Ta procedura pozwala na oczyszczanie fragmentów DNA z dużą wydajnością.
Method Article
Elektroelucja fragmentów DNA
Opens in a new tab
In This Article
Summary
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Abstract
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Oczyszczone fragmenty DNA są używane do różnych celów w biologii molekularnej i mogą być przygotowywane za pomocą kilku procedur. Większość z nich wymaga wcześniejszej elektroforezy fragmentów DNA w celu oddzielenia interesującego nas pasma. Następnie pasmo to jest wycinane z żelu agarozowego lub akrylowego i oczyszczane za pomocą: wiązania i elucji z cząstek szkła lub krzemionki, membran DEAE-celulozowych, metody "zgniatania i namaczania", elektroelucji lub bardzo często drogich komercyjnych zestawów do oczyszczania. W związku z tym wybór metody będzie zależał głównie od tego, co jest dostępne w laboratorium. Procedura elektroelucji pozwala na oczyszczenie bardzo czystego DNA, które może być wykorzystane w wielu zastosowaniach (sekwencjonowanie, znakowanie radioaktywne, restrykcja enzymatyczna, modyfikacja enzymatyczna, klonowanie itp.). Procedura ta polega na umieszczeniu plastrów agarozy lub akrylamidu zawierających pasmo DNA w dołkach na próbki elektroelutera, a następnie zastosowanie prądu spowoduje, że fragment DNA opuści agarozę, a tym samym zostanie uwięziony w soli poduszkowej, która zostanie później odzyskana przez wytrącanie etanolu.
Protocol
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- W celu wybrania interesujących fragmentów DNA do oczyszczenia, należy je rozpuścić w żelu z agarozy lub akryloamidu barwionym bromkiem etydyny przez elektroforezę przy użyciu 0,5-krotnego buforu TBE (Tris boran, EDTA) przy napięciu 120 woltów przez 1 godzinę. W tym celu użyto ~ 700 ng plazmidu pProEx-GdMre11S (6000-bp) wcześniej strawionego za pomocą NdeI i HindIII, aby uwolnić fragment o długości 900 pz (560 ng plazmidu i 84 ng fragmentu).
- Zbiornik elektroelutera (rysunek 1) powinien być napełniony 0,5 razem TBE równomiernie rozmieszczonym po każdej stronie środkowego płaskowyżu, uważając, aby nie rozlać go na środkowy płaskowyż.
- Wybrane pasmo (lub pasma) wycina się z żelu i umieszcza w komorze na próbkę jak najbliżej kanału V (jeden plasterek na studzienkę). Do każdej komory należy dodać bufor do pracy; tylko tyle, aby pokryć plasterek żelu.
- Każdy używany kanał V musi być przepłukany pipetą Pasteura, aby wyeliminować wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza.
- Następnie delikatnie dodaje się 100 ul 10 M octanu NH4 (dla ułatwienia wizualizacji dodaje się niewielką ilość błękitu bromofenolowego, tylko tyle, aby go zabarwić) do kanału V.
- Pokrywę należy delikatnie zamknąć, aby zapobiec ponownemu zawieszeniu poduszki o wysokiej zawartości soli.
- Elektroelucję rozpoczyna się przy napięciu 100 woltów przez 25 minut.
- Po zakończeniu elektrolutacji 400 ul usuwa się z kanału V i umieszcza w probówce do mikrofuge, którą należy wytrącić 2 objętościami zimnego etanolu i glikogenu (zalecane w celu poprawy odzyskiwania DNA) w temperaturze 4 ° C przez 1 godzinę lub noc.
- Wirować przez 20 minut, usunąć supernatant i przemyć 70% etanolem.
- Wysuszyć probówkę i określić ilościowo DNA przy OD 260 nm.
- Uzyskany odzysk wyniósł 75% (63 ng odzyskane po umieszczeniu 84 ng w kanale V).
Rysunek 1. Schemat elektroelutera. Anoda katoda jest wskazana po obu stronach zbiornika, DNA zawarte w żelu pokrojonym w plasterki (zilustrowane jako kwadrat) będzie migrować w kierunku katody ze względu na swój ładunek ujemny. Następnie zostanie uwięziony w poduszce solnej (reprezentowanej jako odwrócony trójkąt) znajdującej się w kanale V.
Discussion
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Czas trwania cyklu będzie w dużym stopniu zależał od wielkości fragmentów, zwykle w przypadku fragmentów do 20 kb wystarczy od 50 minut do 1 godziny, podczas gdy w przypadku małych fragmentów wymagane jest monitorowanie światła UV co 10 minut, aby zapobiec przedostawaniu się fragmentu przez poduszkę solną, a w konsekwencji do anodowej komory buforowej, zmniejszając odzysk. Ważne jest, aby upewnić się, że po ustawieniu zasilania na 100 woltów prąd wynosi co najmniej 10 mAmp. Pasmo DNA można monitorować za pomocą ręcznej lampy UV i wykryć, kiedy opuszcza ono plasterek żelu. Sól poduszkowa może być również wytwarzana z octanu 3 M Na.
Procedura ta pozwala na oczyszczenie fragmentów DNA lub RNA o różnych rozmiarach z dobrym odzyskiem (~80%) w celu znakowania radioaktywnego, trawienia przez enzymy restrykcyjne, przetwarzania przez enzymy modyfikujące itp.
Disclosures
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Acknowledgements
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Praca w laboratorium Dr. Bermudez została sfinansowana przez Conacyt (Grant # 82622) . Dziękujemy Gabrieli Gutierrez-Sosa, Eliuth Reyes-Martinez i Ximenie Rodriguez-Torres za nagranie wideo procedury elektrolacji.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|
| NdeI | New England Biolabs | R0111L | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| octan NH4 | JT Baker | 0596 | |
| agaroza | Invitrogen | 15510-027 | |
| Biofotometr | Eppendorf | 6131 000 020 | |
| Electr– | luter IBI | UEA CAT 46000 |
References
Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission