Niniejsza procedura umożliwia oczyszczanie fragmentów DNA z wysoką wydajnością.
Artykuł metodologiczny
Elektroeluowanie fragmentów DNA
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Oczyszczone fragmenty DNA są wykorzystywane w różnych celach w biologii molekularnej i mogą być przygotowywane za pomocą kilku procedur. Większość z nich wymaga uprzedniej elektroforezy fragmentów DNA w celu oddzielenia interesującego nas pasma. Następnie pasmo to jest wycinane z żelu agarozowego lub akrylamidowego i oczyszczane z wykorzystaniem: wiązania i elucji z cząsteczek szkła lub krzemionki, membran DEAE-celulozowych, „metody kruszenia i moczenia” (crush and soak method), elektroelucji lub bardzo często drogich komercyjnych zestawów do oczyszczania. Zatem wybór metody zależy głównie od dostępności odpowiednich środków w laboratorium. Procedura elektroelucji pozwala na uzyskanie bardzo czystego DNA, które może być wykorzystane w wielu zastosowaniach (sekwencjonowanie, znakowanie radiologiczne, trawienie enzymatyczne, modyfikacja enzymatyczna, klonowanie itp.). Procedura ta polega na umieszczeniu wycinków żelu agarozowego lub akrylamidowego zawierających pasmo DNA w dołkach próbkowych elektroelutera; następnie przyłożenie prądu powoduje opuszczenie przez fragment DNA struktury agarozy i jego uwięzienie w poduszce solnej, skąd jest on później odzyskiwany poprzez precypitację etanolem.
Protokół
- W celu wyboru fragmentów DNA przeznaczonych do oczyszczenia, należy je rozdzielić w żelach agarozowych lub akrylamidowych barwionych bromkiem etydyny za pomocą elektroforezy w buforze 0.5X TBE (Tris-boran, EDTA) przy napięciu 120 V przez 1 godzinę. W tym celu wykorzystano ~ 700 ng plazmidu pProEx-GdMre11S (6000 bp) wcześniej trawionego enzymami NdeI i HindIII, aby wyciąć fragment o długości 900 bp (560 ng plazmidu i 84 ng fragmentu).
- Zbiornik do elektroelucji (Rysunek 1) należy wypełnić buforem 0.5X TBE, rozdzielając go równomiernie po obu stronach środkowego plateau, dbając o to, aby nie rozlał się on na samo plateau.
- Wybrany prążek (lub prążki) należy wyciąć z żelu i umieścić w komorze na próbkę jak najbliżej kanału V (jeden wycinek na każdą komorę). Do każdej komory należy dodać bufor do elektroforezy w ilości wystarczającej do całkowitego przykrycia wycinka żelu.
- Każdy używany kanał V musi zostać przepłukany pipetą Pasteura w celu usunięcia wszelkich uwięzionych pęcherzyków powietrza.
- Następnie do wnętrza kanału V należy ostrożnie dodać 100 µl 10 M octanu NH4 (w celu ułatwienia wizualizacji dodaje się niewielką ilość błękitu bromofenolowego, wystarczającą do zabarwienia roztworu).
- Pokrywę należy zamknąć ostrożnie, aby zapobiec resuspensji poduszki z wysokim stężeniem soli.
- Elektroelucję rozpoczyna się przy napięciu 100 V przez 25 minut.
- Po zakończeniu elektroelucji z kanału V pobiera się 400 µl i przenosi do probówki do mikrocentryfugi w celu wytrącenia z użyciem 2 objętości zimnego etanolu i glikogenu (zalecanego w celu poprawy odzysku DNA) w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę lub przez noc.
- Wirować przez 20 minut, usunąć nadsącz i przemyć 70% etanolem.
- Osuszyć probówkę i określić ilość DNA przy OD 260 nm.
- Uzyskany odzysk wyniósł 75% (odzyskano 63 ng z 84 ng umieszczonych w kanale V).
Rysunek 1. Schemat elektroelutora. Anoda i katoda są zaznaczone po obu stronach zbiornika; DNA zawarte w plasterku żelu (przedstawionym jako czarny kwadrat) migrować będzie w kierunku katody ze względu na swój ładunek ujemny. Następnie zostanie ono zatrzymane w poduszce solnej (przedstawionej jako odwrócony czarny trójkąt) znajdującej się w kanale V.
Dyskusja
Czas trwania procesu będzie w dużej mierze zależeć od wielkości fragmentów; zazwyczaj w przypadku fragmentów do 20 kb wystarczy od 50 minut do 1 godziny, natomiast dla małych fragmentów wymagane jest monitorowanie światłem UV co 10 minut, aby zapobiec przedostaniu się fragmentu przez poduszkę solną, a w konsekwencji do anodowej komory buforowej, co zmniejszyłoby odzysk. Ważne jest, aby upewnić się, że przy ustawieniu zasilacza na 100 volt natężenie prądu wynosi co najmniej 10 mAmp. Pasmo DNA można monitorować za pomocą lampy UV, aby wykryć moment, w którym opuszcza ono fragment żelu. Poduszkę solną można również przygotować z 3 M Na acetate.
Niniejsza procedura umożliwia oczyszczanie fragmentów DNA lub RNA o różnych rozmiarach z dobrą wydajnością odzysku (~80%), które mają zostać znakowane radioaktywnie, trawione enzymami restrykcyjnymi, przetwarzane przez enzymy modyfikujące itp.
Oświadczenia
Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Prace w laboratorium dr Bermudez były finansowane przez Conacyt (Grant # 82622). Dziękujemy Gabrielie Gutierrez-Sosa, Eliuthowi Reyes-Martinezowi i Ximenie Rodriguez-Torres za nagranie wideo procedury elektroelucji.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| NdeI | New England Biolabs | R0111L | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NH4 octan | JT Baker | 0596 | |
| agaroza | Invitrogen | 15510-027 | |
| Biofotometr | Eppendorf | 6131 000 020 | |
| Elektro–Luter | IBI | UEA CAT 46000 |
Bibliografia
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , 2nd Ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 3 Volume Set (1989).
Przedruki i uprawnienia
