Artykuł metodologiczny

Doustne podawanie rotenonu za pomocą zgłębnika i analiza obrazu inkluzji alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym

DOI:

10.3791/2123

⸱

26 października 2010

 , 
1Institute of Anatomy, Technische Universität Dresden

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba Parkinsona jest związana z ekspozycją na pestycydy. Tutaj pokazujemy metodę dostarczania pestycydów za pomocą sondy żołądkowej o pożądanym stężeniu oraz metodę analizy ich wpływu na akumulację alfa-synukleiny w jelitowym układzie nerwowym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

U pacjentów z chorobą Parkinsona (PD) związana z tym patologia przebiega według charakterystycznego wzorca obejmującego między innymi jelitowy układ nerwowy (ENS) 1,2, opuszkę węchową (OB), grzbietowe jądro ruchowe błędnika (DMV)3, jądro pośrednio-boczne rdzenia kręgowego 4 i istotę czarną, stanowiąc podstawę do neuropatologicznego stadium choroby4,5. ENS i OB są najbardziej narażonymi strukturami nerwowymi i pierwszymi, które są dotknięte chorobą. Co ciekawe, choroba Parkinsona jest związana z ekspozycją na pestycydy6-8. Tutaj szczegółowo pokazujemy dwie metody zastosowane w naszym poprzednim badaniu 9. W celu przeanalizowania wpływu rotenonu działającego miejscowo na ENS, podaliśmy rotenon za pomocą zgłębnika rocznym myszom C57 / BL6. Rotenon jest szeroko stosowanym pestycydem, który silnie hamuje mitochondrialny kompleks I 10. Jest silnie lipofilny i słabo wchłaniany w przewodzie pokarmowym 11. Nasze wyniki wykazały, że podanie 5 mg/kg rotenonu nie hamowało aktywności mitochondrialnego kompleksu I w mięśniach lub mózgu. Sugeruje to, że przy użyciu naszej metody podawania rotenon nie przekroczył systemu hepatoportalu i działał wyłącznie na ENS. Tutaj pokazujemy metodę podawania pestycydów za pomocą zgłębnika oraz protokół analizy obrazu stosowany do analizy wpływu pestycydu na akumulację alfa-synukleiny w ENS. W pierwszej części przedstawiono metodę, która pozwala na dożołądkowe podawanie pestycydów (rotenonu) w pożądanym precyzyjnym stężeniu. Druga metoda przedstawia półautomatyczny protokół analizy obrazu do analizy akumulacji alfa-synukleiny w ENS przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1) Dożołądkowe podawanie rotenonu

  1. Zważ zwierzę.
  2. Obliczyć całkowitą objętość potrzebnego roztworu rotenonu/nośnika. W tym przypadku 0,01 ml na gram masy ciała zwierzęcia.
  3. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml wcześniej obliczoną objętością roztworu rotenonu (0,625 mg/ml rotenonu, 4% karboksymetylocelulozy i 1,25% chloroformu) lub roztworu nośnika (4% karboksymetylocelulozy i 1,25% chloroformu). W tym przypadku odpowiada to dawce 5 mg/kg rotenonu.
  4. Podnieś mysz i trzymając jedną ręką ogon myszy, rozciągnij skórę szyi, ciągnąc ją pierwszymi dwoma palcami drugiej ręki.
  5. Gdy głowa zostanie zamocowana między dwoma palcami, oprzyj ją o dłoń i odwróć do góry nogami. Napraw ogon za pomocą czwartego i piątego palca.
  6. Trzymając głowę do tyłu, naciśnij podniebienie, aby otworzyć usta myszy. Delikatnie wprowadź zgłębnik do ust. Ważne jest, aby używać igły do wbijania przez zgłębnik, a nie zwykłej igły. Powoli przesuń zgłębnik w kierunku żołądka wystarczająco daleko. Pozwoli to uniknąć dostania się materiału do płuc.
  7. Podać roztwór rotenonu lub nośnik, delikatnie naciskając zator na zator tętnicy. Po zakończeniu powoli wyciągnij zgłębnik.
  8. Umieść zwierzę z powrotem w innej klatce, aż wszystkie zwierzęta z jednej klatki będą gotowe.

