Analiza służąca do pomiaru aktywności indukowalnejy lizinowej dekarboksylazy Escherichia coli

Podsumowanie

Aktywność indukowalnejydekarboksylazy lizyny monitoruje się poprzez reakcję substratu L-lizyny oraz produktu, kadaweryny, z kwasem 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowym w celu utworzenia adduktów o różnej rozpuszczalności w toluenie.

Streszczenie

Escherichia coli to bakteria jelitowa zdolna do wzrostu w szerokim zakresie wartości pH (pH 5 - 9)¹ i, co niezwykłe, potrafi przetrwać ekstremalny stres kwasowy, w tym przejście przez żołądek ssaków, gdzie pH może spaść nawet do pH 1 - 2². Aby umożliwić przeżycie w tak szerokim zakresie niskiego pH, E. coli posiada cztery różne indukowalne dekarboksylazy aminokwasów, które dekarboksylują swoje substraty aminokwasowe w sposób zależny od protonów, podnosząc tym samym wewnętrzne pH. Dekarboksylazy te obejmują dekarboksylazy kwasu glutaminowego GadA i GadB³, dekarboksylazę argininy AdiA⁴, dekarboksylazę lizyny LdcI^{5, 6} oraz dekarboksylazę ornityny SpeF⁷. Wszystkie te enzymy wykorzystują fosforan pyridoksalu-5' jako kofaktor⁸ i funkcjonują wspólnie z antyporterami substrat-produkt zlokalizowanymi w błonie wewnętrznej, które usuwają produkty dekarboksylacji do środowiska zewnętrznego w zamian za nowy substrat². W przypadku LdcI antyporter lizyna-kadaweryna nazywa się CadB. Niedawno określiliśmy strukturę krystaliczną LdcI metodą rentgenograficzną z rozdzielczością 2,0 Å i odkryliśmy nową małą cząsteczkę związaną z LdcI — regulator odpowiedzi rygorystycznej guanozyno-5'-difosforan-3'-difosforan (ppGpp)¹⁴. Odpowiedź rygorystyczna występuje, gdy komórki w fazie wzrostu wykładniczego doświadczają niedoboru składników odżywczych lub jednego z wielu innych stresów⁹. W rezultacie komórki produkują ppGpp, co prowadzi do kaskady sygnałowej kończącej się przejściem z fazy wzrostu wykładniczego do fazy stacjonarnej¹⁰. Wykazaliśmy, że ppGpp jest specyficznym inhibitorem LdcI¹⁴. Opisujemy tutaj test dekarboksylazy lizyny, zmodyfikowany na podstawie metody opracowanej przez Phana i współpracowników¹¹, który wykorzystaliśmy do oznaczenia aktywności LdcI oraz wpływu pppGpp/ppGpp na tę aktywność. Reakcja dekarboksylacji LdcI usuwa grupę α-karboksylową L-lizyny, wytwarzając dwutlenek węgla i poliaminę — kadawerynę (1,5-diaminopentan)⁵. L-lizyna i kadaweryna mogą reagować z kwasem 2,4,6-trinitrobenzensulfonowym (TNBS) przy wysokim pH, tworząc odpowiednio N,N'-bistrinitrofenylkadawerynę (TNP-kadaweryna) oraz N,N′-bistrinitrofenylolizynę (TNP-lizyna)¹¹. TNP-kadawerynę można oddzielić od TNP-lizyny, ponieważ pierwsza z nich jest rozpuszczalna w rozpuszczalnikach organicznych, takich jak toluen, podczas gdy druga nie jest (patrz Rysunek 1). Zakres liniowy testu określono empirycznie przy użyciu oczyszczonej kadaweryny.

