Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Streszczenie

Interakcje białko-białko są cechą charakterystyczną wszystkich kluczowych procesów komórkowych. Jednak wiele z tych oddziaływań ma charakter przejściowy lub jest energetycznie słabe, co uniemożliwia ich identyfikację i analizę za pomocą tradycyjnych metod biochemicznych, takich jak koimmunoprecypitacja. W związku z tym genetycznie kodowane białka fluorescencyjne (GFP, RFP itp.) oraz związane z nimi nakładające się widma fluorescencji zrewolucjonizowały naszą zdolność do monitorowania słabych interakcji in vivo z wykorzystaniem transferu energii rezonansowej Förstera (FRET)^1-3. W niniejszym materiale szczegółowo opisujemy zastosowanie testu zbliżenia opartego na FRET do monitorowania interakcji receptor-receptor na powierzchni komórek śródbłonka.

Protokół

Protokół składa się z trzech głównych etapów. Pierwszy krok, polegający na klonowaniu genu zainteresowania do ssaczego wektora ekspresyjnego na N-końcu monomerycznych wersji CFP i/lub YFP, zostanie omówiony jedynie krótko. Drugi i trzeci etap, czyli transfekcja DNA wektorowego do komórek śródbłonka EA.hy926 oraz obrazowanie konfokalne z wykorzystaniem FRET, zostały opisane poniżej bardziej szczegółowo.

1. Konstrukcja chimerycznych receptorów CFP i YFP

Badane receptory należy sklonować na N-końcu monomerycznych, ulepszonych wersji CFP i YFP. Wyznaczenie FRET ma charakter empiryczny i jest krytycznie zależne od długości łącznika między regionem transbłonowym a początkiem fluoroforu¹. W związku z tym dla każdej nowej badanej pary receptorów należy przetestować kilka różnych długości łącznika.

1. Do wektora pcDNA3.1 hygro^R lub neo^R zawierającego monomeryczny C- lub YFP (wektor ten można uzyskać z naszego laboratorium), sklonować wybrany receptor do miejsc NheI/EcoRI. *Uwaga: W razie potrzeby NheI jest kompatybilny z kilkoma innymi enzymami, w tym SpeI i XbaI.
2. Przenieść produkt reakcji ligacji poprzez transformację do odpowiedniej linii kompetentnych komórek endA1 recA (my rutynowo stosujemy Mach1). Przesiać kolonie w celu sprawdzenia obecności insertu, a następnie przeprowadzić sekwencjonowanie DNA, aby zweryfikować brak mutacji.
3. Po potwierdzeniu sukcesu klonowania molekularnego, przygotować DNA wektora o jakości do transfekcji w wodzie sterylnej lub buforze TE, korzystając z zestawów do izolacji DNA firmy Qiagen lub podobnych. Ocenić stężenie i czystość za pomocą spektroskopii UV. Typowe wydajności DNA powinny mieścić się w zakresie 100-200 μg, co rutynowo rozcieńcza się do stężenia roboczego 1 μg/μL.

2. Transfekcja komórek EA.hy 926

1. Przesiej komórki EA.hy 926⁴, hodowane w pełnym medium DMEM (DMEM+10% płodowa surowica bydlęca+Pen./Strep.), do szalek 35 mm z nakrywkami MatTek (No. 0) zawierających 2 mL medium. Z jednej konfluentnej szalki 15 cm można konserwatywnie uzyskać ~15 szalek (~90% konfluencji następnego dnia). Przygotuj jedną szalkę do oceny ekspresji każdego pojedynczego receptora, a także jedną szalkę dla każdej pary receptorów.
2. Inkubuj komórki przez noc w atmosferze 5% CO₂ w temperaturze 37°C. Następnego dnia hodowle powinny osiągnąć konfluencję ~70-90%.
3. W dniu transfekcji przygotuj kompleksy nukleolipidowe, mieszając 2 μg DNA wektora chimerycznego receptora (2 μL) z 8 μL Fugene6 w 200 μL uprzednio ogrzanego OptiMEM. W przypadku par receptorów wykonaj transfekcję przy użyciu 1 μg każdego receptora, co daje łącznie 2 μg (zob. również dyskusję poniżej).
4. Wymieszaj delikatnie poprzez odwracanie probówki.
5. Kontynuuj inkubację w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
6. W czasie inkubacji przygotuj komórki do transfekcji. Odessaj świeże medium i delikatnie oraz krótko przemyj każdą płytkę ciepłym PBS, a następnie dodaj 2 mL uprzednio ogrzanego pełnego DMEM bez antybiotyków (DMEM+FBS). Ważne jest, aby uniknąć obecności penicyliny i streptomycyny, ponieważ są one znacznie bardziej toksyczne dla komórek podczas traktowania Fugene6.
7. Dodaj kompleks kroplami do komórek i inkubuj przez kolejne 20-24 godziny w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO₂.
8. Po 24 godzinach ostrożnie odessaj medium z komórek i pipetuj świeże pełne DMEM z antybiotykami. Po transfekcji żywotność komórek powinna pozostać stosunkowo wysoka, tzn. nie powinno być obserwowanych prawie żadnych komórek pływających.
9. Ekspresja genów jest zazwyczaj maksymalna po kolejnych 48-60 godzinach od transfekcji. Jednak obrazowanie jest zazwyczaj możliwe już po 24 godzinach. Należy przeprowadzić eksperymenty z analizą przebiegu czasowego w celu optymalizacji ekspresji genów.

