Test aktywacji GTPazy RhoC

Podsumowanie

Niniejszy protokół wykorzystuje test pull-down do oznaczenia poziomów aktywnej GTPazy RhoC w komórkach.

Streszczenie

GTPaza RhoC wykazuje 91% homologii do GTPazy RhoA. Ze względu na powszechność tej ostatniej w komórkach, opracowano wiele odczynników i technik dla GTPazy RhoA. Jednakże GTPaza RhoC jest wyrażana w komórkach nowotworowych przerzutowych na stosunkowo niskim poziomie. W związku z tym opracowano niewiele odczynników specyficznych dla RhoC. Zaadaptowaliśmy test aktywacji Rho w celu wykrywania GTPazy RhoC. Technika ta wykorzystuje białko fuzyjne domeny wiążącej GST-Rho do wyodrębnienia aktywnej GTPazy RhoC. Dodatkowo, na początku testu możemy pobrać całkowite białko, aby określić poziomy całkowitej GTPazy RhoC (związanej z GTP i GDP). Pozwala to na określenie stosunku aktywnej do całkowitej GTPazy RhoC w komórce. Opracowano kilka komercyjnych wersji tej procedury, jednak zestawy komercyjne są zoptymalizowane pod kątem GTPazy RhoA i zazwyczaj nie sprawdzają się w przypadku GTPazy RhoC. Zmodyfikowano niektóre elementy testu, a także opracowano przeciwciało specyficzne dla RhoC.

Protokół

1. Przygotowanie białka fuzyjnego GST

1. Przygotowano zapasy glicerynowe kompetentnych bakterii JM109 zawierających pierwsze 90 aminokwasów N-końca domeny wiążącej Rho (RBD) rhotekiny, subklonowanych do wektora pGEX3x w miejscach BamH1/EcoR1.
   
   Aby zapewnić wysoką wydajność, w każdym eksperymencie NALEŻY wykonać następujące kroki. W naszym doświadczeniu świeżo przygotowany GST-RBD jest kluczowy dla uzyskania powtarzalnego i dokładnego testu aktywacji GTPazy.
2. Do 50 mL pożywki LB z ampicyliną (LB amp) dodać 50 μL (w przybliżeniu, nie rozmrażać) zapasu glicerynowego i inkubować przez noc w temperaturze 37°C z wytrząsaniem.
3. Rozcieńczyć 1:10 w 500 mL pożywki LB-amp i hodować przez 1 h.
4. Indukować produkcję białka GST za pomocą 0,1 mM IPTG przez 2 h.
5. Równomiernie rozdzielić do probówek do wirowania i odwirować w rotorze Sorval GSA3 przy 5000 RPM w temperaturze 4°C przez 20 min.
6. Resuspender osad w probówkach do wirowania w 10 mL buforu do lizy*.
   *Bufor do lizy bakterii: 20% sacharozy, 10% glicerolu, 50 mM Tris pH 8.0, 0,2 mM Na₂S₂O₅, 2 mM MgCl₂, 2 mM DTT; dodać świeży PMSF, benzamid, aprotininę i leupeptynę.
7. Sonicować przez 2-3 min (zależnie od typu sonikatora; używamy urządzenia Fischer Sonic Dismembranator Model 500 ustawionego na wartość 6, cykl 50%).
8. Wirować w wirówce Sorvall SS34 przez 20 min przy 10 000 rpm w temperaturze 4°C. Na tym etapie można pobrać niewielką alikwot i poddać analizie SDS-PAGE. Żel można zbarwić Coomassie; prążek powinien być widoczny przy 46 kDa.
9. Usunąć supernatant i dodać 1 mL 50% zawiesiny glutation-Sepharose 4B.
10. Inkubować przez 30 min w temperaturze 4°C przy rotacji. Przemyć 3 razy buforem do lizy.
11. Resuspender kulek GST-RBD/glutation-Sepharose do uzyskania 50% zawiesiny (około 1 mL) przy użyciu buforu GST-fish**. **Bufor GST-Fish: 10% glicerolu, 50 mM Tris pH 7.4, 100 mM NaCl, 1% NP-4, 2 mM MgCl₂; dodać świeży PMSF, benzamid, aprotininę i leupeptynę.

