Badanie wpływu sztywności macierzy na funkcje komórkowe z wykorzystaniem hydrożeli na bazie akrylamidu

Podsumowanie

Wpływ sztywności podłoża na funkcje komórkowe można modelować in vitro, wykorzystując hydrożele poliakryloamidowe o różnym stopniu podatności.

Streszczenie

Sztywność tkanki jest istotnym czynnikiem determinującym funkcje komórkowe, a zmiany sztywności tkanek są powszechnie powiązane z włóknieniem, nowotworami oraz chorobami układu sercowo-naczyniowego^1-11. Tradycyjne podejścia biologii komórki do badania funkcji komórkowych polegają na hodowli komórek na sztywnym podłożu (szalkach plastikowych lub szkiełkach nakrywkowych), co nie pozwala uwzględnić wpływu elastycznej macierzy pozakomórkowej (ECM) ani różnic w sztywności ECM między poszczególnymi tkankami. Aby modelować in vitro warunki podatności tkanek in vivo, my oraz inne zespoły stosujemy hydrożele powlekane ECM. W naszym laboratorium hydrożele opierają się na poliakryloamidzie, który może naśladować zakresy podatności tkanek występujące w naturze¹². „Reaktywne” szkiełka nakrywkowe otrzymuje się poprzez inkubację z NaOH, a następnie dodanie 3-APTMS. Do sieciowania 3-APTMS i żelu poliakryloamidowego wykorzystuje się glutaraldehyd. Do polimeryzacji hydrożelu używa się roztworu akryloamidu (AC), bis-akryloamidu (Bis-AC) i persiarczanu amonu. Do roztworu AC wprowadza się N-hydroksysukcynimid (NHS), aby połączyć białka ECM z hydrożelem. Po polimeryzacji hydrożelu powierzchnia żelu jest powlekana wybranym białkiem ECM, takim jak fibronektyna, witronektyna, kolagen itd.

Sztywność hydrożelu można określić za pomocą reologii lub skaningowej mikroskopii sił atomowych (AFM) i regulować poprzez zmianę procentowej zawartości AC i/lub bis-AC w roztworze¹². W ten sposób można dopasować sztywność podłoża do sztywności tkanek biologicznych, którą również można ilościowo określić za pomocą reologii lub AFM. Następnie na tych hydrożelach można wysiać komórki i hodować je zgodnie z wymaganymi warunkami eksperymentalnymi. Obrazowanie komórek oraz ich odzyskiwanie do analizy molekularnej jest proste. W niniejszym artykule definiujemy podłoża miękkie jako takie, których moduły sprężystości (E) wynoszą <3000 Pascal, a podłoża/tkanki sztywne jako takie, których E wynosi >20,000 Pascal.

Protokół

Przygotowanie

• Kryszalki należy wysterylizować w autoklawie.
• Do przygotowywania roztworów oraz płukania kryszalków należy używać sterylnej wody destylowanej lub dejonizowanej.
• Roztwory AC (40% w/v) i bis-AC (1% w/v) sterylizuje się poprzez filtrację przez filtr 0,2 μm. Krótko przed użyciem należy przygotować 10% roztwór persiarczanu amonu (APS; 10μg/ml wody) i przefiltrować go sterylnie. Roztwór APS należy wymieniać co miesiąc.
• Odczynniki chemiczne, których nie można autoklawować, takie jak 3-APTMS, chloroform, glutaraldehyd, NHS i SurfaSil, przechowuje się w wyznaczonej butelce służącej wyłącznie do przygotowywania hydrożeli.
• Aby uzyskać najlepsze wyniki, hydrożele należy wykorzystać w ciągu kilku dni po nocnej inkubacji z odpowiednim białkiem ECM.
• Przed wylaniem hydrożelu należy przygotować 10% roztwór SurfaSil w chloroformie (zazwyczaj 10 ml wystarcza na 20 górnych kryszalków) w 50 ml polipropylenowej probówce Falcon. (W naszym laboratorium górne kryszalki są zazwyczaj silikonizowane podczas etapu inkubacji w 0,5% glutaraldehydzie). Należy dodać kryszalki do probówki Falcon i kołysać przez co najmniej 10 min. Po odlaniu roztworu SurfaSil kryszalki należy wysuszyć na chusteczkach Kimwipes w komorze z laminarnym przepływem powietrza, w której będą przygotowywane hydrożele.
• Roztwór BSA inaktywowany termicznie przygotowuje się w następujący sposób: roztwór BSA wolnej od kwasów tłuszczowych w stężeniu 20 mg/ml w PBS inkubuje się w kąpieli wodnej w temperaturze 68°C przez 30 min. Następnie roztwór filtruje się sterylnie i przechowuje w temperaturze 4°C.

