Izolacja komórek śródbłonka zastawek

Podsumowanie

Przedstawiamy metodę izolacji i hodowli czystych populacji komórek śródbłonka zastawek serca (VEC). Komórki VEC można izolować z obu stron cuspisu lub płatka zastawki, a bezpośrednio po tym procesie możliwe jest łatwe wyizolowanie znajdujących się pod nimi komórek śródmiąższowych (VIC).

Streszczenie

Zastawki serca odpowiadają wyłącznie za utrzymanie jednokierunkowego przepływu krwi w układzie sercowo-naczyniowym. Te cienkie, włókniste tkanki są poddawane znacznym naprężeniom mechanicznym, otwierając się i zamykając kilka miliardów razy w ciągu całego życia. Niezwykła wytrzymałość tych tkanek wynika z obecności komórek śródbłonka zastawkowego (VEC) oraz komórek śródmiąższowych (VIC), które nieustannie naprawiają i przebudowują tkankę w odpowiedzi na lokalne sygnały mechaniczne i biologiczne. Dopiero niedawno zaczęliśmy rozumieć wyjątkowe zachowania tych komórek, w czym kluczową rolę odegrały eksperymenty in vitro. Szczególnie wymagająca jest izolacja i hodowla VEC. Szczególnej ostrożności należy zachować od momentu pobrania tkanki z organizmu gospodarza aż po końcowe wysianie komórek. Przedstawiamy tutaj protokoły bezpośredniej izolacji, izolacji specyficznej dla strony, hodowli oraz weryfikacji czystych populacji VEC. Stosujemy trawienie enzymatyczne, po którym następuje delikatna technika zdrapywania wymazem w celu oddzielenia wyłącznie komórek powierzchniowych. Komórki te są następnie zbierane do probówki i wirowane do postaci osadu. Osad jest następnie resuspendowany i wysiewany do kolb hodowlanych uprzednio pokrytych macierzą kolagenu I. Fenotyp VEC potwierdza się poprzez wzrost z hamowaniem kontaktowym oraz ekspresję markerów specyficznych dla śródbłonka, takich jak PECAM1 (CD31), czynnik von Willebranda (vWF), a także brak ekspresji alfa-aktyny mięśni gładkich (α-SMA). Funkcjonalne właściwości VEC wiążą się z wysokimi poziomami acetylowanego LDL. W przeciwieństwie do komórek śródbłonka naczyniowego, VEC mają unikalną zdolność do transformacji w mezenchymę, co normalnie zachodzi podczas embrionalnego tworzenia się zastawki¹. Może to również wystąpić podczas znacznie przedłużonej hodowli in vitro po osiągnięciu konfluencji, dlatego należy dbać o pasażowanie komórek w momencie osiągnięcia lub w pobliżu konfluencji. Po izolacji VEC można łatwo uzyskać czyste populacje VIC.

