W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodologię umożliwiającą długotrwałą hodowlę embrionów ptaków ex-ovo. Technika ta jest idealna do eksperymentów podłużnych, które wymagają pełnej dostępności optycznej i/lub sterylnego transportu embrionów ptaków.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
System hodowli embrionów kurzych ex-ovo odpowiedni do obrazowania i zastosowań mikrochirurgicznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zrozumienie zależności między czynnikami genetycznymi a mikrośrodowiskowymi, które napędzają prawidłowy oraz wadliwy rozwój embrionalny, jest kluczowe dla odkrywania nowych strategii terapeutycznych. Postępy w technologiach obrazowania umożliwiły ilościowe badanie organizacji i dojrzewania planu budowy ciała, jednak morfogeneza embrionalna w późniejszych stadiach jest mniej poznana. Zarodki kurczęce stanowią atrakcyjny kręgowy model zwierzęcy do tych zastosowań ze względu na łatwość hodowli i manipulacji chirurgicznych. Wczesne embriony można hodować przez krótki czas na pierścieniach z papieru filtracyjnego, co zapewnia pełny dostęp optyczny do badań nad wzorcowaniem i losem komórek1,2. Badania zaawansowanych procesów rozwojowych, takich jak morfogeneza serca, tradycyjnie prowadzi się przez okno w skorupie jaja3-5, jednak technika ta ogranicza dostęp optyczny ze względu na rozmiar okna. Opracowaliśmy wcześniej prostą metodę hodowli całych embrionów ex-ovo w heksagonalnych łódkach ważnych do 10 dni, co umożliwiło obrazowanie o wysokiej rozdzielczości za pomocą ultrasonografii6,7. Hodowle te były trudne w transporcie, co ograniczało rodzaje narzędzi obrazujących dostępnych do eksperymentów na żywo. Przedstawiamy tutaj udoskonalony system hodowli bezskorupowej z ekonomiczną, przenośną komorą środowiskową. Jaja rozbijano na „hamak” utworzony z membrany poliuretanowej (folii spożywczej) przymocowanej obwodowo do plastikowego kubka częściowo wypełnionego sterylną wodą. Zarówno wymiary obwodu, jak i głębokość hamaka były krytyczne dla utrzymania napięcia powierzchniowego, natomiast mechanika hamaka i wody znajdującej się pod nim pomagały tłumić wibracje wywołane transportem. Opracowano również kompaktową łaźnię wodną z cyrkulacją, aby umożliwić ciągłą kontrolę temperatury podczas eksperymentów. Wykazujemy możliwość hodowli embrionów w ten sposób przez co najmniej 14 dni bez wad morfogenetycznych lub opóźnień i wykorzystujemy ten system w kilku zastosowaniach mikrochirurgicznych i obrazowych.
Protokół
1. Protokół hodowli ex-ovo:
- Inkubacja zapłodnionych jaj kurzych
- Zapłodnione jaja kurze mogą być przechowywane w temperaturze 13°C do 5 dni przed inkubacją bez inicjowania rozwoju. Temperaturę tę można utrzymać za pomocą chłodziarki do czerwonego wina.
- Inkubować jaja tępą stroną do góry w inkubatorze przy stałej wilgotności 60% z ciągłym kołysaniem w temperaturze 37.5°C przez 72 godziny.
- Przygotowanie hamaków (Rycina 1a)
- Napełnić do ¾ wysokości plastikowe kubki o pojemności 9 oz ciepłą sterylną wodą. Standardowy kubek 9 oz ma średnicę górną 8 cm. Ustalono, że rozmiar ten jest najbardziej odpowiedni dla zastosowań w długotrwałej kulturze przedstawionych w niniejszej pracy.
- Odciąć około 20 cm folii spożywczej. Przymocować ją okrężnie na górze kubka, zakładając gumkę recepturkę. Folia powinna być rozciągnięta nad wodą. Odciąć nadmiar folii wokół gumki. Stwierdzono, że folia spożywcza jest najbardziej odpowiednia do tego zastosowania, ponieważ zapobiega przyleganiu żółtka, co mogłoby prowadzić do jego pęknięcia podczas transportu.
- Przetrzeć folię chusteczkami kimwipes (Kimberly-Clark, Inc.) zwilżonymi 70% etanolem.
- Wyjąć jaja z inkubatora po 72 godzinach inkubacji.
- Zsterylizować jaja, przecierając powierzchnię chusteczkami kimwipes zwilżonymi 70% etanolem.
- Położyć jaja poziomo na 1-2 minuty w celu prawidłowego ustawienia zarodka (Rycina 1b). Do poziomego ułożenia jaj można użyć wytłoczki do jaj. Zarodki obrócą się do góry po 1-2 minutach.
- Przenieść zarodki na hamaki aseptycznie w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
- Używając ostrej krawędzi (np. krawędzi metalowego wiadra lub szklanego zlewki), delikatnie uderzyć w jajo, aż na jego dolnej stronie powstanie niewielkie wgniecenie (Rycina 1c). Należy pamiętać, że zarodek znajduje się w górnej części.