Procedura

1. Na dolnej połowie płytki Petri o średnicy 150 mm umieść warstwę Parafilmu.
2. Na Parafilmie ułóż do 9 szkiełek podstawkowych o wymiarach 25 mm i pokryj je 1 ml 0,1 M NaOH. Inkubuj przez 3 min, a następnie odessij ciecz za pomocą linii próżniowej.
3. Pracując w dygestorium chemicznym, nanieś 0,5 ml 3-APTMS na każde szkiełko. Inkubuj przez 3 min, a następnie odessij APTMS. Zbyt długie oczekiwanie spowoduje powstanie piany.
4. Płukz szkiełka raz 20 ml wody dejonizowanej w tej samej płytce. Wyjmij szkiełka z płytki za pomocą pęsety zakrzywionej i przenieś je stroną potraktowaną do góry do nowej płytki 150-mm. Myj szkiełka wodą dejonizowaną trzykrotnie na wstrząsarce, po 10 min każdego mycia. Jeśli nie usunie się całego APTMS, zareaguje on z glutaraldehydem w kolejnym kroku, tworząc biały, mętny osad (Rysunek 1).
5. Rozmroź glutaraldehyd (~10 min przed użyciem).
6. Za pomocą pęsety zakrzywionej przenieś szkiełka do czystej płytki wyłożonej Parafilmem i odessij pozostałą ciecz. W razie potrzeby użyj linii próżniowej lub chusteczki Kimwipe, aby osuszyć pozostałą wodę.
7. Pokryj całkowicie każde szkiełko 0,5 ml 0,5% glutaraldehydu w sterylnej wodzie dejonizowanej i inkubuj przez 30 min w dygestorium chemicznym. Odessij glutaraldehyd. Płucz i myj szkiełka zgodnie z instrukcją z kroku 4. Całkowicie wysusz szkiełka. [Na tym etapie można przerwać procedurę i przechowywać szkiełka przez kilka tygodni w suchym miejscu].
8. Gdy będziesz gotowy do przygotowania hydrożeli, przenieś za pomocą pęsety zakrzywionej szkiełka stroną reaktywną do góry na arkusz Parafilmu przyklejony do powierzchni komory bezpieczeństwa biologicznego. Upewnij się, że szkiełka leżą płasko na powierzchni Parafilmu.
9. Przygotuj nasycony roztwór NHS w toluenie. (Rozpuść niewielką ilość NHS w ilości toluenu odpowiedniej dla konkretnego eksperymentu. Dodawaj NHS stopniowo, aż przestanie się rozpuszczać. Roztwór nasycony jest zazwyczaj mętny i różowy).
10. Następnie przygotuj akrylamid, bis-akrylamid, wodę i APS, aby uzyskać pożądane stężenie akrylamidu. Dodaj odczynniki w probówkach do mikrocentryfugi, zgodnie z poniższymi wytycznymi, do całkowitej objętości 0,8 ml.
11. Następnie, dodając po jednej porcji, dodaj NHS i TEMED do 0,8 ml roztworu AC, krótko wymieszaj wstrząsarce Vortex i NATYCHMIAST wylej 3-5 żeli, używając 140 μl na każde szkiełko w komorze bezpieczeństwa biologicznego. W miarę możliwości wszystkie kolejne kroki powinny być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego. [Uwaga: w zależności od potrzeb można zastosować szkiełka o innym rozmiarze. W przypadku szkiełek 18-mm użyj ~33 μl roztworu AC na szkiełko i silikonizowanego szkiełka górnego 18-mm.]
    