2. Test wytrącania z użyciem białek fuzyjnych GST

1. Użyj 5-10 x 10⁶ komórek na analizę
2. Przemyj komórki raz w lodowatym PBS, przechowuj płytki w lodzie (stosujemy płaskie szalki szklane wypełnione lodem) i poddaj lizie za pomocą 0,5 mL buforu GST-fish.
3. Inkubuj przez 5 min w lodzie, zbierz komórki za pomocą gumowej skóry (rubber policeman) lub płaskiego skrobaka, przenieś do probówki do mikrowirówki i wiruj przy 20 000 obr./min przez 5 min w temperaturze 4°C.
4. Przenieś supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. Odlej 50 μL w celu oznaczenia całkowitej ilości Rho (tj. związanej z GDP + GTP).
5. Dodaj 0,5 mL kulek GST-RBD/glutation-Sepharose i inkubuj w temperaturze 4°C przez noc z rotacją.
6. Przemyj 6x buforem GST-fish.
7. Resuspenduj kulki w 40 μL 2x-buforu do próbek Laemmliego
   Na tym etapie należy oznaczyć stężenie całkowitego białka Rho w alikwocie pobranym w punkcie 2.4 i przygotować 30 μg do naniesienia na żel wraz z odpowiadającą próbką aktywacji.
8. Gotuj próbki w temperaturze 90°C przez 5 min, wiruj krótko i pobierz supernatant (aby uniknąć kulek), a następnie nanieś i rozdziel na żelu SDS-PAGE 4-20% gradientowym w 12 studzienkach.
9. Prowadź elektroforezę przy napięciu nie wyższym niż 150 V, przenieś białka na membranę przy użyciu buforu Towbina i stałego prądu 100 W.
10. Zablokuj membranę 5% roztworem mleka w TBST i inkubuj z przeciwciałem specyficznym dla RhoC.

3. Reprezentatywne wyniki

W przypadku prawidłowych wyników powinien pojawić się pojedynczy prążek o masie około 22 kDa. Nieprawidłowe wyniki objawiają się obecnością wielu prążków lub wysokim tłem. Świadczy to o degradacji białka, niepełnym przemyciu próbek lub zastosowaniu starego GST-RBD.

Rycina 1. Przedstawiono trzy oddzielne linie komórkowe wykazujące różne poziomy GTPazy RhoC, aby zademonstrować niskie poziomy aktywnego i całkowitego RhoC, wysokie poziomy aktywnego i całkowitego RhoC lub brak RhoC. Następnie błonę poddano procesowi strippingu i ponownie inkubowano z przeciwciałem przeciwko aktynie (genowi referencyjnemu), aby służyła jako kontrola ładowania dla całkowitego białka RhoC.

Rysunek 2. Wielokrotne prążki lub wysokie tło wynikają z degradacji białek, niepełnego przemycia próbek lub zastosowania starego GST-RBD.

Dyskusja

Najbardziej krytycznym etapem procedury jest otrzymywanie świeżego GST-RBD. Brak szczególnej uwagi poświęconej temu krokowi jest główną przyczyną niepowodzenia eksperymentu. Wszystkie etapy, od otrzymania GST-RBD (1.2) do inkubacji z lizatem komórkowym przez noc (2.5), powinny zostać wykonane w ciągu jednego dnia. Innym kluczowym krokiem jest upewnienie się, że dostępna jest wystarczająca liczba komórek do przygotowania lizatów. Jest to szczególnie istotne w przypadku analizy RhoC GTPase, która wykazuje tendencję do wyst...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kuleczki glutation-sepharose 4B	GE Healthcare	17-0756-01
Żele Criterion 4-20% Tris-HCl	Bio-Rad	345-0032