2) Procedury barwienia immunologicznego

  1. Po leczeniu myszy są znieczulane przy użyciu ketaminy 100 mg/kg i ksylazyny 10 mg/kg i.p. oraz perfuzji dosercowej z 4% paraformaldehydem w PBS.
  2. Wnętrzności są następnie ekstrahowane przez sekcję i umieszczane na noc w 15% sacharozy. Następnego dnia tkanka jest przenoszona do 30% sacharozy i ponownie inkubowana przez noc w temperaturze 4°C.
  3. Tkanka jest następnie umieszczana w Tissue-tek i przechowywana w zamrażarce w temperaturze -80°C do czasu użycia.
  4. Za pomocą kriostatu przekroje jelit o grubości 20 mikronów są przenoszone na szkiełka Superfrost.
  5. Następnie przeprowadza się procedury blokowania i barwienia immunologicznego przy użyciu przeciwciał anty-βIII-tubuliny i anty-alfa-synukleiny, jak opisano wcześniej 9.

3) Analiza obrazu inkluzji alfa-synukleiny

Zaleca się, aby analiza została przeprowadzona przez osobę z zewnątrz, nieznaną z pochodzenia obrazów. W związku z tym dane powinny zostać skodyfikowane. Analizę obrazu przeprowadzono przy użyciu oprogramowania FIJI.

  1. Otwórz plik obrazu konfokalnego. Następnie podziel kanały tak, aby możliwa była praca na każdym kanale niezależnie.
  2. Zamknij te kanały, które nie będą używane, wybierz opcję Analizuj>Ustaw skalę i ustaw rozmiar piksela na 1. Ustaw znaną odległość na 0,13 (będzie to zależeć od zastosowanego celu i rozdzielczości) i kliknij globalny. Rozmiar obrazu będzie teraz wyświetlany w mikronach.
  3. Wybierz kanał alfa-synukleiny i wybierz ganglion, upewnij się, że zaznaczenie obejmuje ganglion we wszystkich plasterkach.
  4. Naciśnij Image>Duplicate, aby zduplikować obraz. Po wybraniu ganglionu zostanie zduplikowany tylko obraz wielkości ganglionu.
  5. Naciśnij Edit>Clear Outside. Część obrazu znajdująca się poza zaznaczonym obszarem stanie się.
  6. Ponownie zduplikuj obraz, aby w późniejszych krokach określić, jak dobrze przebiegła procedura. Obrazy, które mają wysoki stosunek sygnału do szumu do tła, nie powinny być używane do analizy obrazu.
  7. Wybierz opcję Image>Adjust>Threshold (Próg) , a następnie wybierz pozycję MaxEntropy. Następnie przesuń się po plasterkach na przyciętym obrazie i oryginalnym, aby upewnić się, że procedura przebiegła pomyślnie. Próg entropii wybiera poziom sygnału intensywności na podstawie histogramu obrazu i tylko te piksele, których intensywność jest wyższa niż ten próg, będą wyświetlane na obrazie białym na czarnym
    8. .
  8. Wybierz Proces, a następnie kliknij Wygładzanie. Ten krok przekształca pikselowane krawędzie obrazów w gładkie krawędzie.
  9. Wybierz Proces, a następnie kliknij Binarny i wybierz Utwórz binarny. Obraz zostanie wyświetlony jako obraz czarno-biały.
  10. Zduplikowany obraz, aby wykonać następny krok na zduplikowanym obrazie.
  11. Kliknij Analizuj>Analizuj cząstki. Następnie wybierz Pokaż:Kontury i kliknij Podsumowaj. Reszta ustawień powinna zostać pozostawiona jako domyślne. Ta funkcja rozpoznaje całkowitą liczbę pikseli z sygnałem oraz tych, które są zgrupowane razem. Podaje się całkowitą powierzchnię pikseli z sygnałem oraz liczbę grup pikseli i średni rozmiar.
  12. Porównaj i wybierz największy wycinek, który dobrze się dopasowuje. Wycinek zostanie oznaczony
    13. .
  13. Skopiuj tabelę danych z całkowitą powierzchnią alfa-synukleiny, liczbą inkluzji i średnią wielkością cząstek. Wklej dane do arkusza kalkulacyjnego programu Excel lub z adnotacjami w innym miejscu.
  14. Wróć do FIDŻI i znajdź poprzednio wybrany wycinek w kanale β-tubuliny i wybierz go.
  15. Wybierz obszar ganglionu i kliknij Analizuj, a następnie wybierz Zmierz. Pojawi się kolejna tabela pokazująca całkowitą powierzchnię ganglionu.
  16. Wyodrębnij dane z tabeli do arkusza Excela w pobliżu pomiaru alfa-synukleiny lub skopiuj je w inne miejsce.
  17. Korzystając z programu Excel, podziel różne parametry uzyskane w pomiarze alfa-synukleiny przez powierzchnię zwoju, aby uzyskać całkowitą powierzchnię alfa-synukleiny i liczbę inkluzji znormalizowaną przez rozmiar ganglionu.