Protokół

1) Odczynniki i sprzęt

1. W pierwszej kolejności przygotować następujące trzy roztwory: 1 mL roztworu A, składającego się z 8 mM L-lizyny, 100 mM kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) sodowego o pH 6,5, 0,2 mM nukleotydu, gdzie nukleotydem jest: guanozynodifosforan (GDP), guanozynotrifosforan (GTP), guanozyno 5'-difosforan, 3'-difosforan (ppGpp) lub guanozyno 5'-trifosforan, 3'-difosforan (pppGpp), 0,1 mM 5'-fosforanu pirydoksalu (PLP) oraz 1 mM β-merkaptoetanolu (β-ME). 1 mL roztworu B, składającego się ze 100 mM MES sodowego o pH 6,5, 0,1 mM PLP, 1 mM β-ME oraz 50 nM LdcI. LdcI oczyszczono zgodnie z opisem w pracy Snider et al.⁶ oraz Kanjee et al. ¹⁴.
   1 mL roztworu C, który jest identyczny z roztworem B, ale nie zawiera LdcI.
2. Przygotować 100 mL roztworu zatrzymującego, składającego się z 1 M węglanu sodu (10,6 g/100 mL), i odmierzyć 50 μL do każdej studzienki polistyrenowej płytki 96-dołkowej za pomocą pipety wielokanałowej. Dodać do płytki 30 μL wody, a następnie ją przykryć. Należy pamiętać, że suma objętości dodanej wody i objętości próbki pobranej podczas reakcji enzymatycznej musi wynosić 50 μL. W tym przypadku pobrane zostanie 20 μL próbki z reakcji enzymatycznej.
3. Przygotować 5 mL roztworu TNBS o stężeniu 10 mM poprzez rozcieńczenie 294 μL roztworu stokowego TNBS 5% (m/v) z 4706 μL wody; zawinąć w folię aluminiową i przechowywać w lodzie.
4. Ustalić temperaturę w urządzeniu Eppendorf ThermoStat Plus na 37°C. ThermoStat Plus posiada 24 gniazda w 6 kolumnach. Patrz Rysunek 2 w celu zapoznania się ze schematem. Oznaczyć probówki Eppendorf 1,5 mL, wskazując rodzaj testowanego nukleotydu (jedna na kolumnę): GTP (kolumna A), GDP (kolumna B), ppGpp (kolumna C), pppGpp (kolumna D), brak nukleotydu (kolumna E) oraz próbki białek (kolumna F).
5. Ułożyć kilka pudełek z końcówkami 200 μL w taki sposób, aby pominąć co drugi rząd, co da łącznie cztery rzędy końcówek. Jest to konieczne do użycia pipety wielokanałowej z blokiem grzejnym ThermoStat Plus podczas analizy enzymatycznej.
6. Ustalić temperaturę w cyfrowym bloku grzejnym (VWR) na 42°C.
7. Umieścić 96-dołkową polipropylenową płytkę o pojemności 2,0 mL w lodzie w celu schłodzenia.

2) Analiza LdcI

1. Do probówek Eppendorf 1,5 mL w każdej z pięciu kolumn termobloku Eppendorf ThermoStat odmierzyć 50 μL Roztworu A z odpowiednim nukleotydem.
2. Do trzech probówek w kolumnie F dodać 330 μL Roztworu B, a do ostatniej probówki w kolumnie F dodać 330 μL Roztworu C (kontroli bezbiałkowej).
3. Równoważyć roztwory w temperaturze 37°C przez pięć minut. Wskazówka: po 5 minutach usunąć zakrętki probówek znajdujących się w centrum bloku grzejnego, aby nie przeszkadzały one przy późniejszym użyciu pipety wielokanałowej.
4. Za pomocą wielokanałowej pipety VWR o zakresie 5-50 μL przenieść 50 μL z probówek w kolumnie F do każdej z probówek w kolumnach A-E. Uruchomić stoper natychmiast po wymieszaniu pierwszej probówki.
5. W 2, 4 i 6 minucie pobrać 20 μL próbki za pomocą pipety wielokanałowej i dodać do roztworu zatrzymującego.
6. Uwaga: próbki w roztworze zatrzymującym można przykryć folią spożywczą i zamrozić w temperaturze -20°C do późniejszej analizy. Płytki należy rozmrozić w temperaturze pokojowej przed przeprowadzeniem reakcji z TNBS.

3) Reakcja z TNBS i rozwój barwy

1. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 μL 10 mM roztworu TNBS do roztworu zatrzymującego, a następnie inkubuj w temperaturze 42°C przez 6 minut. Roztwór przybierze ciemnożółty lub pomarańczowy kolor w wyniku reakcji TNBS z lizyną i kadaweryną.
2. Po 6 minutach schłodź płytkę na lodzie, aby spowolnić reakcję.
3. Pobierz 100 μL próbki za pomocą wielokanałowej pipety VWR 20-200 μL i przenieś do schłodzonej na lodzie płytki z głębokimi dołkami o pojemności 2 mL. Przenieś pojemnik z lodem do dygestorium.
4. Do każdego dołka dodaj 500 μL toluenu, używając powtarzalnej pipety HandyStep (Brand) i końcówki do pipety 12,5 mL (Plastibrand).
5. Zetrzyj nadmiar toluenu za pomocą chusteczki Kimwipe i zakryj płytkę paskami taśmy pakowej. Należy mocno docisnąć taśmę, aby zapewnić szczelność. Przykryj płytkę 96-dołkową płaską pokrywką, a następnie energicznie wstrząsaj przez 1 minutę i 30 sekund.
6. Pozostaw roztwory do oddzielenia faz przez 5 minut. TNP-kadaweryna znajduje się teraz w górnej fazie toluenowej, natomiast TNP-lizyna pozostaje rozpuszczalna w wodzie (patrz Rysunek 1).
7. Pobierz 200 μL toluenu za pomocą wielokanałowej pipety 20-200 μL i przenieś do płytki 96-dołkowej przeznaczonej do odczytu. Uwaga: upewnij się, że pobierana próbka jest przejrzysta i nie zawiera dolnej fazy wodnej. Uwaga: używaj końcówek z filtrem (barrier tips), aby zapobiec uszkodzeniu pipety wielokanałowej przez toluen.
8. Zmierz absorbancję przy 340 nm w czytniku płytek SpectraMax 340.
9. Aby oczyścić płytkę kwarcową, wypłucz toluen wodą, a następnie umieść płytkę kwarcową w dużej szklanej kuwecie w dygestorium. Wlej 100 mL mieszaniny kwasu azotowego 70% (v/v) i etanolu 95% (v/v) w stosunku 7:3 i przykryj płytkę kwarcową drugą szklaną kuwetą. Ostrzeżenie: reakcja jest silnie egzotermiczna i czasami może doprowadzić do wybuchu; należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i upewnić się, że przesłona dygestorium jest ustawiona na poziomie 6" od dołu. Po ochłodzeniu wypłucz kwas azotowy wodą, a następnie etanolem 95%.

