Organoptypowy model hodowli plastrów hipokampa jest modelem in vitro stosowanym do badania uszkodzeń neuronalnych w różnych paradygmatach. W niniejszym artykule opisujemy metody przygotowania hodowli plastrów oraz ilościowego oznaczania uszkodzeń neuronalnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Model organotypowej hodowli skrawków hipokampa do badania uszkodzeń neuronów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Organotypowa hodowla plastrów hipokampa jest metodą in vitro służącą do badania mechanizmów uszkodzeń neuronalnych, w której podstawowa architektura i skład hipokampa są w stosunkowo dużym stopniu zachowane 1. System hodowli organotypowej umożliwia badanie efektów neuronalnych, astrocytarnych i mikroglialnych, jednak jako preparat ex vivo nie uwzględnia wpływu przepływu krwi ani rekrutacji obwodowych komórek zapalnych. Z tego względu metoda ta jest często stosowana do badania uszkodzeń ekscytotoksycznych i hipoksyjnych neuronów piramidowych hipokampa, ale była również wykorzystywana do analizy odpowiedzi zapalnej. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody tworzenia hodowli plastrów hipokampa z mózgu gryzoni postnatalnych, podawania bodźców toksycznych w celu wywołania uszkodzeń neuronalnych oraz badania i kwantyfikacji śmierci neuronów hipokampa.
Protokół
1. Przygotowanie
Przed rozpoczęciem należy przygotować niezbędne instrumenty chirurgiczne, media do sekcji i hodowli oraz 7-dniowe młode szczury lub myszy. Protokół jest taki sam dla preparatów mysich i szczurzych.
(i) Materiały i sprzęt
- Nożyczki operacyjne (proste, długość 6", kat# RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD)
- Nożyczki do mikrodysekcji (długość 4'", kat# RS5910, Roboz, Gaithersburg, MD)
- Pincety Dumont ze stali węglowej (kat# RS-5045, Roboz, Gaithersburg, MD)
- Zmodyfikowane szklane pipety „transferowe” (odcięte dno pipety Pasteura i wygładzone krawędzie)
- Plastikowa folia Aclar pocięta w kwadraty o wymiarach 2" x 2" (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA)
- Gąbki osłonowe 4 x 3 cala (Kendall, kat# 3157, Mansfield, MA)
- Wkładki membranowe Millicell 30 mm (0.4 μm; Millipore, Bedford, MA)
- Krajarka do tkanek McIlwain z dwukrawędziową żyletką (McIlwain tissue chopper, Vibratome Company, St. Louis, MO)
- Mikroskop odwrócony z kamerą CCD i oprogramowaniem do analizy obrazu
(ii) Pożywka do sekcji (DM; 1 litr o pH 7,3)
| zrównoważona sól Hanksa | 1 fiolka ( 95,2 g/1L) ( Sigma : H2387 ) |
| NHCO3 (4,2 mM) | 350 mg |
| HEPES (10 mM) | 2,83 g |
| Glukoza (3,3 mM) | 6,0 g |
| Penicylina/streptomycyna (10x) | 10 ml |
| BSA (0,3%) | 30 mg |
| MgSO₄4-7H2O | 1,4 g |
(iii) Pożywka hodowlana (40 mL)
| MEM (Invitrogen 1575-032) | 20 mL |
| ***Zrównoważony roztwór soli Hanksa (Invitrogen 24020-17) | 10 ml |
| surowica konia (Invitrogen 26050-070) | 10 mL |
| bufor HEPES (1 M; Invitrogen 15630-080) | 5 mL |
| Penicylina/Streptomycyna (10x) | 4 ml |
| Przed przygotowaniem pożywki dodać 12,8 g glukozy do 50 ml roztworu soli Hanksa (HBSS). | |
(iv) Zwierzęta
7-dniowe szcząta szczura lub myszy, zazwyczaj jeden miot na eksperyment.
2. W dniu hodowli
- Wszystkie narzędzia do sekcji oraz folia Aclar muszą być moczone w 70% ETOH przez 30 minut przed rozpoczęciem. Powierzchnia kapturka do sekcji, ostrze oraz przecinarka do tkanek muszą zostać zdezynfekowane etanolem.
- Przygotować kilka (3-4) 6-dołkowych płytek do hodowli tkankowej; dodać 1 mL pożywki hodowlanej do każdej dołki i wstawić do każdej z nich przepuszczalną membranę Millipore. Umieścić płytki 6-dołkowe w inkubatorze w temperaturze 37° do momentu przeniesienia skrawków.
- Przygotować kilka (4-6) płytek 60 mm z DM i umieścić je w lodzie.
- Szybko przeprowadzić dekapitację za pomocą nożyczek i zanurzyć w 70% ETOH, a następnie szybko odsłonić mózg, wykonując cięcie strzałkowe czaszki. Ostrożnie usunąć mózg i natychmiast umieścić w zimnym DM. Rozdzielić go na dwie półkule i położyć każdą z nich stroną przyśrodkową dołu na gąbce przykrywnej na 2-3 sekundy.