4) Reprezentatywne wyniki

Gdy protokół podawania zgłębnika jest wykonywany poprawnie, niedogodności dla zwierzęcia są minimalne. Leczenie z użyciem tego stężenia rotenonu umożliwia miejscowe działanie rotenonu na ENS bez poziomu rotenonu we krwi i bez hamowania mięśni lub mózgu Mitochondrialnego kompleksu I nawet po 1,5 miesiąca leczenia (patrz rycina 1). Jeśli analiza obrazu zostanie przeprowadzona prawidłowo, powinna być możliwa rygorystyczna analiza wzorca alfa-synukleiny. Daje wiarygodne dane na temat całkowitej ilości alfa-synukleiny (całkowita powierzchnia), wzoru alfa-synukleiny w komórce (liczba inkluzji) i obecności inkluzji alfa-synukleiny (wielkość inkluzji) (ryc. 2).

figure-protocol-1
Rysunek 1. Dysfunkcja motoryczna u myszy leczonych rotenonem bez wykrycia rotenonu we krwi lub OUN. A, wzorzec (50 ng / ml) i chromatogram z próbek mózgu myszy leczonych 20, 10 i 5 mg / kg. B i C, oznaczanie ilościowe poziomów rotenonu we krwi (B) i OUN (C). B, stężenia we krwi 1, 2 i 3 godziny po zabiegu. Myszy podzielono na trzy grupy (n = 3) i leczono im 2,5, 5, 10 i 20 mg / kg rotenonu (n = 3), 300 μl krwi pobrano 1, 2 i 3 godziny po podaniu rotenonu i zebrano razem do analizy HPLC. C, myszy leczono przez tydzień raz dziennie 5 (n = 3), 10 (n = 3) i 20 (n = 1) mg / kg rotenonu, mózg i pień mózgu ekstrahowano 1 i 2 godziny po ostatnim podaniu i przygotowywano do analizy HPLC. D, aktywność mitochondrialnego kompleksu I w próbkach mięśni i mózgu myszy leczonych przez 1,5 miesiąca.

figure-protocol-2
Rysunek 2. Miejscowo podawany rotenon indukuje fosforylację, akumulację i agregację alfa-synukleiny z glejozą w zwojach ENS. (podziałka liniowa 20 μm). Barwienie A, B, C, anty βIII-tubuliny, alfa-synukleiny i DAPI w odcinkach dwunastnicy (B) i jelita krętego (A,C). Arrow w B, 1,5-miesięczna terapia indukowała zwiększony wzór punktowy alfa-synukleiny w zwojach jelitowego układu nerwowego w porównaniu z kontrolą 3 miesięcy (A). Strzała w C, 3 miesiące leczenia indukowały tworzenie większych inkluzji alfa-synukleiny (ø>6 μm). D, barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu anty-alfa-synukleiny, tioflawiny S i DAPI. Arrow w D, tylko 3-miesięczne leczone myszy wykazały agregację tych większych nagromadzeń alfa-synukleiny. E, E', E'', etapy kwantyfikacji analizy obrazu. E, przykład obrazu użytego do oznaczania ilościowego, przedstawiającego gangion ENS wybarwiony immunologicznie przeciwko alfa synukleinie wykazujący różne inkluzje. E', przykład obrazu uzyskanego po protokole analizy obrazu. E'', nakładają się na siebie niektóre z oryginalnych inkluzji (kolor zielony) oraz reprezentacja uzyskana po wykonaniu protokołu (żółte linie). F-G, kwantyfikacja eksperymentu pokazanego w A-C została dokonana przy użyciu metod automatycznej segmentacji i progowania opartych na entropii. Pojedyncza gwiazdka, P<0,05 i podwójna gwiazdka, P<0,01. F, każda kolumna reprezentuje całkowitą powierzchnię alfa-synukleiny / powierzchnię zwoju. G, każda kolumna reprezentuje całkowitą liczbę inkluzji alfa-synukleiny / powierzchnię zwoju. Wszystkie wykresy pokazują średnią ± s.e.m.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podawanie dożołądkowe było wcześniej wykonywane 12. Jednak, zgodnie z rękopisem Indena, rotenon podawano rozpuszczony w 0,5% samej soli sodowej karboksymetylocelulozy (CMSS). Rotenon jest substancją o wysokiej zawartości lifofilów. Dlatego rotenon nie może być rozpuszczony w samym 0,5% CMSS i wytrąci się, jeśli to nastąpi. Zastosowanie chloroformu tworzy równomiernie rozprowadzoną zawiesinę rotenonową, unikając wytrącania się. Ponadto, ze względu na wyższe stężenia pestycydu w CMSS, końcowa objętość podawaneg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Francisco Pan-Montojo złożył wniosek patentowy na ten zwierzęcy model (numer zgłoszenia PCT/EP 2009/005688).

