Choroba Parkinsona była wiązana z ekspozycją na pestycydy. Przedstawiamy tutaj metodę podawania pestycydów za pomocą zgłębnika żołądkowego w pożądanym stężeniu oraz metodę analizy ich wpływu na gromadzenie się alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Podawanie rotenonu drogą doustną za pomocą zgłębnika oraz analiza obrazowa inkluzji alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
U pacjentów z chorobą Parkinsona (PD) powiązana z nią patologia wykazuje charakterystyczny schemat obejmujący między innymi jelitowy układ nerwowy (ENS) 1,2, opuszka węchową (OB), jądro grzbietowe nerwu błądzącego (DMV)3, jądro pośrednio-boczne rdzenia kręgowego 4 oraz istotę czarną, co stanowi podstawę neuropatologicznego stopnia zaawansowania choroby4,5. ENS i OB są najbardziej narażonymi strukturami nerwowymi i pierwszymi, które zostają dotknięte procesem chorobowym. Co ciekawe, PD wiązano z ekspozycją na pestycydy6-8. W niniejszej pracy szczegółowo przedstawiamy dwie metody wykorzystane w naszym poprzednim badaniu 9. Aby przeanalizować efekty działania rotenonu miejscowo na ENS, podawaliśmy rotenon poprzez zgłębnik jednorocznym myszom C57/BL6. Rotenon jest powszechnie stosowanym pestycydem, który silnie hamuje mitochondrialny Kompleks I 10. Jest on silnie lipofilny i słabo wchłania się w przewodzie pokarmowym 11. Nasze wyniki wykazały, że podanie 5 mg/kg rotenonu nie zahamowało aktywności mitochondrialnego Kompleksu I w mięśniach ani w mózgu. Sugeruje to, że przy zastosowaniu naszej metody podawania rotenon nie przenikał przez system hepatoportalny i działał wyłącznie na ENS. Przedstawiamy tutaj metodę podawania pestycydów za pomocą zgłębnika oraz protokół analizy obrazu wykorzystany do oceny wpływu pestycydów na akumulację alfa-synukleiny w ENS. Pierwsza część prezentuje metodę umożliwiającą dokustryczne podawanie pestycydów (rotenonu) w pożądanym, precyzyjnym stężeniu. Druga metoda przedstawia półautomatyczny protokół analizy obrazu do oceny akumulacji alfa-synukleiny w ENS przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu.
Protokół
1) Podanie rotenonu drogą wewnątrzżołądkową
- Zważ zwierzę.
- Oblicz całkowitą objętość niezbędnego roztworu rotenonu/nośnika. W tym przypadku jest to 0,01 ml na gram masy ciała zwierzęcia.
- Napełnij strzykawkę 1 mL wcześniej obliczoną objętością roztworu rotenonu (0,625 mg/mL rotenonu, 4% karboksymetylocelulozy i 1,25% chloroformu) lub roztworu nośnika (4% karboksymetylocelulozy i 1,25% chloroformu). W tym przypadku odpowiada to dawce rotenonu 5 mg/kg.
- Chwyć mysz i, trzymając ją jedną ręką za ogon, naciągnij skórę szyi, pociągając ją dwoma pierwszymi palcami drugiej ręki.
- Po unieruchomieniu głowy między dwoma palcami, oprzyj ją o wnętrze dłoni i odwróć do góry nogami. Unieruchom ogon za pomocą czwartego i piątego palca.
- Trzymając głowę skierowaną do tyłu, naciśnij podniebienie, aby otworzyć pysk myszy. Delikatnie wprowadź zgłębnik do pyska. Ważne jest użycie igły do zgłębnika, a nie zwykłej igły. Powoli przesuwaj zgłębnik w kierunku żołądka na odpowiednią głębokość. Zapobiegnie to przedostaniu się materiału do płuc.
- Podaj roztwór rotenonu lub nośnik, delikatnie naciskając tłok. Po zakończeniu powoli wyjmij zgłębnik.
- Przenieś zwierzę z powrotem do innej klatki, aż wszystkie zwierzęta z jednej klatki zostaną poddane procedurze.