Protokół

1. Przygotowanie

1. Autoklawować w przykrytej tacy z instrumentami następujące elementy:
   1. Pinceta chirurgiczna z ząbkami – do manipulowania tkanką płatka
   2. Nożyczki chirurgiczne (8 cm) – do przycinania tkanki płatków i kuspisów
   3. Patyczki bawełniane – do izolowania warstwy śródbłonka z płatka lub kuspisu
2. Przygotować sterylną roztwór kolagenazy:
   1. Dodać 4,0 g sproszkowanego DMEM do 250 mL wody 18 MΩ.
   2. Dodać 1,11 g wodorowęglanu sodu.
   3. Dodać (600 U/mL) 180 000 jednostek kolagenazy.
   4. Dodać 1% (3 mL) penicyliny/streptomycyny.
   5. Dostosować pH roztworu do 7,2.
   6. Dopełnić objętość roztworu do 270 mL.
   7. Zsterylizować roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,2 μm.
   8. Dodać 10% (30 mL) sterylnej płodowej surowicy bydlęcej.
3. Przygotować sterylne pożywkę dla komórek śródbłonka:
   1. Dodać 6,7 g sproszkowanego DMEM do 400 mL wody 18 MΩ.
   2. Dodać 1,85 g wodorowęglanu sodu.
   3. Dodać (50 U/mL) 25 000 jednostek heparyny.
   4. Dodać 1% (5 mL) penicyliny/streptomycyny.
   5. Dostosować pH roztworu do 7,2.
   6. Dopełnić objętość roztworu do 450 mL.
   7. Zsterylizować roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,2 μm.
   8. Dodać 10% (50 mL) sterylnej płodowej surowicy bydlęcej.
4. Przygotować sterylną pożywkę dla komórek śródmiąższowych:
   1. Dodać 13,37 g sproszkowanego DMEM do 800 mL wody 18 MΩ.
   2. Dodać 3,7 g wodorowęglanu sodu.
   3. Dodać 1% (10 mL) penicyliny/streptomycyny.
   4. Dostosować pH roztworu do 7,2.
   5. Dopełnić objętość roztworu do 900 mL.
   6. Zsterylizować roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,2 μm.
   7. Dodać 10% (100 mL) sterylnej surowicy bydlęcej.

2. Izolacja płatków zastawek serca

1. Natychmiast po uśmierceniu zwierzęcia aseptycznie wyciąć początek aorty.
2. Dokładnie wypłukać początek aorty z krwi, używając zimnego, sterylnego DPBS. Niezbędne jest jak najszybsze usunięcie wszystkich składników krwi, aby ograniczyć obumieranie VEC oraz kontaminację bakteryjną. Na tym etapie nie zaleca się stosowania antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych, ponieważ mogą one być szkodliwe dla VEC.
3. Wyizolować płatki zastawek (3 na zastawkę) bezpośrednio z początku aorty i umieścić je w sterylnej probówce stożkowej o pojemności 15 mL wypełnionej 12 mL zimnego DPBS. Kilka razy wstrząsnąć, aby usunąć zanieczyszczenia, a następnie ponownie napełnić świeżym DPBS.
4. Transportować do laboratorium w lodzie.
5. Po przybyciu do laboratorium umieścić pojemnik z tkanką pod sterylnym dygestorium.

3. Izolacja warstwy śródbłonka

1. Napełnić sterylną szalkę 35 mm ilością 3 mL zimnego roztworu kolagenazy na jedną zastawkę (3 płatki).
2. Przenieść wszystkie trzy płatki z probówki 15 mL do szalki wypełnionej roztworem kolagenazy.
3. Inkubować tkankę przez 5-10 minut w temperaturze 37°C.
4. Delikatnie usunąć warstwę śródbłonka, obracając suchym sterylnym wymazem po powierzchni płatka. Kierunek obrotu oraz siła przyłożonego ścinania są kluczowe dla czystości próbki. Wymaz należy obracać w kierunku przeciwnym do liniowego ruchu ręki, tworząc kontrolowane ścinanie. To właśnie siły ścinające oddzielają komórki śródbłonka od tkanki. Przyłożona siła powinna być wystarczająca, aby odczuć opór tkanki, ale nie może doprowadzić do przebicia błony podstawnej.
5. Okresowo dotykać wymazem roztworu kolagenazy, aby uwolnić komórki z włókien końcówki wymazu. Po zakończeniu pobierania tekstura warstwy śródbłonka powinna stać się nieco gładsza niż wcześniej.
6. Zebrać zawiesinę komórkową z kolagenazą i przenieść do nowej sterylnej probówki 15 mL.
7. Wirować probówki z prędkością 1000 rpm przez 5 minut, aby osadzić wyizolowane komórki, a następnie odessać nadsącz. W przypadku jednoczesnej izolacji komórek śródmiąższowych, należy przeprowadzić odpowiedni protokół w czasie wirowania tych komórek.
8. Dodać 3 mL pożywki dla śródbłonka świńskiego do probówek 15 mL, odwirować po raz drugi i odessać pożywkę. To drugie wirowanie pomaga odfiltrować część niepożądanych zanieczyszczeń, takich jak włókna z końcówki wymazu.
9. Resuspendować odwirowane komórki śródbłonka w 5 mL pożywki dla śródbłonka świńskiego i wysiać komórki do wcześniej powleczonej kolagenem kolby T-25 (stosować 1 kolbę na każdą probówkę z wirówki).
10. Pozostawić komórki do wzrostu przez co najmniej 2-3 dni przed wymianą pożywki dla śródbłonka. Pozwala to komórkom na regenerację i podziały, ponieważ proces izolacji jest dość obciążający, a wydajność komórkowa może być niska. Krytyczne jest pasażowanie komórek blisko stanu konfluencji, ponieważ inhibicja kontaktowa może prowadzić do transformacji komórek.

