Izolacja komórek śródbłonka zastawek

Podsumowanie

Przedstawiamy metodę izolacji i hodowli czystych populacji komórek śródbłonka zastawek serca (VEC). Komórki VEC można izolować z obu stron cuspisu lub płatka zastawki, a bezpośrednio po tym procesie możliwe jest łatwe wyizolowanie znajdujących się pod nimi komórek śródmiąższowych (VIC).

Streszczenie

Zastawki serca odpowiadają wyłącznie za utrzymanie jednokierunkowego przepływu krwi w układzie sercowo-naczyniowym. Te cienkie, włókniste tkanki są poddawane znacznym naprężeniom mechanicznym, otwierając się i zamykając kilka miliardów razy w ciągu całego życia. Niezwykła wytrzymałość tych tkanek wynika z obecności komórek śródbłonka zastawkowego (VEC) oraz komórek śródmiąższowych (VIC), które nieustannie naprawiają i przebudowują tkankę w odpowiedzi na lokalne sygnały mechaniczne i biologiczne. Dopiero niedawno zaczęliśmy rozumieć wyjątkowe zachowania tych komórek, w czym kluczową rolę odegrały eksperymenty in vitro. Szczególnie wymagająca jest izolacja i hodowla VEC. Szczególnej ostrożności należy zachować od momentu pobrania tkanki z organizmu gospodarza aż po końcowe wysianie komórek. Przedstawiamy tutaj protokoły bezpośredniej izolacji, izolacji specyficznej dla strony, hodowli oraz weryfikacji czystych populacji VEC. Stosujemy trawienie enzymatyczne, po którym następuje delikatna technika zdrapywania wymazem w celu oddzielenia wyłącznie komórek powierzchniowych. Komórki te są następnie zbierane do probówki i wirowane do postaci osadu. Osad jest następnie resuspendowany i wysiewany do kolb hodowlanych uprzednio pokrytych macierzą kolagenu I. Fenotyp VEC potwierdza się poprzez wzrost z hamowaniem kontaktowym oraz ekspresję markerów specyficznych dla śródbłonka, takich jak PECAM1 (CD31), czynnik von Willebranda (vWF), a także brak ekspresji alfa-aktyny mięśni gładkich (α-SMA). Funkcjonalne właściwości VEC wiążą się z wysokimi poziomami acetylowanego LDL. W przeciwieństwie do komórek śródbłonka naczyniowego, VEC mają unikalną zdolność do transformacji w mezenchymę, co normalnie zachodzi podczas embrionalnego tworzenia się zastawki¹. Może to również wystąpić podczas znacznie przedłużonej hodowli in vitro po osiągnięciu konfluencji, dlatego należy dbać o pasażowanie komórek w momencie osiągnięcia lub w pobliżu konfluencji. Po izolacji VEC można łatwo uzyskać czyste populacje VIC.

Protokół

1. Przygotowanie

1. Autoklawować w przykrytej tacy z instrumentami następujące elementy:
   1. Pinceta chirurgiczna z ząbkami – do manipulowania tkanką płatka
   2. Nożyczki chirurgiczne (8 cm) – do przycinania tkanki płatków i kuspisów
   3. Patyczki bawełniane – do izolowania warstwy śródbłonka z płatka lub kuspisu
2. Przygotować sterylną roztwór kolagenazy:
   1. Dodać 4,0 g sproszkowanego DMEM do 250 mL wody 18 MΩ.
   2. Dodać 1,11 g wodorowęglanu sodu.
   3. Dodać (600 U/mL) 180 000 jednostek kolagenazy.
   4. Dodać 1% (3 mL) penicyliny/streptomycyny.
   5. Dostosować pH roztworu do 7,2.

Dyskusja

Zrozumienie biologii zastawek było utrudnione ze względu na problemy techniczne związane z izolacją i hodowlą czystych populacji komórek śródbłonka zastawek. Typowe techniki izolacji obejmują trawienie enzymatyczne podstawowej macierzy lub chemiczną dysocjację wiązań adhezyjnych śródbłonka^2,3. Wstępne eksperymenty z izolacją oceniano jakościowo, zmieniając stosowane środki dysocjujące oraz okresy inkubacji. Wyniki tych eksperymentów wykazały, że inkubacja w EDTA (lub Trypsynie-EDTA) przez maksymalnie 60 minut .......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Modyfikowane pożywka Eagle'a Dulbecco’	Mediatech, Inc.	50-103-PB
Płodowa surowica bydlęca	GIBCO, by Life Technologies	26140
Penicylina-streptomycyna	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
0.25% Trypsyna-EDTA	GIBCO, by Life Technologies	25200
Sól sodowa heparyny	Sigma-Aldrich	H4784-1G
Kolagenaza Typ 2	Worthington Biochemical	LS004176
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	21300-058
Kolagen z ogona szczura	BD Biosciences	354236
Wymazówki Critical Swabs	VWR international	89031-270
Węglan sodu	Sigma-Aldrich	55761
Kolby T25	BD Biosciences	353018
Kolby T75	BD Biosciences	353136
Płytka 24-dołkowa	Falcon BD	353047
Szkiełka 60x15 mm	VWR international	25384-092
Szkiełka szklane 60x15	VWR international	89000-310
Wosk do zatapiania w parafinie	Electron Microscopy Sciences	19304-01
Igły Precision Glide	BD Biosciences	305165
Filtry Nalgene 500 mL	VWR international	73520-985
Filtry Nalgene 1L	VWR international	73520-986
Pinceta tkankowa	Fine Science Tools	11023-15
Pinceta FSC #5	Fine Science Tools	11295-00