- Delikatnie podnieść i położyć półkulę na kwadracie folii Aclar, a następnie umieścić na przecinarce do tkanek; przeciąć mózg w płaszczyźnie wieńcowej na sekcje o grubości 350 μm. Po zakończeniu delikatnie pobrać kwadrat Aclar z pociętą półkulą i zanurzyć w zimnym DM.
- Za pomocą mikroskopu sekcyjnego wyodrębnić sekcje hipokampa. W przypadku szczura powinno to być 5 sekcji obejmujących hipokamp od strony rostralnej do kaudalnej, a w przypadku myszy 3-4 sekcje.
- Wyjąć z inkubatora do hodowli tkankowej w temperaturze 37° płytki 6-dołkowe z wkładami membranowymi. Przenieść poszczególne skrawki hipokampa na membrany przepuszczalne za pomocą szklanej pipety transferowej. Jeśli na membranę przedostanie się zbyt dużo DM, usunąć nadmiar DM pipetą Pasteura. Umieścić pięć skrawków hipokampa na każdej membranie. Przewidzieć co najmniej 3 dołki na każdą próbę, czyli 15 skrawków.
- Inkubować płytki hodowlane w temperaturze 37° w inkubatorze z 5% CO nawilżonym przez 12-14 dni przed rozpoczęciem eksperymentu toksyczności. Pożywkę hodowlaną można wymieniać dwa razy w tygodniu.
3. Indukowanie i ilościowe określanie uszkodzeń neuronów hipokampa w kulturze skrawków
- Po 12–14 dniach hodowli do pożywki dodać 5 μg/mL jodku propidyny (PI). Krok ten umożliwi wizualizację i ilościowe oznaczenie podstawowej śmierci komórkowej.
- Następnego dnia oznaczyć fluorescencję PI w podregionie CA1 (oraz/lub CA3 lub zakręcie zębatym, jeśli jest to pożądane) każdego skrawka hipokampa i wyznaczyć średnie wartości pomiarów fluorescencji PI reprezentujące podstawową śmierć komórkową (oznaczaną jako czas=0 godzin, lub T0). Do akwizycji i kwantyfikacji obrazów stosujemy oprogramowanie OpenLab (Improvision, U.K.), jednak do pomiaru intensywności fluorescencji można użyć innego oprogramowania do akwizycji i analizy obrazu.
- Bezpośrednio po akwizycji obrazów fluorescencji PI dla T0, wywołać uszkodzenie neuronów wybraną metodą (stosowaliśmy 10 μM NMDA, deprywację tlenowo-glukozową lub LPS przez jedną godzinę w celu wywołania toksyczności neuronalnej 2,5). Po stymulacji toksycznej wymienić pożywkę na świeżą, zawierającą 5 μg/mL PI, i inkubować skrawki przez noc.
- W 3. dniu oznaczyć średnią fluorescencję PI dla warunków eksperymentalnych po 24 h, czyli T24.
- Po akwizycji obrazów natychmiast zmienić pożywkę, dodać 10 μM NMDA oraz 5 μg/mL PI i inkubować skrawki przez noc, aby osiągnąć maksymalną śmierć neuronów.
- W 4. dniu oznaczyć średnią fluorescencję PI dla maksymalnej śmierci neuronalnej, zdefiniowanej jako Tmax. Obliczyć procent śmierci komórkowej według wzoru: (T24 - T0) / (Tmax-T0).
4. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1. (A) Oś czasu generowania plastrów hipokampa oraz późniejszego wywołania urazu eksperymentalnego i akwizycji obrazów. (B) Reprezentatywne obrazy plastrów hipokampa w stanie bazowym (T0), 24 godziny po 1-godzinnej ekspozycji na 10 μM NMDA (T24), a następnie po kolejnych 24 h lub 10 μM NMDA w celu uzyskania maksymalnego uszkodzenia neuronów (Tmaks.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Aby zapewnić powtarzalne i spójne wyniki podczas replikacji eksperymentów, należy przestrzegać dwóch istotnych kwestii. Po pierwsze, ważne jest, aby skrawki hipokampa dojrzewały przez 12-14 dni przed rozpoczęciem doświadczeń. Izolacja skrawków wywołuje znaczną odpowiedź mikrogleju, a komórki te pozostają aktywne przez pewien czas, wracając do spoczynkowego stanu rozgałęzionego około 10 dnia in vitro 3,6. Po drugie, średnia intensywność fluorescencji PI jest proporcjonalna do liczby uszkodzonych komóre...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Finansowane przez NINDS, American Heart Association, American Federation for Aging Research, March of Dimes
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Bibliografia
- Stoppin, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-173 (1991).
- McCullough, L., Wu, L., Haughey, N. Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia. J Neurosci. 24 (1), 257-257 (2004).
- Czapiga, M., Colton, C. A. Function of microglia in organotypic slice cultures. J Neurosci Res. 56, 644-644 (1999).
- Newell, D. W., Barth, A., Papermaster, V. Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures. J Neurosci. 15, 7702-7702 (1995).
- Wu, L., Wang, Q., Liang, X. Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival. Neuroscience letter. 421, 253-253 (2007).
- Hailer, N. P., Jarhult, J. D., Nitsch, R., R, Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia. 18, 319-319 (1996).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
