Region korony różnych sekwencji pętli V3 powierzchniowego glikoproteiny otoczki (gp120) HIV-1 może w wielu przypadkach zostać scharakteryzowany strukturalnie poprzez zwijanie in silico pozycji od 10 do 22 pętli przy użyciu nowoczesnego algorytmu zwijania ab initio. W niniejszej pracy prezentujemy zwijanie i ocenę tego regionu pętli V3 szczepu R2 HIV-1, który jest wyjątkowo wrażliwym na neutralizację szczepem o zagadkowych właściwościach funkcjonalnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena immunologicznie istotnych dynamicznych cech struktury trzeciorzędowej sekwencji R2 korony pętli V3 HIV-1 za pomocą zwijania ab initio
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Różnorodność antygenowa HIV-1 od dawna stanowi przeszkodę w projektowaniu szczepionek, a zmienność ta jest szczególnie wyraźna w pętli V3 glikoproteiny otoczki powierzchniowej wirusa. Wcześniej zasugerowaliśmy, że korona pętli V3, mimo swojej dynamiki i zmienności sekwencji, jest ograniczona w całej populacji wirusów HIV-1 do immunologicznie istotnej trzeciorzędowej struktury β-spinki. Co ważne, w krążących wirusach HIV-1 występują tysiące różnych sekwencji korony pętli V3, co sprawia, że trójwymiarowa charakterystyka trendów strukturalnych w obrębie tej różnorodności wirusów jest trudna lub niemożliwa do przeprowadzenia za pomocą krystalografii lub NMR. Nasze poprzednie udane badania nad zwijaniem korony V31, 2 wykorzystywały algorytm ab initio 3 dostępny w pakiecie oprogramowania do modelowania molekularnego ICM-Pro (Molsoft LLC, La Jolla, CA) i wykazały, że korona pętli V3, a konkretnie pozycje od 10 do 22, korzysta w stopniu wystarczającym z elastyczności i długości flankujących ją łodyżek, aby w znacznym stopniu zachowywać się tak, jakby była nieograniczonym peptydem swobodnie zwijającym się w roztworze. W związku z tym szybkie zwijanie ab initio tylko tej części pętli V3 każdego z ponad 60 000 krążących szczepów HIV-1 może być informacyjne. W niniejszej pracy przeprowadziliśmy zwijanie pętli V3 szczepu R2, aby uzyskać wgląd w strukturalne podstawy jego unikalnych właściwości. R2 posiada rzadką sekwencję pętli V3, która prawdopodobnie odpowiada za wyjątkową wrażliwość tego szczepu na neutralizację przez sera pacjentów oraz przeciwciała monoklonalne4, 5. Szczep ten pośredniczy w infekcji niezależnej od CD4 i wydaje się wywoływać szeroko neutralizujące przeciwciała. Demonstrujemy, w jaki sposób ocena wyników zwijania może być pomocna w powiązaniu struktur zaobserwowanych podczas zwijania z aktywnością immunologiczną obserwowaną dla szczepu R2.
Protokół
1. Metodyka
- Pierwszym krokiem protokołu jest wybór sekwencji korony V3, którą chcemy sfałdemować in silico. Dla szczepu R2 sekwencja tego fragmentu to KSIPMGPGRAFYT.
- Trójwymiarowa struktura atomowa peptydu odpowiadającego tej sekwencji powinna zostać zbudowana w wirtualnej przestrzeni komputerowej. Komenda ICM służąca do tego celu to:
buildpep "KSIPMGPGRAFYT"
lub można wybrać opcję File:New:Peptide z menu rozwijanego - Następnie ustawia się kilka parametrów procedury, w tym liczbę kroków przeszukiwania (długość wyszukiwania), temperaturę symulacji, parametry strategii wyszukiwania, w tym zmienne ograniczenia w celu skierowania wyszukiwania w stronę obszarów prawdopodobnych, człony energii, wybór różnych metod obliczania energii oraz parametry określające sposób zapisu wyszukiwania, takie jak decyzja o nagraniu filmu i liczba zapisywanych pośrednich konformacji z oceną scoringową. Wszystkie te parametry zostały zoptymalizowane w poprzednich publikacjach (patrz www.molsoft.com).