3. Obrazowanie konfokalne i analiza FRET

Obrazowanie żywych komórek jest wykonywane przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego Leica TCS-SP2 AOBS wyposażonego w lasery: niebieską diodę (405 nm), argonowy (458, 476, 488, 514 nm), zielony HeNe (543 nm), pomarańczowy HeNe (594 nm) i czerwony HeNe (633 nm), obiektyw HCX PI Apo 63x/1.3 n.a. z imersją glicerynową, zmotoryzowany stół XY (Märzhäuser) oraz inkubator stołowy z kontrolą parametrów środowiskowych (temperatury, wilgotności i CO₂) (PeCon). Kontrole eksperymentalne są niezbędne w celu wyeliminowania przesłuchów między kanałami emisji fluoroforów, a także oceny problemów z ekspresją i nieswoistej multimeryzacji fluoroforów. W związku z tym, do konfiguracji każdej sesji obrazowania wykorzystuje się transfekcje pojedynczym fluoroforem. Należy przeprowadzić negatywne kontrole FRET (z użyciem znanych receptorów nieoddziałujących), aby określić poziom tła FRET wynikający z nadekspresji.

1. Aby wyeliminować przesłuchy (crosstalk) między kanałami emisji CFP i YFP, umieść kontrolę ekspresji CFP w inkubatorze stolika. Korzystając ze światła białego, dostosuj płytkę Z, aby ustawić ostrość na komórkach.
2. Ustaw zakresy okna SP dla detekcji emisji CFP na 465-505 nm oraz YFP na 525-600 nm.
3. Monitorując oba kanały emisji, wzbudź CFP przy 458 nm. Za pomocą AOTF ustaw moc lasera tak, aby wyeliminować znaczące przenikanie (bleed over) CFP do kanału emisji YFP. Zapisz to ustawienie.
4. Przeprowadź analogiczną kontrolę przesłuchów YFP (używając kontroli ekspresji YFP) w kanale CFP, dostosowując moc wzbudzenia przy 514 nm dla komórek wykazujących ekspresję wyłącznie YFP. Zapisz to ustawienie.
5. Następnie umieść w inkubatorze stolika komórki koekspresujące CFP i YFP. Korzystając z ustawień sekwencji w oprogramowaniu konfokalnym Leica, zlokalizuj komórki wykazujące podobne poziomy CFP i YFP z prawidłową lokalizacją błonową.
6. Używając programu fotowybielania akceptora w oprogramowaniu Leica, ustaw parametry donora i akceptora zgodnie z wcześniej zapisanymi ustawieniami dla CFP i YFP odpowiednio.
7. Po powiększeniu obrazu komórki, zaznacz ROI (region zainteresowania), w którym ma nastąpić fotodestrukcja YFP na błonie komórkowej, i uruchom program.
8. W celu fotodestrukcji akceptora ustaw AOTF na 100% przy 514 nm i kontynuuj wybielanie laserowe, aż do momentu utraty 70% emisji YFP. Aby przyspieszyć wybielanie, ROI zazwyczaj wybiera się w osi rastra lasera (oś X).
9. Podczas fotowybielania monitoruj ruch komórkowy i odrzuć pomiary uzyskane przy znacznym ruchu w płaszczyźnie XY, ponieważ mogą one wykazać fałszywą wydajność FRET.
10. Obrazy przed i po wybielaniu są rejestrowane zarówno dla donora (CFP), jak i akceptora (YFP), a wydajność FRET obliczana jest jako: FRET_Eff=(D_post-D_pre)/D_post dla wszystkich D_post > D_pre, gdzie D_pre i D_post to odpowiednio natężenie donora przed i po fotowybielaniu.
11. Oprogramowanie JMP (SAS) jest wykorzystywane do określenia zakresu zmienności eksperymentalnej.