4) Reprezentatywne wyniki

1) Krzywa standardowa kadaweryny (Rysunek 3)
Analizę przeprowadzono zgodnie z opisem, lecz bez dodatku L-lizyny lub LdcI; w zamian zastosowano różne stężenia kadaweryny, aby empirycznie określić zakres liniowy analizy. Analiza wykazała liniowość do wartości OD₃₄₀ wynoszącej 0,25, co odpowiada ok. 22 nmol kadaweryny (Rysunek 3).

2) Aktywność LdcI (Rysunek 4)
Ustalono, że aktywność samego LdcI wynosiła 153,5 (± 18,1) nmoles kadaveryny min-1 μg LdcI-1 przy pH 6,5. Aktywność LdcI nie zmienia się w obecności 100 μM GTP lub GDP, lecz jest silnie hamowana (>10-krotnie) w obecności pppGpp i ppGpp (Rysunek 4).

Rycina 1. Schemat reakcji LdcI. Przedstawiono reakcję dekarboksylacji L-lizyny prowadzącą do powstania CO₂ i kadaweryny, a także następującą reakcję z TNBS przy wysokim pH, w wyniku której powstaje N,N'-bis(2,4-dinitrofenylo)kadaweryna (TNP-kadaweryna) oraz N,N'-bis(2,4-dinitrofenylo)lizyna (TNP-lizyna). Na podstawie Phan et al.11

Rysunek 2. Konfiguracja termostatu Eppendorf. Przedstawiono rozmieszczenie próbek w 24-dołkowym termostacie Eppendorf ThermoStat wraz z opisem etapów analizy (oznaczonych pogrubioną czcionką). Strzałki wskazują przenoszenie roztworów reakcyjnych zgodnie z protokołem. Wskazano również przeniesienie roztworu reakcyjnego do roztworu zatrzymującego na płytce 96-dołkowej.

Rysunek 3. Krzywa wzorcowa dla kadaweryny. Przedstawiono wykres zależności absorbancji przy 340 nm od liczby nmoli kadaweryny. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe z co najmniej trzech niezależnych pomiarów. Przedstawiono również linię trendu z współczynnikiem R2 wynoszącym 0,996.

Rysunek 4. Wyniki analizy LdcI. Przedstawiono wykres szybkości aktywności LdcI (w nmoles produkowanej kadaweryny min-1 μg-1 LdcI) w obecności 100 μM GTP, GDP, pppGpp, ppGpp oraz wykluczając obecność nukleotydów. Nukleotydy odpowiedzi rygorystycznej (p)ppGpp są zdolne do znaczącego hamowania aktywności LdcI. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe z co najmniej sześciu niezależnych pomiarów.

Dyskusja

W teście aktywności lizynodekarboksylazy TNBS reaguje z aminami pierwszorzędowymi L-lizyny i kadaweryny, tworząc addukty TNP-lizyny i TNP-kadaweryny (Rysunek 1). Ze względu na obecność grupy kwasu karboksylowego w TNP-lizynie, addukt ten pozostaje rozpuszczalny w wodzie, podczas gdy TNP-kadaweryna, pozbawiona grupy kwasu karboksylowego, może przenikać do toluenu¹¹. Ten rodzaj analizy może być stosowany szerzej w przypadku innych aminokwasów, w których podczas reakcji dochodzi do utraty grupy kwasu karboksylowe...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
kwas 2,4,6-trinitrobenzenosulfonowy	Sigma-Aldrich	P2297
0.1 mM 5’-fosforan pyridoksalu (PLP)	Sigma-Aldrich	P9255
Kadaweryna	Sigma-Aldrich	D22606
polistyrenowe płytki 96-dołkowe	Sarstedt Ltd
kwarcowa płytka 96-dołkowa	Hellma
cyfrowy blok grzejny VWR Digital Heatblock	VWR international
ThermoStat Plus	Eppendorf
polipropylenowe płytki 96-dołkowe 2.0 mL	Axygen Scientific	P-DW-20-C
dozownik wielokrotny Handy Step Repeat Pipettor	Brand GmbH
końcówki do dozownika wielokrotnego 12.5 mL	Brand GmbH	702378
czytnik płytek SpectraMax 340PC	SpectraMax