- Umieścić kciuki po przeciwnych stronach wgniecenia i rozdzielić skorupki poziomo (Rycina 1d).
- Umieścić żółtko wraz z zarodkiem oraz albuminę na hamaku (rycina 1e). Albumina zapewni amortyzujące środowisko wokół żółtka, aby absorbować wstrząsy wywołane przemieszczaniem układu, a także dostarczy składników odżywczych zarodkowi podczas długotrwałej hodowli. Woda pod hamakiem zapewni, że zarodek pozostanie równolegle do podłoża podczas transportu i będzie służyć jako przewodnik ciepła podczas obrazowania, jeśli stosowany jest grzejnik z cyrkulacją wody.
- Jeśli transfer został wykonany prawidłowo, zarodek powinien znajdować się już u góry. W przeciwnym razie należy użyć tępego, sterylnego przedmiotu (np. tępego końca zamkniętych nożyczek zakrzywionych) i kierunkowo pogłaskać żółtko tak, aby zarodek obrócił się do góry.
- Na wierzchu kubka położyć szalkę Petriego o średnicy 10 cm, aby zabezpieczyć zarodek.
- Umieścić kulturę w kubku w inkubatorze ustawionym na 37.5°C. W przypadku użycia inkubatora przenośnego, umieszczenie 1-2 kubków 9 oz wypełnionych wodą destylowaną pozwala utrzymać wilgotność na poziomie ~60% (Rycina 1f).
- W przypadku hodowli zarodków poza 7. dniem embrionalnym, wokół obwodu zarodka należy rozsypać pokruszone fragmenty skorupki jaja jako źródło wapnia dla rozwoju i dojrzewania kości.
Wyposażenie dodatkowe do obrazowania i manipulacji poza inkubatorem:
W celu utrzymania temperatury inkubacji podczas obrazowania lub manipulacji zbudowano w laboratorium cyrkulacyjną kąpiel wodną (Rysunek 3). Kąpiel wodna, w której mieści się naczynie, jest połączona za pomocą odpowiednio dobranych rurek ze zbiornikiem wody. Grzałka rezystancyjna podgrzewa wodę w zbiorniku, a temperatura jest regulowana ręcznie na podstawie pomiarów. Woda jest tłoczona przez pompę wodną. Przedstawienie graficzne obrazuje łatwość obrazowania za pomocą ultrasonografii/mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunek 3).
Rysunek 1. Przygotowanie hamaka i przeniesienie embrionów kurzych do hamaków.
Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki – zarodki kurczęcia na różnych stadiach rozwoju hodowane za pomocą techniki kultury ex ovo. Zarodki od stadium HH 17 mogą być hodowane za pomocą tej techniki.
Rysunek 3. Schemat i reprezentatywne zdjęcia systemu cyrkulacji wody stosowanego wraz z systemem hodowli ex-ovo w celu utrzymania zarodków w optymalnej temperaturze rozwoju.
2. Wybrane zastosowania:
I. Mikroiniekcja
Ta hodowla embrionów jest odpowiednia do zastosowań w mikroiniekcjach, w których roztwory muszą zostać wstrzyknięte do naczyń krwionośnych w celu obrazowania opartego na kontraście (np. mikroskopia fluorescencyjna, mikrotomografia komputerowa itp.) (Rysunek 4). Poniżej znajduje się protokół mikroiniekcji:
- Przygotowanie aparatury do iniekcji
- Wytworzono mikroiły o ściętych końcówkach poprzez wyciąganie szklanych kapilar o średnicy wewnętrznej (ID) 0,75 mm przy użyciu mikrokuźni. Wymiar końcówki zależy od średnicy docelnej żyły lub pożądanej prędkości przepływu.
- Podłączyć strzykawkę do rurki silikonowej o wewnętrznej średnicy 0,03 cala.
- Napełnij rurkę roztworem do wstrzyknięcia i podłącz mikroigłę do rurki.
- Umieść mikroiigłę w mikromanipulatorze, a strzykawkę w uchwycie do strzykawek lub pompie strzykawkowej.
- Do kubka należy dodać sterylną wodę, aby unieść embrion. Doświadczalnie ustalono, że w celu prawidłowego wprowadzenia igły do naczynia krwionośnego (tj. naczynia pępkowego), konieczna jest penetracja pozioma. Wymaga to, aby embrion znajdował się w tej samej płaszczyźnie co krawędzie kubka.
- Zdejmij gumkę recepturkę podtrzymującą plastik pod zarodkiem.
- Delikatnie unieś jedną stronę folii i dodaj do naczynia trochę sterylnej wody.
- Ponownie zamocuj gumkę na plastiku.
- Wstrzyknij roztwór do naczynia embrionalnego. Z naszego doświadczenia wynika, że w przypadku wstrzykiwania roztworu do naczynia żółtkowego mikroiły powinny mieć rozmiar około 1/10th średnicy naczynia, aby utrzymać efektywną perfuzję bez wywoływania krwawienia.