4. Przygotowanie szalki hodowlanej 60 mm do izolacji specyficznej dla strony

1. Wyłożyć szklane szalki Petri o średnicy 60 mm folią aluminiową (2 szalki szklane na jeden liścik). Folia aluminiowa ułatwia usuwanie parafiny, dzięki czemu szklane szalki Petri mogą zostać użyte ponownie do innych izolacji.
2. Wypełnić szalki granulkami parafiny do około połowy ich pojemności, a następnie przykryć w celu autoklawowania.
3. Po zakończeniu autoklawowania i stopieniu parafiny, przenieść zestaw szalek na chłodną, płaską powierzchnię. W miarę stygnięcia parafina stwardnieje, tworząc warstwę odporną na nakłuwanie igłą.
4. Po 30 minutach wysterylizowana szalka może zostać użyta jako komora izolacyjna do unieruchomienia tkanki liścika.

5. Izolacja warstwy śródbłonka specyficznej dla danej strony

1. Wyjąć płatki z probówek 15mL i umieścić je na przygotowanej szalce hodowlanej 60mm w celu izolacji specyficznej dla danej strony.
2. Ułożyć płatek tak, aby strona ventricularis znajdowała się skierowana w dół na powierzchni parafiny, pozostawiając odsłoniętą stronę fibrosa. Przypiąć krawędzie płatka, aby odsłonić warstwę śródbłonka.
3. Nanieść kilka kropli zimnej kolagenazy na każdą (skierowaną ku górze) powierzchnię śródbłonka i inkubować tkankę przez 5-10 minut w temperaturze 37°C.
4. Podobnie jak wcześniej, delikatnie usunąć warstwę śródbłonka, obracając suchym sterylnym wymazem po powierzchni płatka. Kierunek obrotu oraz siła przyłożonego ścinania są krytyczne dla czystości próbki. Obrót wymazu powinien odbywać się w kierunku przeciwnym do liniowego ruchu ręki, tworząc kontrolowane ścinanie. To właśnie ścinanie powoduje oddzielenie komórek śródbłonka od tkanki i nic więcej. Przyłożona siła powinna być wystarczająca, aby poczuć opór tkanki, ale nie może doprowadzić do penetracji tkanki.
5. Okazjonalnie zanurzać wymaz w roztworze kolagenazy, aby uwolnić komórki z włókien końcówki. Po zakończeniu wymazywania tekstura warstwy śródbłonka powinna wydawać się nieco gładsza niż wcześniej.
6. Zebrać zawiesinę komórkową/kolagenazę i przenieść do nowej sterylnej probówki 15mL. Na etykiecie zaznaczyć specyficzność strony (płatki z tej samej zastawki mogą być łączone).
7. Przenieść płatki do nowej szalki hodowlanej w taki sposób, aby teraz odsłonięta była strona ventricularis, i powtórzyć kroki (5.3-5.6).
8. Po zebraniu całej zawiesiny komórkowej/kolagenazy, wirować probówki przy 1000 rpm przez 5 minut, abyt stworzyć osad z wyizolowanych komórek, a następnie odessać nadsącz. Jeśli izolowane są również komórki śródmiąższowe, przeprowadzić ten protokół podczas wirowania tych komórek.
9. Dodać 3 mL pożywki śródbłonkowej dla świń do probówek, odwirować po raz drugi i odessać pożywkę. To drugie wirowanie pomaga odfiltrować część niepożądanych materiałów, takich jak włókna z końcówki wymazu.
10. Resuspender odwirowane komórki śródbłonkowe w 5 mL pożywki śródbłonkowej dla świń i wysiać komórki do wcześniej powleczonej kolagenem kolby T-25 (użyć 1 kolby na probówkę do wirowania).
11. Pozostawić komórki do wzrostu przez co najmniej 2-3 dni przed zmianą pożywki śródbłonkowej. Pomaga to komórkom zregenerować się i podzielić, ponieważ proces izolacji jest dość inwazyjny. Jeśli wydajność jest bardzo niska, rozważyć przeniesienie komórek do mniejszej kolby lub płytki wielodołkowej, ponieważ adhezja międzykomórkowa sprzyja wzrostowi komórek. Pamiętać o pasażowaniu w pobliżu konfluencji, ponieważ inhibicja kontaktowa może prowadzić do transformacji komórek.

