Wpływ sztywności podłoża na funkcje komórkowe można modelować in vitro, wykorzystując hydrożele poliakryloamidowe o różnym stopniu podatności.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie wpływu sztywności macierzy na funkcje komórkowe z wykorzystaniem hydrożeli na bazie akrylamidu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Sztywność tkanki jest istotnym czynnikiem determinującym funkcje komórkowe, a zmiany sztywności tkanek są powszechnie powiązane z włóknieniem, nowotworami oraz chorobami układu sercowo-naczyniowego1-11. Tradycyjne podejścia biologii komórki do badania funkcji komórkowych polegają na hodowli komórek na sztywnym podłożu (szalkach plastikowych lub szkiełkach nakrywkowych), co nie pozwala uwzględnić wpływu elastycznej macierzy pozakomórkowej (ECM) ani różnic w sztywności ECM między poszczególnymi tkankami. Aby modelować in vitro warunki podatności tkanek in vivo, my oraz inne zespoły stosujemy hydrożele powlekane ECM. W naszym laboratorium hydrożele opierają się na poliakryloamidzie, który może naśladować zakresy podatności tkanek występujące w naturze12. „Reaktywne” szkiełka nakrywkowe otrzymuje się poprzez inkubację z NaOH, a następnie dodanie 3-APTMS. Do sieciowania 3-APTMS i żelu poliakryloamidowego wykorzystuje się glutaraldehyd. Do polimeryzacji hydrożelu używa się roztworu akryloamidu (AC), bis-akryloamidu (Bis-AC) i persiarczanu amonu. Do roztworu AC wprowadza się N-hydroksysukcynimid (NHS), aby połączyć białka ECM z hydrożelem. Po polimeryzacji hydrożelu powierzchnia żelu jest powlekana wybranym białkiem ECM, takim jak fibronektyna, witronektyna, kolagen itd.
Sztywność hydrożelu można określić za pomocą reologii lub skaningowej mikroskopii sił atomowych (AFM) i regulować poprzez zmianę procentowej zawartości AC i/lub bis-AC w roztworze12. W ten sposób można dopasować sztywność podłoża do sztywności tkanek biologicznych, którą również można ilościowo określić za pomocą reologii lub AFM. Następnie na tych hydrożelach można wysiać komórki i hodować je zgodnie z wymaganymi warunkami eksperymentalnymi. Obrazowanie komórek oraz ich odzyskiwanie do analizy molekularnej jest proste. W niniejszym artykule definiujemy podłoża miękkie jako takie, których moduły sprężystości (E) wynoszą <3000 Pascal, a podłoża/tkanki sztywne jako takie, których E wynosi >20,000 Pascal.
Protokół
Przygotowanie
- Kryszalki należy wysterylizować w autoklawie.
- Do przygotowywania roztworów oraz płukania kryszalków należy używać sterylnej wody destylowanej lub dejonizowanej.
- Roztwory AC (40% w/v) i bis-AC (1% w/v) sterylizuje się poprzez filtrację przez filtr 0,2 μm. Krótko przed użyciem należy przygotować 10% roztwór persiarczanu amonu (APS; 10μg/ml wody) i przefiltrować go sterylnie. Roztwór APS należy wymieniać co miesiąc.
- Odczynniki chemiczne, których nie można autoklawować, takie jak 3-APTMS, chloroform, glutaraldehyd, NHS i SurfaSil, przechowuje się w wyznaczonej butelce służącej wyłącznie do przygotowywania hydrożeli. ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Kluczowym elementem procesu polimeryzacji hydrożelu jest unikanie powstawania pęcherzyków powietrza, które mogłyby spowodować wiązanie się komórek z szklanym szkiełkiem nakrywką zamiast z samym hydrożelem pokrytym ECM. Można temu zapobiec, ostrożnie pipetując roztwór do polimeryzacji po wymieszaniu w wortexie i wizualnie upewniając się, że w żelu nie uwięzły pęcherzyki powietrza. Zawsze zalecamy przygotowanie dodatkowych „reaktywnych” szkiełek nakrywkowych i hydrożeli, aby mieć pewność, że ich liczba będzie wystarczająca.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca w naszym laboratorium jest finansowana z grantów National Institutes of Health.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Glutarialdehyd, 70% | Sigma-Aldrich | G7776 | Przechowywać w -20°C |
| 3-APTMS (3-aminopropyltrimetoksysilan 97%) | Sigma-Aldrich | 281778 | Przechowywać w temperaturze pokojowej |
| SurfaSil Siliconizing Fluid | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 42800 | Przechowywać w temperaturze pokojowej |
| NHS (ester N-hydroksysuccynimidowy) | Sigma-Aldrich | A-8060 | Przechowywać w 4°C. Wymieniać co miesiąc |
| Albuminy, z surowicy bydlęcej, w zasadzie wolne od kwasów tłuszczowych | Sigma-Aldrich | A6003-100G | Przechowywać w 4°C |
| Kryszalki (25mm) | Fisher Scientific | 12-545-86 25 Cir 1D | |
| Kryszalki (18mm) | Fisher Scientific | 12-545-84 18 Cir 1D |
Bibliografia
- Beattie, D., Xu, C., Vito, R., Glagov, S., Whang, M. C. Mechanical analysis of heterogeneous, atherosclerotic human aorta. J Biomech Eng. 120, 602-607 (1998).
- Bernini, G. Arterial stiffness, intima-media thickness and carotid artery fibros....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