- Fałdowanie inicjuje się następnie komendą:
montecarlo
lub można wybrać opcję File:New:Peptide z menu rozwijanego Molecular Mechanics:Minimize:Global
W pierwszym przypadku parametry z kroku 3 należy wprowadzać pojedynczo w linii komend. W drugim przypadku w panelu przed wykonaniem komendy dostępne są pola wyboru dla najczęściej wybieranych parametrów. Dla wygody przedstawiono tutaj ten sam skrypt ICM do fałdowania, który został wykorzystany w tym doświadczeniu oraz w wcześniej opublikowanych badaniach:
Skrypt ten można zapisać w pliku tekstowym i szybko uruchomić z linii komend systemu operacyjnego komputera (zazwyczaj LINUX) za pomocą polecenia:
icm _foldingscript
2. Klucze do sukcesu
- Pętla V3 ma niemal w każdym znanym szczepie stałą długość 35 aminokwasów, dlatego pozycje aminokwasów numeruje się od 1 do 35, zaczynając od początkowej cysteiny tworzącej mostek dwusiarczkowy w pozycji 1, a kończąc na odpowiadającej jej cysteinie w pozycji 35. Ponieważ jest to część pętli, granice korony V3 powinny zostać starannie dobrane. Jeśli wybrany fragment będzie zbyt duży, mało prawdopodobne jest, aby zachowywał się on jak swobodnie elastyczny segment, podobnie jak w przypadku wolnego peptydy, co spowoduje, że symulacja zwijania nie oceni poprawnie struktury. Jeśli natomiast wybrany fragment będzie zbyt mały, w symulacji może nie powstać informatywna struktura trzeciorzędowa. Nasze wcześniejsze badanie wykazało, że fragment od pozycji 10 do pozycji 22 korelował z konformacjami krystalograficznymi związanymi z przeciwciałami, dlatego jest to fragment każdej pętli V3, który należy wybrać do symulacji zwijania.
- Choć korzystanie z graficznego interfejsu użytkownika i menu rozwijanych jest wygodne, wcześniejsze udane prace nad zwijaniem peptydów ogólnie z wykorzystaniem ICM, a w szczególności nad zwijaniem korony pętli V3, opierały się na powyższym skrypcie; zaleca się zatem prostą modyfikację sekwencji w linii buildpep i uruchomienie powyższego skryptu z wiersza poleceń.
3. Reprezentatywne wyniki
Wyniki dla zwijania R2 są reprezentatywne dla wyników dla dowolnej pętli V3. Aby ocenić wyniki, należy otworzyć plik projektu (nazwany „newProject1.icb” przez powyższy skrypt) i wybrać opcję „Molecular Mechanics, Stack, View”. Pojawi się tabela konformacji stosu. Konformacje stosu można zwizualizować graficznie, klikając ikonę Plot/Histogram. Opcja „Molecular Mechanics, Stack, Play” utworzy film ze stosu, aby wizualnie ocenić preferencje konformacyjne ujawnione podczas zwijania. Dla sekwencji R2 konformacja przypomina beta-spinkę, co jest oczekiwane dla pętli V32 – szczególnie w fragmencie na pozycjach od 12 do 14, gdzie w całym stosie widoczna jest wyraźna preferencja dla nici β, a bardzo niewiele konformacji alfa-helikalnych. Co więcej, między konformacją o najniższej energii a konformacją o drugiej najniższej energii widoczna jest przerwa energetyczna wynosząca prawie 3 jednostki. Z punktu widzenia energetycznego oznacza to, że struktura opuszcza konformację o najniższej energii przez mniej niż jeden procent czasu: wyniki zwijania sugerują zatem, że korona R2 V3 jest strukturą sztywną, a nie elastyczną. W ansamblu konformacji mogą występować dodatkowe istotne cechy strukturalne, jednak ich systematyczna ocena jest trudna.