- wpompuj roztwór do mikroiły, upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza.
- Ustaw końcówkę mikroiły na wybranym naczyniu. W przypadku naczyń witelinowych wybór obszaru rozwidlenia zapewni maksymalną powierzchnię do penetracji naczynia.
- Przesunąć igłę w kierunku naczynia. Naczynie początkowo się cofnie. Po przebiciu naczynia przez igłę należy rozpocząć perfuzję. Kolor płynącej krwi powinien ulec zmianie w miarę postępu perfuzji. Jeśli zmiana koloru nie wystąpi, igła mogła przebić naczynie na wylot. W takim przypadku należy powoli wycofać mikroigłę, jednocześnie pompując roztwór, aż do momentu zaobserwowania zmiany koloru w naczyniu. Po zakończeniu perfuzji należy wycofać mikroigłę z naczynia.
Rysunek 4: Mikrosekcja barwnika fluorescencyjnego do naczyń krwionośnych zarodka kurczaka hodowanego w systemie ex-ovo.
II. Procedura mikrosurgicalna - podwiązanie lewego przedsionka
Ten układ hodowli ex-ovo jest idealny do przeprowadzania zabiegów chirurgicznych na embrionach kurczaka, ponieważ zapewnia pełny dostęp do zarodka. Poniżej znajduje się protokół dla przykładowej techniki – podwiązania lewego przedsionka (LAL) (Rycina 5). Procedurę wykonuje się w około 24. godzinie okresu hodowli (HH24):
- Przygotować węzły nadgarstkowe o średnicy ~0.5 mm, używając nylonowej nici chirurgicznej 10-0.
- Za pomocą precyzyjnej pęsety lokalnie usunąć błony chorionowe i alantoidowe znad zarodka, a następnie unieść zarodek od strony grzbietowej i obrócić go pionowo tak, aby widoczna była jego lewa strona.
- Używając precyzyjnej pęsety, usunąć osierdzie nad lewym przedsionkiem.
- Ustawić węzeł nad lewym przedsionkiem i go zaciągnąć. Węzeł należy zawiązać tak, aby ograniczyć pierwotny przepływ krwi na lewą stronę o ~75%. Odciąć końce nici mikronożyczkami, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić nadmiar nici.
- Obrócić zarodek z powrotem do pierwotnej orientacji (strona prawa na górze).
- W grupie kontrolnej (sham) zastosuje się tę samą procedurę, jednak nić zostanie jedynie przeprowadzona przez tkankę, a nie zawiązana. Skuteczność zabiegu LAL (zwężenie o 75%) zostanie potwierdzona 24 godziny po operacji, a zarodki niezakwalifikowane zostaną wykluczone.
Rysunek 5: Zarodek kurczaka z grupy kontrolnej oraz zarodek z podwiązanym lewym przedsionkiem. Strzałka wskazuje lewy przedsionek, który jest o około 75% mniejszy w zarodku z podwiązaniem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Dostęp optyczny i przeprowadzanie eksperymentów na embrionach ptaków jest utrudnione ze względu na ograniczenia wynikające z budowy skorupy jaja. Wycinanie okna znacząco ogranicza liczbę mikronaczyń dostępnych do iniekcji oraz podejść mikrochirurgicznych8. W rezultacie manipulacje są możliwe jedynie w przypadku wczesnych embrionów, a ciągła obserwacja nie jest wykonalna. Wczesne hodowle ex-ovo z wykorzystaniem szalek Petriego miały ograniczone zastosowanie, ponieważ niewystarczająca kontrola napięcia ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zapłodnione jaja białej kury rasy Leghorn | |||
| Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO | |||
| Folia spożywcza Saran Wrap | |||
| Chusteczki Kimwipes | Kimberly-Clark Corporation | ||
| Gumki recepturki | |||
| Ciepła sterylna woda | |||
| Plastikowy kubek 9 oz | |||
| Szalka Petri o średnicy 100 mm | |||
| Termiczny inkubator powietrzny 1602N | GQF Manufacturing | ||
| Dekstran koniugowany z fluoresceiną (2 MDa, 1% w/v w roztworze soli fosforanowej PBS) | Sigma-Aldrich | ||
| Mikrokuźnia (Microforge) | Glassworx, Inc, St Louis MO | ||
| Szklane kapilary (średnica wewnętrzna 0.75 mm) | |||
| Mikromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | Model M3301L | |
| Mikroskop fluorescencyjny | Carl Zeiss, Inc. | Z20 | |
| Precyzyjna pęseta nr 55 | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Szycie chirurgiczne nylonowe 10-0 | Ethicon Inc. | ||
| Przewody | VWR international | średnica zewnętrzna 1mm | |
| Strzykawka 3 mL | BD Biosciences | ||
| Pipetka 200 μL i końcówki do pipety | VWR international |
Bibliografia
- Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).
- Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos. Dev Biol. 207, 163-175 (1999).
- Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo. Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).
- deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle. Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition. Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).
- McQuinn, T. C. High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development. Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. , (2007).
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos. Dev Biol. 41, 391-394 (1974).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