2) Procedury immunobarwienia
- Po zakończeniu leczenia myszy poddaje się znieczuleniu przy użyciu Ketamin 100 mg/kg oraz Xylazin 10 mg/kg i.p., a następnie wykonuje perfuzję wewnątrzsercową z użyciem 4% Paraformaldehyde w PBS.
- Następnie drogą sekcji wycina się jelita i umieszcza je w 15% sacharozie na noc. Następnego dnia tkankę przenosi się do 30% sacharozy i ponownie inkubuje przez noc w temperaturze 4°C.
- Tkankę umieszcza się następnie w Tissue-tek i przechowuje w zamrażarce w temperaturze -80°C do czasu użycia.
- Za pomocą kriotomatu wykonuje się przekroje poprzeczne jelita o grubości 20 micron i przenosi je na szkiełka Superfrost.
- Następnie przeprowadza się procedury blokowania i immunostaining z użyciem przeciwciał anty-βIII-tubulin oraz anty-alpha-synuclein, zgodnie z wcześniejszymi opisami 9.
3) Analiza obrazów inkluzji alfa-synukleiny
Zaleca się, aby analizy dokonała osoba zewnętrzna nieznająca pochodzenia obrazów. W związku z tym dane powinny zostać zakodowane. Analiza obrazów została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania FIJI.
- Otwórz plik obrazu konfokalnego. Następnie rozdziel kanały, aby umożliwić niezależną pracę na każdym z nich.
- Zamknij kanały, które nie będą używane, wybierz Analyze>Set Scale i ustaw Pixel size na 1. Ustaw known distance na 0.13 (wartość ta zależy od użytego obiektywu i rozdzielczości) i kliknij global. Rozmiar obrazu będzie teraz wyświetlany w mikronach.
- Wybierz kanał alfa-synukleiny i zaznacz zwoj (ganglion), upewniając się, że zaznaczenie obejmuje zwoj we wszystkich warstwach (slices).
- Wybierz Image>Duplicate, aby zduplikować obraz. Przy zaznaczonym zwoju zostanie zduplikowany tylko fragment obrazu o rozmiarze zwoju.
- Wybierz Edit>Clear Outside. Część obrazu poza zaznaczonym obszarem stanie się czarna.
- Ponownie zduplikuj obraz, aby w późniejszych krokach ocenić poprawność procedury. Obrazy o wysokim stosunku sygnału do szumu i tła nie powinny być używane do analizy obrazu.
- Wybierz Image>Adjust>Threshold, a następnie wybierz MaxEntropy. Przejrzyj warstwy w przyciętym obrazie oraz w obrazie oryginalnym, aby upewnić się, że procedura przebiegła pomyślnie. Próg entropijny wybiera poziom sygnału intensywności na podstawie histogramu obrazu, a na obrazie białym na czarnym zostaną wyświetlone tylko te piksele, których intensywność przekracza ten próg.
- Wybierz Process, a następnie kliknij Smooth. Ten krok przekształca poszarpane krawędzie obrazów w krawędzie gładkie.
- Wybierz Process, następnie kliknij Binary i wybierz Make Binary. Obraz zostanie wyświetlony jako obraz czarno-biały.
- Zduplikuj obraz, aby wykonać następny krok na kopii.
- Kliknij Analyze>Analyze particles. Następnie wybierz Show:Outlines i kliknij Summarize. Pozostałe ustawienia powinny pozostać domyślne. Funkcja ta rozpoznaje całkowitą liczbę pikseli z sygnałem oraz te, które są ze sobą zgrupowane. Raportowana jest całkowita powierzchnia pikseli z sygnałem, liczba grup pikseli oraz średni rozmiar.
- Porównaj i wybierz największą warstwę, która dobrze pasuje. Warstwa zostanie zaznaczona.
- Skopiuj tabelę danych zawierającą całkowitą powierzchnię alfa-synukleiny, liczbę inkluzji i średni rozmiar cząsteczek. Wklej dane do arkusza Excel lub zapisz je w innym miejscu.
- Wróć do FIJI, znajdź wcześniej wybraną warstwę w kanale β-tubuliny i zaznacz ją.
- Zaznacz obszar zwoju, kliknij Analyze, a następnie wybierz Measure. Pojawi się kolejna tabela pokazująca całkowitą powierzchnię zwoju.