    	Bis-AC (%)
    	0,3 (sztywny)	0,15	0,06	0,03 (miękki)
    	μl	μl	μl	μl
    Woda	402	52	594	618
    AC	150	150	150	150
    Bis-AC	240	120	48	24
    APS	8	8	8	8
    TEMED	1	1	1	1
    NHS	28	228	28	28

12. Szybko połóż silikonizowane szkiełko 25-mm na każdym żelu, zanim rozpocznie się polimeryzacja. Nałożenie górnego szkiełka powinno pozwolić na całkowite pokrycie dolnego szkiełka przez AC. Inkubuj taką „kanapkę” w temperaturze pokojowej do czasu spolimeryzowania AC. (Sprawdź pozostały roztwór AC w probówce do mikrocentryfugi, aby określić, kiedy nastąpiła polimeryzacja. Zazwyczaj wystarczy kilka minut dla żeli sztywnych i nieco dłużej dla miękkich).
13. Ostrożnie podnieś „kanapkę” (używając sterylnych rękawiczek!) i zsuń górne szkiełko, aż będzie wystawać poza spolimeryzowany żel. Następnie można je podważyć i zdjąć z żelu. Jeśli będziesz zbyt długo zwlekać z usunięciem górnego szkiełka, żel może zostać rozerwany podczas jego zdejmowania.
14. Wyrzuć górne szkiełko. Umieść dolne szkiełka z żelem (dalej nazywane hydrożelem) w płytkach 6-dołkowych z 2 ml PBS na dołek. PBS można dodać do każdego dołka przed lub po umieszczeniu szkiełka z żelem. Myj hydrożele w PBS trzykrotnie na wstrząsarce, po 5 min każdego mycia.
15. Powtarzaj kroki 1-14, aż zostanie przygotowana wymagana liczba hydrożeli.
16. Pokryj każdy hydrożel 2 ml roztworu fibronektyny (3 μg/ml w PBS) lub innego białka ECM (szczegóły patrz w Klein et al.¹³). Białko ECM wiąże się kowalencyjnie z hydrożelem podczas nocnej inkubacji w temperaturze 4°C.
17. Odessij roztwór ECM i zablokuj nieprzereagowany NHS za pomocą 1 mg/ml BSA wolnego od kwasów tłuszczowych i inaktywowanego ciepłem w medium bezsurowiczym przez co najmniej 30 min w temperaturze 37°C w inkubatorze do hodowli komórkowych. Wypłucz hydrożele raz sterylnym PBS lub medium do hodowli komórkowej.
18. Wysiej komórki w odpowiednim medium hodowlanym z dodatkiem FBS. Liczba komórek wysiewanych na hydrożel powinna zostać określona przez użytkownika na podstawie stopnia rozprzestrzeniania się komórek i konfluencji wymaganej do eksperymentu. Zazwyczaj około 10⁵ komórek jest wystarczające do analizy western blotting i qPCR.
19. Po okresie inkubacji można wyekstrahować białko komórkowe lub mRNA. Szkiełka ostrożnie usuwa się z dołków za pomocą pęsety zakrzywionej i kładzie (stroną z komórkami dołu) na kropelkach 10 μl buforu lizującego, rozmieszczonych (co 2-3 cm) na arkuszu Parafilmu na blacie laboratoryjnym. (Do przygotowania próbek do western blottingu stosujemy standardowy bufor próbkowy SDS, a do izolacji RNA dla qPCR – TRIzol). Inkubuj komórki z buforem lizującym dokładnie przez jedną minutę. Zdejmij szkiełka i przenieś bufor lizujący do probówki do mikrocentryfugi. Alternatywnie, wyłącznie dla ekstrakcji RNA, użytkownik może przenieść każdy hydrożel do nowej płytki 6-dołkowej i dodać 1 ml TRIzolu na dołek. Inkubuj przez 3 minuty, a następnie pobierz roztwór TRIzolu do przechowywania w probówce do mikrocentryfugi.