6. Izolacja komórek śródmiąższowych

1. Napełnić sterylną probówkę wirówkową o pojemności 15 mL ilością 10 mL roztworu kolagenazy na jedną zastawkę (3 płatki).
2. Po pobraniu wymazu komórek śródbłonka z płatków, należy niezwłocznie umieścić je w odpowiedniej probówce 15 mL z roztworem kolagenazy.
3. Inkubować przez około 12 do 18 godzin (w razie potrzeby delikatnie mieszać).
4. Delikatnie wymieszać zdegradowaną tkankę za pomocą pipety serologicznej, aż zawiesina komórkowa/kolagenaza stanie się homogeniczna. Homogenizacja ta pomaga rozbić tkankę i uwolnić komórki śródmiąższowe.
5. Wirować strawioną tkankę przez 5 minut przy 1000 rpm, a następnie odessać nadsącz.
6. Dodać 5 mL pożywki dla śródmiąższowych komórek świni do probówek 15 mL, odwirować drugi raz i odessać nadsącz.
7. Resuspendować odwirowane komórki śródbłonka w 5 mL pożywki dla śródmiąższowych komórek świni i wysiać komórki do kolby T-75 (stosować 1 kolbę na probówkę wirówkową).
8. Pozostawić komórki do wzrostu na co najmniej 1-2 dni przed wymianą pożywki dla komórek śródmiąższowych. Wystąpi znacznie więcej resztek tkankowych niż w przypadku komórek śródbłonka, co jest zjawiskiem oczekiwanym. Komórki powinny również szybciej osiągnąć konfluencję niż komórki śródbłonka ze względu na wydajność komórkową oraz ich naturę.

7. Reprezentatywne obrazy

Rysunek 1. Morfologia wyizolowanych komórek w 2-3 dni po izolacji. (A) Komórki VEC wykazują typową morfologię śródbłonka i tworzą skupiska w celu promowania wzrostu. (B) Morfologia komórek VIC jest podobna do Miofibroblastów, które są zazwyczaj wrzecionowate i równomiernie rozprzestrzenione w kolbie.

Rysunek 2. Morfologia wyizolowanych komórek po osiągnięciu konfluencji. (A) VEC wykazują typową morfologię endotelialną, charakteryzującą się wyglądem przypominającym brukowanie oraz hamowaniem wzrostu w kontakcie. (B) Morfologia VIC jest podobna do miofibroblastów, które mają zazwyczaj kształt wrzecionowaty i nie wykazują hamowania wzrostu w kontakcie.