| JRFL | SF162_V3JRFL | SF162_V3R2 | |
| 447-52D GMT50 | 15 | 0.00061 | 0.00078 |
Tabela 1: Względna neutralizacja pętli V3 JRFL i R2 w warunkach maskowania i braku maskowania. Dane zostały wcześniej opublikowane w Cardozo T., et al. ARHR (2008) oraz Pinter, A., et al J. Virol (2004). W skrócie, aktywność neutralizacyjną określono za pomocą testu zakaźności jednocyklowej przy użyciu psV wytworzonych z plazmidu pNL4-3.Luc.R-E- wykazującego ekspresję lucyferazy i pozbawionego białka env, pseudotypowanego białkiem Env JRFL lub wariantami V3 SF162 opisanymi powyżej: SF162_V3JRFL zawiera sekwencję pętli V3 JRFL w miejsce sekwencji pętli V3 SF162, natomiast SF162_V3R2 zawiera sekwencję pętli V3 R2 w miejsce sekwencji pętli V3 SF162. psV inkubowano z rozcieńczeniami seryjnymi przeciwciała mAb 447-52D przez 1,5 h w temperaturze 37°C, a następnie dodano do komórek docelowych CD4+CCR5+ U87 wysianych na płytkach 96-dołkowych w obecności polybrene (10 mg=mL). Po 24 h komórki ponownie podkarmienie medium RPMI zawierającym 10% FBS i 10 mg=mL polybrene, po czym zastosowano dodatkową inkubację przez 24-48 h. Aktywność lucyferazy oznaczono 48-72 h po zakażeniu za pomocą luminometru do płytek mikrotiterowych (HARTA, Inc.) przy użyciu odczynników testowych od Promega, Inc. Geometryczne średnie miana dla 50% neutralizacji (GMT50) przez 447-52D wyznaczono poprzez interpolację z krzywych neutralizacji i stanowią one średnie z co najmniej trzech niezależnych testów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ab initio folding ujawnia trzeciorzędowe właściwości strukturalne, których efekty mogą nie być widoczne podczas sekwencyjnego badania poszczególnych aminokwasów. Symulacja zwijania ujawniła kilka wcześniej nieznanych właściwości strukturalnych korony pętli R2 V3. Zaobserwowane preferencje strukturalne mogą korelować z odnotowanymi właściwościami funkcjonalnymi szczepu R2, a mianowicie z wrażliwością na neutralizację i hiperzakaźnością5.
Po pierwsze, w N-końcowej połowie ko...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca była finansowana z grantów przyznanych przez Bill and Melinda Gates Foundation (#38631) oraz NIH, w tym DP2 OD004631 i R01 AI084119.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ICM-Pro | Molsoft LLC |
Bibliografia
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Zolla-Pazner, S. &, Cardozo, T. Dynamic characterization of the V3 loop crown. Antiviral Therapy. 12, 13-31 (2007).
- Almond, D., Kimura, T., Kong, X., Swetnam, J., Zolla-Pazner, S., Cardozo, T. Structural conservation predominates over sequence variability in the crown of HIV type 1's V3 loop. AIDS Res Hum Retroviruses. 26, (2010).
- Abagyan, R., Totrov, M. Biased probability Monte Carlo conformational searches and electrostatic calculations for peptides and proteins. J Mol Biol. 235, 983-1002 (1994).
- Quinnan, G. V., Zhang, P. F., Fu, D. W., Dong, M., Alter, H. J. Expression and characterization of HIV type 1 envelope protein associated with a broadly reactive neutralizing antibody response. AIDS Res Hum Retroviruses. 15, 561-5670 (1999).
- Zhang, P. F., Bouma, P., Park, E. J. A variable region 3 (V3) mutation determines a global neutralization phenotype and CD4-independent infectivity of a human immunodeficiency virus type 1 envelope associated with a broadly cross-reactive, primary virus-neutralizing antibody response. J Virol. 76, 644-655 (2002).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