Dodatkowe informacje na temat procedur takich jak immunofluorescencja, barwienie BrdU, transfekcja itp. dla komórek wysianych na hydrożelach opisano w pracy Klein et al. 207¹³.

Reprezentatywne wyniki

Dokładne przemycie szkiełek nakrywkowych po dodaniu APTMS jest kluczowym etapem przygotowania „reaktywnych” szkiełek. Jeśli APTMS nie zostanie całkowicie usunięty, wejdzie on w reakcję z glutaraldehydem w kolejnym kroku, co doprowadzi do powstania białego, mętnego osadu, jak pokazano na rysunku 1A. Rysunek 1B przedstawia prawidłowo przemyte i wysuszone szkiełko nakrywkowe. W przypadku powstania osadu całą procedurę należy rozpocząć od początku, ponieważ szkiełko nakrywkowe nie nadaje się już do użytku.

Po uformowaniu hydrożelu i inkubacji z białkami ECM przez noc, następnego dnia można przystąpić do wysiewania komórek. Jak pokazano na Rysunku 2, występuje wyraźna różnica w rozprzestrzenianiu się komórek na sztywnych i miękkich hydrożelach. Jak wynika z barwienia falloidyną embrionalnych fibroblastów mysich (MEF), komórki rozprzestrzeniają się w większym stopniu na hydrożelach sztywnych w porównaniu do miękkich. W rzeczywistości większość komórek przywierających do miękkiego hydrożelu pozostanie zwartymi skupiskami i będzie przytwierdzalać mniej efektywnie.

Chociaż na Rysunku 2 przedstawiono morfologię jedynie komórek MEF, różnica w rozprzestrzenianiu się komórek jest spójna dla kilku innych badanych linii komórkowych^11-12,14.

Klucze do sukcesu

1. Po rozpoczęciu procedury bardzo ważne jest utrzymywanie szkiełek podstawkowych stroną „reaktywną” do góry oraz pamiętanie, która strona została pokryta.
2. Podczas całej procedury należy nosić rękawiczki, aby zapewnić jak najbardziej sterylne środowisko pracy.
3. Większość początkowych etapów wykonuje się pomiędzy wyciągiem chemicznym a blatem laboratoryjnym. Wszystkie kroki następujące po usunięciu nadmiaru glutaraldehydu ze szkiełek podstawkowych powinny być przeprowadzane w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
4. Ze względu na różnice w rozprzestrzenianiu się komórek (Rysunek 2), zalecamy wysiewanie dwukrotnie większej liczby komórek na hydrożele miękkie w porównaniu do hydrożeli sztywnych.
5. Proces polimeryzacji AC jest niezwykle szybki. Osoby wykonujące tę procedurę po raz pierwszy mogą zmniejszyć ilość APS lub TEMED w roztworze, aby wydłużyć proces polimeryzacji. Nie należy próbować przygotowywać więcej niż kilku szkiełek podstawkowych jednocześnie.
6. W badaniach cyklu komórkowego, w których wymagana jest synchronizacja w fazie G0, zazwyczaj stosujemy głodzenie surowicze komórek w plastikowych naczyniach hodowlanych, po czym komórki trypsynizujemy i wysiewamy ponownie na hydrożele o różnej sztywności w obecności mitogenów (FBS i/lub czynników wzrostu). Procedura ta zapewnia, że początkowa populacja komórek zsynchronizowanych w fazie G0 jest identyczna we wszystkich próbkach. Jednak w przypadku wielu badań nad transdukcją sygnału wymagany czas stymulacji mitogenem może być zbyt krótki, aby umożliwić adhezję i rozprzestrzenianie się komórek. W takim przypadku komórki głodzimy surowiczo bezpośrednio na hydrożelach, a następnie stymulujemy je mitogenem.