Rysunek 3. Charakterystyka funkcjonalna wyizolowanych komórek⁶. (A) Komórki VEC charakteryzują się wysokim poziomem wychwytu acetylowanego LDL (kolor czerwony). (B) Komórki VIC charakteryzują się niskim poziomem wychwytu acetylowanego LDL.

Rysunek 4. Markery komórkowe wyizolowanych komórek ⁶. (A) Fenotyp VEC potwierdzono poprzez pozytywne barwienie na czynnik Von Willebranda (zielony), niebieski (jądra komórkowe). (B) Fenotyp VIC potwierdzono poprzez negatywne barwienie na czynnik Von Willebranda.

Rysunek 5. Markery komórkowe wyizolowanych komórek. (A) Fenotyp VEC potwierdzono poprzez ujemne barwienie na alpha SMA (zielony), niebieski (jądra). (B) Fenotyp VIC potwierdzono poprzez dodatnie barwienie na alpha SMA.

Środek dysocjujący	Technika dysocjacji	Zbiór komórek	Ilość komórek	Czystość komórek	Zanieczyszczenie
EDTA (3mM) bez CaCl2	5, 20, 60 min. przed dodaniem CaCl2	20, 60, 120 min. przed zbiorem	-	+/-	+++
EDTA (6mM) bez CaCl2	5, 20, 60 min. przed dodaniem CaCl2	20, 60, 120 min. przed zbiorem	+/-	+	+++
Trypsyna-EDTA (0,5 g/L)	5, 10, 15 min. przed dezaktywacją	Medium zebrane natychmiast	+	+	++
Kolagenaza II (300 U/ mL)	5, 10, 15 min. przed dezaktywacją	Medium zebrane natychmiast	-, +, ++	-, ++, +	+
Kolagenaza II (600 U/ mL)	5, 10, 15 min. przed dezaktywacją	Medium zebrane natychmiast	+, ++, + ++	++, ++, -	-

Tabela 1. Wyniki wstępnych protokołów izolacji komórek śródbłonka zastawek.

Dyskusja

Zrozumienie biologii zastawek było utrudnione ze względu na problemy techniczne związane z izolacją i hodowlą czystych populacji komórek śródbłonka zastawek. Typowe techniki izolacji obejmują trawienie enzymatyczne podstawowej macierzy lub chemiczną dysocjację wiązań adhezyjnych śródbłonka^2,3. Wstępne eksperymenty z izolacją oceniano jakościowo, zmieniając stosowane środki dysocjujące oraz okresy inkubacji. Wyniki tych eksperymentów wykazały, że inkubacja w EDTA (lub Trypsynie-EDTA) przez maksymalnie 60 minut ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Modyfikowane pożywka Eagle'a Dulbecco’	Mediatech, Inc.	50-103-PB
Płodowa surowica bydlęca	GIBCO, by Life Technologies	26140
Penicylina-streptomycyna	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
0.25% Trypsyna-EDTA	GIBCO, by Life Technologies	25200
Sól sodowa heparyny	Sigma-Aldrich	H4784-1G
Kolagenaza Typ 2	Worthington Biochemical	LS004176
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	21300-058
Kolagen z ogona szczura	BD Biosciences	354236
Wymazówki Critical Swabs	VWR international	89031-270
Węglan sodu	Sigma-Aldrich	55761
Kolby T25	BD Biosciences	353018
Kolby T75	BD Biosciences	353136
Płytka 24-dołkowa	Falcon BD	353047
Szkiełka 60x15 mm	VWR international	25384-092
Szkiełka szklane 60x15	VWR international	89000-310
Wosk do zatapiania w parafinie	Electron Microscopy Sciences	19304-01
Igły Precision Glide	BD Biosciences	305165
Filtry Nalgene 500 mL	VWR international	73520-985
Filtry Nalgene 1L	VWR international	73520-986
Pinceta tkankowa	Fine Science Tools	11023-15
Pinceta FSC #5	Fine Science Tools	11295-00