- Przenieś dane z tabeli do arkusza Excel obok pomiarów alfa-synukleiny lub skopiuj je w inne miejsce.
- W programie Excel podziel poszczególne parametry uzyskane w pomiarze alfa-synukleiny przez powierzchnię zwoju, aby otrzymać całkowitą powierzchnię alfa-synukleiny oraz liczbę inkluzji znormalizowaną do wielkości zwoju.
4) Reprezentatywne wyniki
Pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia protokołu podawania przez zgłębnik, niedogodności dla zwierzęcia są minimalne. Leczenie z zastosowaniem tej koncentracji rotenonu umożliwia uzyskanie miejscowego efektu działania rotenonu na ENS bez obecności rotenonu we krwi oraz bez hamowania mitochondrialnego Kompleksu I w mięśniach lub mózgu, nawet po 1,5 miesiąca leczenia (patrz Rysunek 1). Przy prawidłowym przeprowadzeniu analizy obrazu możliwa powinna być rygorystyczna analiza wzorca alfa-synukleiny. Pozwala ona na uzyskanie wiarygodnych danych na temat całkowitej ilości alfa-synukleiny (całkowita powierzchnia), wzorca alfa-synukleiny w komórce (liczba inkluzji) oraz obecności inkluzji alfa-synukleiny (rozmiar inkluzji) (Rysunek 2).
Rysunek 1. Dysfunkcja motoryczna u myszy traktowanych rotenonem bez wykrycia rotenonu we krwi lub OUN. A, standard (50 ng/mL) oraz chromatogram z próbek mózgu myszy traktowanych dawkami 20, 10 i 5 mg/kg. B i C, ilościowe oznaczenie poziomu rotenonu we krwi (B) i OUN (C). B, poziomy we krwi 1, 2 i 3 godziny po traktowaniu. Myszy podzielono na trzy grupy (n=3) i podano im rotenon w dawkach 2,5, 5, 10 i 20 mg/kg (n=3); 300 μL krwi pobrano 1, 2 i 3 godziny po podaniu rotenonu, a następnie połączono próbki do analizy HPLC. C, myszy traktowano przez jeden tydzień raz dziennie dawkami 5 (n=3), 10 (n=3) i 20 (n=1) mg/kg rotenonu; mózg i pień mózgu wyizolowano 1 i 2 godziny po ostatniej aplikacji i przygotowano do analizy HPLC. D, aktywność mitochondrialnego Kompleksu I w próbkach mięśni i mózgu myszy traktowanych przez 1,5 miesiąca.
Rycina 2. Miejscowo podawany rotenon indukuje fosforylację, akumulację i agregację alfa-synukleiny wraz z gliozą w zwojach ENS. (paski skali 20 μm). A, B, C, barwienie przeciwko βIII-tubulinie, alfa-synukleinie i DAPI w przekrojach dwunastnicy (B) i jelita krętego (A,C). Strzałka w B, 1,5-miesięczne leczenie spowodowało zwiększenie punktowego wzorca alfa-synukleiny wewnątrz zwojów jelitowego układu nerwowego w porównaniu do kontroli z 3 miesięcy (A). Strzałka w C, 3-miesięczne leczenie wywołało tworzenie się większych inkluzji alfa-synukleiny (ø>6 μm). D, barwienie immunofluorescencyjne z użyciem przeciwciał przeciwko alfa-synukleinie, Thioflavine S i DAPI. Strzałka w D, tylko u myszy leczonych przez 3 miesiące stwierdzono agregację tych większych akumulacji alfa-synukleiny. E, E', E'', etapy ilościowej analizy obrazu. E, przykład obrazu użytego w kwantyfikacji przedstawiający zwój ENS przebarwiony przeciwko alfa-synukleinie z widocznymi różnymi inkluzjami. E', przykład obrazu uzyskanego po zastosowaniu protokołu analizy obrazu. E'', nakładanie się niektórych oryginalnych inkluzji (zielone) i reprezentacji uzyskanej po wykonaniu protokołu (żółte linie). F-G, kwantyfikacja eksperymentu przedstawionego w A-C została przeprowadzona przy użyciu automatycznej segmentacji i metod progowania opartych na entropii. Pojedyncza gwiazdka, P<0.05, a podwójna gwiazdka, P<0.01. F, każda kolumna reprezentuje całkowitą powierzchnię alfa-synukleiny/powierzchnię zwoju. G, każda kolumna reprezentuje całkowitą liczbę inkluzji alfa-synukleiny/powierzchnię zwoju. Wszystkie wykresy przedstawiają średnią ± s.e.m.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Podawanie domięśniowe było wcześniej stosowane 12. Jednakże, zgodnie z manuskryptem Indena, rotenon podawano rozpuszczony wyłącznie w 0,5% soli sodowej karboksymetylocelulozy (CMSS). Rotenon jest substancją silnie lipofilową. W związku z tym rotenonu nie można rozpuścić w samym 0,5% CMSS, gdyż uległby on wytrąceniu. Zastosowanie chloroformu pozwala na stworzenie równomiernie rozprowadzonej zawiesiny rotenonu, zapobiegając jego wytrącaniu. Ponadto, dzięki wyższym stężeniom pestycydów w CMSS, końcowa objętość po...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Francisco Pan-Montojo posiada oczekujący wniosek patentowy dla tego modelu zwierzęcego (numer wniosku PCT/EP 2009/005688).
