | Bio-Rad | 345-0032 |
Bibliografia
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype. Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
