Test aktywacji GTPazy RhoC

Podsumowanie

Ten protokół wykorzystuje test pulldown do określenia poziomów aktywnej GTPazy RhoC w komórkach.

Streszczenie

GTPaza RhoC ma 91% homologii do GTPazy RhoA. Ze względu na jej rozpowszechnienie w komórkach opracowano wiele odczynników i technik dla GTPazy RhoA. Jednak GTPaza RhoC ulega ekspresji w przerzutowych komórkach nowotworowych na stosunkowo niskich poziomach. W związku z tym opracowano niewiele odczynników specyficznych dla RhoC. Dostosowaliśmy test aktywacji Rho do wykrywania GTPazy RhoC. Technika ta wykorzystuje białko fuzyjne domeny wiążącej GST-Rho w celu wyciągnięcia aktywnej GTPazy RhoC. Ponadto możemy zebrać całkowite białko na początku testu, aby określić poziomy całkowitej (związanej z GTP i GDP) GTPazy RhoC. Pozwala to na określenie aktywnej i całkowitej GTPazy RhoC w komórce. Opracowano kilka komercyjnych wersji tej procedury, jednak zestawy komercyjne są zoptymalizowane pod kątem GTPazy RhoA i zazwyczaj nie działają dobrze w przypadku GTPazy RhoC. Zmodyfikowano części testu, a także opracowano przeciwciało specyficzne dla RhoC.

Protokół

1. Przygotuj białko fuzyjne GST

1. Wytwarza się zapasy glicerolu kompetentnych bakterii JM109 zawierających pierwsze N-końcowe 90 aminokwasów domeny wiążącej rhotekin Rho (RBD) subklonowanych do wektora BamH1/EcoR1 pGEX3x.
   
   Aby zapewnić wysoką wydajność, dla każdego eksperymentu NALEŻY wykonać następujące kroki. Z naszego doświadczenia wynika, że świeżo przygotowany GST-RBD jest kluczem do solidnego i dokładnego testu aktywacji GTPazy.
2. Dodaj 50 μl (w przybliżeniu, nie rozmrażaj) bulionu glicerolu do 50 ml LB amp i hoduj 37°C przez noc, wstrząsając.
3. Rozcieńczyć w stosunku 1:10 w 500 ml LB-amp i rosnąć przez 1 godzinę.
4. Indukuj produkcję białka GST za pomocą 0,1 mM IPTG przez 2 godziny.
5. Rozprowadzić równomiernie do butelek wirówkowych i odwirować, wirnik Sorval GSA3 przy 5000 obr./min 4°C przez 20 min.
6. Zawiesić osad w butelkach wirówkowych, 10 ml buforu do lizy*.
   * Bufor do lizy bakteryjnej: 20% sacharozy, 10% glicerolu, 50 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM Na₂S₂O₅, 2 mM MgCl₂, 2 mM DTT, Dodaj świeży PMSF, benzamid, aprotyninę i leupeptynę.
7. Sonikacja 2-3 min (zależy to od typu sonikatora. Używamy Fischer Sonic Dismembranator Model 500 ustawionego na znak 6, 50% cyklu).
8. Wirówka, Sorvall SS34, 20 min 10 000 obr./min w 4°C. W tym momencie mała porcja może zostać wyjęta i uruchomiona przez SDS-PAGE. Żel może być poplamiony coomassie, a opaska powinna być widoczna przy 46 kDa.
9. Usunąć sklarowany osad i dodać 1 ml 50% gnojowicy glutatione-Sepharose 4B.
10. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4°C z rotacją. Przemyć 3 razy buforem do lizy.
11. Zawiesić kulki GST-RBD/glutatione-Sepharose do 50% zawiesiny (około 1 ml) z buforem rybnym GST**. ** Bufor rybny GST: 10% glicerol, 50 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 1% NP-4, 2 mM MgCl₂, Dodaj świeży PMSF, benzamid, aprotyninę i leupeptynę

2. Test ściągania GST-fusion

1. Użyj 5-10 x 10⁶ komórek/test
2. Umyj komórki raz w lodowatym PBS, trzymaj talerze na lodzie (używamy płaskiego szklanego naczynia wypełnionego lodem) i poddaj lizie 0,5 ml buforu rybnego GST.
3. Inkubować 5 minut na lodzie, zbierać komórki za pomocą gumowego policjanta lub płaskiego skrobaka, przenosić do probówki do mikrofuge i odwirowywać 20 000 obr./min 5 min w temperaturze 4°C.
4. Przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrofuge. Weź 50 μl, aby oznaczyć całkowite Rho (tj. PKB + granica GTP).
5. Dodać 0,5 ml kulek gst-rbd/glutatione-Sepharose i inkubować w temperaturze 4°C, przez noc z rotacją.
6. Umyj 6x buforem do ryb GST.
7. Ponownie zawiesić kulki w 40 μl 2x-Laemelli bufor do próbek
   W tym miejscu należy oznaczyć stężenie całkowitej podwielokrotności białka Rho pobranej w ppkt 2.4 i przygotować 30 μg do przeprowadzenia na żelu z odpowiednią próbką aktywacyjną.
8. Próbki gotować w temperaturze 90°C przez 5 minut, krótko odwirować i załadować supernatantem (tj. unikać kulek) i uruchomić na 12-dołkowym żelu SDS-PAGE o gradiencie 4-20%.
9. Uruchom żel pod napięciem nie wyższym niż 150 V, przenieś do membrany za pomocą bufora Towbin i stałego prądu 100 W.
10. Zablokuj membranę 5% roztworem mleka/TBST i sondą z przeciwciałem specyficznym dla RhoC.

3. Reprezentatywne wyniki

Dobre wyniki powinny dać pojedyncze pasmo o natężeniu około 22 kDa. Złe wyniki powodują powstanie wielu pasm lub wysokiego tła. Wskazuje to na degradację białek, niepełne mycie próbek lub użycie starego GST-RBD.

Rysunek 1. Wykazano, że trzy oddzielne linie komórkowe wyrażające różne poziomy GTPazy RhoC wykazują niskie poziomy aktywnego i całkowitego RhoC, wysokie poziomy aktywnego i całkowitego RhoC lub brak RhoC. Blot został następnie usunięty i ponownie poddany próbie przeciwciałem przeciwko aktynie genu utrzymującego w domu, która miała służyć jako kontrola obciążenia dla całkowitego białka RhoC.

Rysunek 2. Wiele prążków lub wysokie tło wynika z degradacji białek, niepełnego mycia próbek lub użycia starego GST-RBD.

Dyskusja

Najważniejszym etapem procedury jest wytworzenie świeżego GST-RBD. Brak zwrócenia szczególnej uwagi na ten krok jest główną przyczyną niepowodzenia. Wszystkie etapy, od wytworzenia GST-RBD (1.2) do nocnej inkubacji z lizatem komórkowym (2.5), powinny być wykonane w ciągu jednego dnia. Kolejnym ważnym krokiem jest upewnienie się, że jest wystarczająco dużo komórek do produkcji lizatów komórkowych. Ma to szczególne znaczenie, gdy patrzy się na GTPazę RhoC, która ma tendencję do występowania w niskich poziomach w komórc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Koraliki glutionowo-sefarozowe 4B	GE Healthcare	17-0756-01
Kryterium 4-20% żele Tris-HCl	Bio-Rad	345-0032