4. Reprezentatywne wyniki

Wydajność transfekcji zazwyczaj mieści się w przedziale od 30 do 40%. W przeciwieństwie do wcześniejszych doniesień innych autorów, nie zaobserwowaliśmy, aby transfekcja i ekspresja jednego wektora sprzyjała drugiemu. W rzeczywistości często obserwujemy wyłączną ekspresję jednej lub drugiej chimery fluoroforu. Typowe wydajności FRET różnią się w zależności od systemów receptorowych. Dla systemu receptorów Tie typowe wartości wynoszą 20-28% w komórkach nabłonkowych i 19-23% w komórkach śródbłonkowej. W przypadku kontroli negatywnych typowe wydajności są niższe niż 2-3%. Zakres zmienności znacznie zmniejszy się wraz z nabywanym doświadczeniem.

Rycina 1. Reprezentatywne obrazy transfekowanych komórek EA.hy 926. A) Obraz DIC monowarstwy komórek EA.hy 926. B) Obraz fluorescencyjny komórek przedstawionych na (A). C) Nałożenie obrazów (A) i (B) wykazujące wydajność transfekcji na poziomie ~20-30%.

Rysunek 2. Reprezentatywna analiza fotowybielania akceptora dla FRET zachodzącego między CFP a YFP w komórce EA.hy926. Kanał emisji CFP (panele górne) oraz kanał emisji YFP (dwa panele dolne) były monitorowane oddzielnie przed i po fotowybielaniu akceptora. Eksperymenty z fotowybielaniem były ograniczone do obszaru wewnątrz zielonej ramki, z którego obliczono wartości FRET. Efektywność FRET została przedstawiona jako zakres bezwzględny od wysokiej (czerwony-1.0) do niskiej (fioletowy-0.0) na powiększonym nałożeniu zmergedowanego obrazu CFP/YFP wyłącznie w celu orientacji.

Dyskusja

Istnieje kilka kroków krytycznych dla sukcesu procedury. Najważniejszym z nich są względne poziomy ekspresji dwóch receptorów chimerycznych. Aby rozwiązać ten problem, można stworzyć stabilne linie komórkowe wykazujące ekspresję obu białek zainteresowania lub określić optymalne proporcje DNA wektora, aby umożliwić równoważną ekspresję. Podobnie, ze względu na nierównomierną transfekcję w obrębie szalki, poziomy białek rzadko będą jednakowe we wszystkich komórkach. Dlatego należy zwrócić uwagę na rozróżnienie komórek o „wysokiej” ekspresji od tych o „niskiej”. Komórki wykazujące „przeciętne” poziomy białka zazwyczaj dają wiarygodne i powtarzalne wartości wydajności FRET. Jedną z metod, którą nasze laboratorium zastosowało w celu zniwelowania tego problemu, jest użycie wirusów adenowirusowych i lentiwirusowych w celu „wyrównania” ekspresji genów. Ponadto alternatywną metodą dla fotowybielania akceptora w określaniu wydajności FRET jest emisja sensybilizowana. Jednak pomimo potencjału emisji sensybilizowanej do monitorowania pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym, stwierdziliśmy, że fotowybielanie akceptora jest bardziej czułe i bardziej niezawodne.

Wreszcie, wykorzystanie FRET do monitorowania oddziaływań białkowych może być problematyczne i wymaga starannego doboru długości łączników dla receptorów związanych z błoną. Co więcej, dodanie C/YFP często znacząco wpływa na poziomy ekspresji białek i prowadzi do ich agregacji w siateczce śródplazmatycznej oraz aparacie Golgiego. Niemniej jednak, w przypadku oddziaływań przejściowych lub niestabilnych, FRET jest idealną metodologią do zastosowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Invitrogen	11960-069
Penicylina-streptomycyna	Invitrogen	15070-063
Płodowa surowica bydlęca	Hyclone	N/A
Opti-MEM	Invitrogen	11058-021
FUGENE 6	Roche Group	11814443001
Szalki z zakrywek	MatTek Corp.	P35G014C
pcDNA3.1(+)	Invitrogen	V790‐20
Komórki kompetentne Mach 1	Invitrogen	C862003