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fundacja Pedro Barrie de la Maza wsparła tę pracę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RotenonSigma-AldrichR8875Niemcy
ChloroformCarl Roth GmbH3313.1Niemcy
KarboksymetylocelulozaSigma-AldrichC5678Niemcy
Zgłębnik 1,2 mm x 60 mmUnimedSzwajcaria
LSM 510Carl Zeiss, Inc.
FIDŻIhttp://pacific.mpi-cbg.de

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Braak, H., de Vos, R. A., Bohl, J., Del Tredici, K., K, Gastric alpha-synuclein immunoreactive inclusions in Meissner's and Auerbach's plexuses in cases staged for Parkinson's disease-related brain pathology. Neurosci Lett. 396, 67-72 (2006).
  2. Wakabayashi, K., Takahashi, H., Ohama, E., Ikuta, F. Parkinson's disease: an immunohistochemical study of Lewy body-containing neurons in the enteric nervous system. Acta Neuropathol. 79, 581-583 (1990).
  3. Wakabayashi, K. Restricted occurrence of Lewy bodies in the dorsal vagal nucleus in a patient with late-onset parkinsonism. J Neurol Sci. 165, 188-191 (1999).
  4. Braak, H., Sastre, M., Bohl, J. R., de Vos, R. A., Del Tredici, K. Parkinson's disease: lesions in dorsal horn layer I, involvement of parasympathetic and sympathetic pre- and postganglionic neurons. Acta Neuropathol. 113, 421-429 (2007).
  5. Braak, H., Ghebremedhin, E., Rub, U., Bratzke, H., Del Tredici, K. Stages in the development of Parkinson's disease-related pathology. Cell Tissue Res. 318, 121-134 (2004).
  6. Gorell, J. M., Johnson, C. C., Rybicki, B. A., Peterson, E. L., Richardson, R. J. The risk of Parkinson's disease with exposure to pesticides, farming, well water, and rural living. Neurology. 50, 1346-1350 (1998).
  7. Semchuk, K. M., Love, E. J., Lee, R. G. Parkinson's disease and exposure to agricultural work and pesticide chemicals. Neurology. 42, 1328-1335 (1992).
  8. Butterfield, P. G., Valanis, B. G., Spencer, P. S., Lindeman, C. A., Nutt, J. G. Environmental antecedents of young-onset Parkinson's disease. Neurology. 43, 1150-1158 (1993).
  9. Pan-Montojo, F. Progression of Parkinson's disease pathology is reproduced by intragastric administration of rotenone in mice. PLoS One. 5, e8762-e8762 (2010).
  10. Sherer, T. B. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson's disease. J Neurosci. 23, 10756-10764 (2003).
  11. Bove, J., Prou, D., Perier, C., Przedborski, S. Toxin-induced models of Parkinson's disease. NeuroRx. 2, 484-494 (2005).
  12. Inden, M. Neurodegeneration of mouse nigrostriatal dopaminergic system induced by repeated oral administration of rotenone is prevented by 4-phenylbutyrate, a chemical chaperone. J Neurochem. 101, 1491-1504 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Podanie doustne przez zg bnikpodawanie rotenonuprotok analizy obrazumikroskopia konfokalnaoprogramowanie Fijimetody progowaniaanaliza cz stekpowierzchnia zwoju

Powiązane artykuły