Rysunek 1A. Nieprawidłowo umyta szkiełko nakrywkowe. Po dodaniu APTMS szkiełko przykrywkę przemyto przez 1–2 minuty przed dodaniem roztworu glutaraldehydu. Na szkiełku przykrywce, którego nie przemyto zgodnie z krokami opisanymi w procedurze, powstaje osad.

Rysunek 1B. Prawidłowo umyte szkiełko nakrywkowe. Po dodaniu APTMS szkiełko nakrywki przemyto trzykrotnie, po 10 minut each, przed dodaniem roztworu glutaraldehydu. Na szkiełku nakrywki nie powstaje osad.

Rysunek 2. Morfologia komórek na hydrożelach o różnej sztywności. Ustanowione linie MEF wysiano na hydrożelach powlekanych fibronektyną o wysokiej lub niskiej sztywności na 9 godzin. Po okresie inkubacji komórki utrwalono, poddano permeabilizacji i zabarwiono FITC-falloidyną, która wiąże się z f-aktyną. Komórki MEF na żelach o wysokiej sztywności wykazują obecność włókien stresowych i są dobrze rozpostarte w porównaniu z komórkami wysianymi na hydrożelach o niskiej sztywności. Pasek skali = 50μm.

Rycina 3. Reprezentatywny wynik ilościowej PCR dla poziomów mRNA cykliny D1 u myszy. Mysie fibroblasty zarodkowe poddane głodzeniu surowiczemu wysiano na hydrożele o wysokiej (3% akrylamidu) lub niskiej (0,3% akrylamidu) sztywności, a następnie stymulowano 10% FBS przez 9 godzin. Po ekstrakcji RNA przeprowadzono analizę ilościową metodą real-time PCR w celu oznaczenia poziomu mRNA cykliny D1 (znormalizowanego do RNA 18S). G0 oznacza poziom mRNA cykliny D1 w komórkach spoczywających. Poziomy mRNA cykliny D1 wzrastają znacząco na sztywnych hydrożelach, ale nie na hydrożelach miękkich. Dane przedstawiono jako średnia +/- SD dla powtórzonych reakcji PCR.

Dyskusja

Kluczowym elementem procesu polimeryzacji hydrożelu jest unikanie powstawania pęcherzyków powietrza, które mogłyby spowodować wiązanie się komórek z szklanym szkiełkiem nakrywką zamiast z samym hydrożelem pokrytym ECM. Można temu zapobiec, ostrożnie pipetując roztwór do polimeryzacji po wymieszaniu w wortexie i wizualnie upewniając się, że w żelu nie uwięzły pęcherzyki powietrza. Zawsze zalecamy przygotowanie dodatkowych „reaktywnych” szkiełek nakrywkowych i hydrożeli, aby mieć pewność, że ich liczba będzie wystarczająca...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Glutarialdehyd, 70%	Sigma-Aldrich	G7776	Przechowywać w -20°C
3-APTMS (3-aminopropyltrimetoksysilan 97%)	Sigma-Aldrich	281778	Przechowywać w temperaturze pokojowej
SurfaSil Siliconizing Fluid	Thermo Fisher Scientific, Inc.	42800	Przechowywać w temperaturze pokojowej
NHS (ester N-hydroksysuccynimidowy)	Sigma-Aldrich	A-8060	Przechowywać w 4°C. Wymieniać co miesiąc
Albuminy, z surowicy bydlęcej, w zasadzie wolne od kwasów tłuszczowych	Sigma-Aldrich	A6003-100G	Przechowywać w 4°C
Kryszalki (25mm)	Fisher Scientific	12-545-86 25 Cir 1D
Kryszalki (18mm)	Fisher Scientific	12-545-84 18 Cir 1D