Badanie wpływu sztywności matrycy na funkcję komórkową przy użyciu hydrożeli na bazie akrylamidu

Summary

Wpływ sztywności podłoża na funkcję komórkową można modelować in vitro przy użyciu hydrożeli poliakrylamidowych o różnym stopniu podatności.

Abstract

Sztywność tkanek jest ważnym wyznacznikiem funkcji komórek, a zmiany w sztywności tkanek są często związane ze zwłóknieniem, rakiem i chorobami układu krążenia^1-11. Tradycyjne biologiczne podejścia do badania funkcji komórkowych obejmują hodowlę komórek na sztywnym podłożu (plastikowe naczynia lub szklane szkiełka nakrywkowe), które nie mogą wyjaśnić wpływu elastycznego ECM lub różnic w sztywności ECM między tkankami. Aby modelować in vivo warunki zgodności tkanek in vitro, my i inni używamy hydrożeli powlekanych ECM. W naszym laboratorium hydrożele są oparte na poliakrylamidzie, który może naśladować zakres zgodności tkankowej obserwowany biologicznie¹². "Reaktywne" szkiełka nakrywkowe są wytwarzane przez inkubację z NaOH, a następnie dodanie 3-APTMS. Aldehyd glutarowy służy do sieciowania 3-APTMS i żelu poliakrylamidowego. Do polimeryzacji hydrożelu stosuje się roztwór akrylamidu (AC), bis-akrylamidu (Bis-AC) i nadsiarczanu amonu. N-hydroksysukcynimid (NHS) jest włączony do roztworu AC w celu usieciowania białka ECM z hydrożelem. Po polimeryzacji hydrożelu powierzchnia żelu jest pokryta wybranym białkiem ECM, takim jak fibronektyna, witronektyna, kolagen itp.

Sztywność hydrożelu można określić za pomocą reologii lub mikroskopii sił atomowych (AFM) i dostosować poprzez zmianę procentu AC i/lub bis-AC w roztworze¹². W ten sposób sztywność podłoża można dopasować do sztywności tkanek biologicznych, którą można również określić ilościowo za pomocą reologii lub AFM. Komórki można następnie wysiewać na tych hydrożelach i hodować w oparciu o wymagane warunki eksperymentalne. Obrazowanie komórek i ich odzyskiwanie do analizy molekularnej jest proste. Na potrzeby tego artykułu definiujemy podłoża miękkie jako te, które mają moduły sprężystości (E) <3000 Pascal, a sztywne podłoża/tkanki jako te o E >20 000 Pascal.

Protocol

Przygotowanie

• Szkiełka nakrywkowe należy sterylizować w autoklawie.
• Do przygotowania roztworów i do mycia szkiełek nakrywkowych należy używać sterylnej wody destylowanej lub dejonizowanej.
• Roztwory AC (40% w/v) i bis-AC (1% w/v) są sterylizowane przez filtrację 0,2 μm. Przygotować 10% nadsiarczan amonu (APS; 100 μg/ml wody) na krótko przed użyciem i przefiltrować sterylnie. Roztwór APS należy wymieniać co miesiąc.
• Odczynniki chemiczne, takie jak 3-APTMS, chloroform, glutaradehyd, NHS i SurfaSil, których nie można sterylizować w autoklawie, są przechowywane w przypisanej butelce używanej wyłącznie do przygotowania hydrożeli.

Discussion

Kluczowym elementem procesu polimeryzacji hydrożelu jest uniknięcie tworzenia się pęcherzyków powietrza, które pozwolą komórkom związać się ze szklanym szkiełkiem nakrywkowym, a nie z samym hydrożelem pokrytym ECM. Można temu zapobiec, ostrożnie pipetując roztwór polimeryzacyjny po wirowaniu i upewniając się, że żadne pęcherzyki powietrza nie zostały uwięzione w żelu. Zawsze zalecamy przygotowanie dodatkowych "reaktywnych" szkiełek nakrywkowych i hydrożeli, aby upewnić się, że jest ich wystarczająco dużo do eksperymentów.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aldehyd glutarowy, 70%	Sigma-Aldrich	G7776	Przechowywać w temperaturze -20° C
3-APTMS (3-Aminopropylottrimetozysilan 97%)	Sigma-Aldrich	281778	Przechowywać w temperaturze pokojowej
SurfaSil Płyn silikonowy	Thermo Fisher Scientific, Inc.	42800	Przechowywać w temperaturze pokojowej
NHS (ester N-hydroksysucynimidu)	Sigma-Aldrich	A-8060	Przechowywać w temperaturze 4° C Wymień miesięczną
albuminę, surowicę bydlęcą, zasadniczo wolną od kwasów tłuszczowych	Sigma-Aldrich	A6003-100G	Przechowuj pod adresem 4°
Szkiełka nakrywkowe C (25mm)	Fisher Scientific	12-545-86 25 Cir 1D
Szkiełka nakrywkowe (18mm)	Fisher Scientific	12-545-84 18 Cir 1D