Podziękowania
Praca ta została sfinansowana przez Fundację Pedro Barrie de la Maza.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Rotenon | Sigma-Aldrich | R8875 | Niemcy |
| Chloroform | Carl Roth GmbH | 3313.1 | Niemcy |
| Karboksymetyloceluloza | Sigma-Aldrich | C5678 | Niemcy |
| Kaniula do gavage 1,2 mm x 60 mm | Unimed | Szwajcaria | |
| LSM 510 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| FIJI | http://pacific.mpi-cbg.de |
Bibliografia
- Braak, H., de Vos, R. A., Bohl, J., Del Tredici, K., K, Gastric alpha-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology. Neurosci Lett. 396, 67-72 (2006).
- Wakabayashi, K., Takahashi, H., Ohama, E., Ikuta, F. Parkinson's disease: an immunohistochemical study of Lewy body-containing neurons in the enteric nervous system. Acta Neuropathol. 79, 581-583 (1990).
- Wakabayashi, K. Restricted occurrence of Lewy bodies in the dorsal vagal nucleus in a patient with late-onset parkinsonism. J Neurol Sci. 165, 188-191 (1999).
- Braak, H., Sastre, M., Bohl, J. R., de Vos, R. A., Del Tredici, K. Parkinson's disease: lesions in dorsal horn layer I, involvement of parasympathetic and sympathetic pre- and postganglionic neurons. Acta Neuropathol. 113, 421-429 (2007).
- Braak, H., Ghebremedhin, E., Rub, U., Bratzke, H., Del Tredici, K. Stages in the development of Parkinson's disease-related pathology. Cell Tissue Res. 318, 121-134 (2004).
- Gorell, J. M., Johnson, C. C., Rybicki, B. A., Peterson, E. L., Richardson, R. J. The risk of Parkinson's disease with exposure to pesticides, farming, well water, and rural living. Neurology. 50, 1346-1350 (1998).
- Semchuk, K. M., Love, E. J., Lee, R. G. Parkinson's disease and exposure to agricultural work and pesticide chemicals. Neurology. 42, 1328-1335 (1992).
- Butterfield, P. G., Valanis, B. G., Spencer, P. S., Lindeman, C. A., Nutt, J. G. Environmental antecedents of young-onset Parkinson's disease. Neurology. 43, 1150-1158 (1993).
- Pan-Montojo, F. Progression of Parkinson's disease pathology is reproduced by intragastric administration of rotenone in mice. PLoS One. 5, e8762-e8762 (2010).
- Sherer, T. B. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease. J Neurosci. 23, 10756-10764 (2003).
- Bove, J., Prou, D., Perier, C., Przedborski, S. Toxin-induced models of Parkinson's disease. NeuroRx. 2, 484-494 (2005).
- Inden, M. Neurodegeneration of mouse nigrostriatal dopaminergic system induced by repeated oral administration of rotenone is prevented by 4-phenylbutyrate, a chemical chaperone. J Neurochem. 101, 1491-1504 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
