Izolacja komórek śródbłonka zastawek

Podsumowanie

Przedstawiamy metodę izolacji i hodowli czystych populacji komórek śródbłonka zastawek serca (VEC). Komórki VEC można izolować z obu stron cuspisu lub płatka zastawki, a bezpośrednio po tym procesie możliwe jest łatwe wyizolowanie znajdujących się pod nimi komórek śródmiąższowych (VIC).

Streszczenie

Zastawki serca odpowiadają wyłącznie za utrzymanie jednokierunkowego przepływu krwi w układzie sercowo-naczyniowym. Te cienkie, włókniste tkanki są poddawane znacznym naprężeniom mechanicznym, otwierając się i zamykając kilka miliardów razy w ciągu całego życia. Niezwykła wytrzymałość tych tkanek wynika z obecności komórek śródbłonka zastawkowego (VEC) oraz komórek śródmiąższowych (VIC), które nieustannie naprawiają i przebudowują tkankę w odpowiedzi na lokalne sygnały mechaniczne i biologiczne. Dopiero niedawno zaczęliśmy rozumieć wyjątkowe zachowania tych komórek, w czym kluczową rolę odegrały eksperymenty in vitro. Szczególnie wymagająca jest izolacja i hodowla VEC. Szczególnej ostrożności należy zachować od momentu pobrania tkanki z organizmu gospodarza aż po końcowe wysianie komórek. Przedstawiamy tutaj protokoły bezpośredniej izolacji, izolacji specyficznej dla strony, hodowli oraz weryfikacji czystych populacji VEC. Stosujemy trawienie enzymatyczne, po którym następuje delikatna technika zdrapywania wymazem w celu oddzielenia wyłącznie komórek powierzchniowych. Komórki te są następnie zbierane do probówki i wirowane do postaci osadu. Osad jest następnie resuspendowany i wysiewany do kolb hodowlanych uprzednio pokrytych macierzą kolagenu I. Fenotyp VEC potwierdza się poprzez wzrost z hamowaniem kontaktowym oraz ekspresję markerów specyficznych dla śródbłonka, takich jak PECAM1 (CD31), czynnik von Willebranda (vWF), a także brak ekspresji alfa-aktyny mięśni gładkich (α-SMA). Funkcjonalne właściwości VEC wiążą się z wysokimi poziomami acetylowanego LDL. W przeciwieństwie do komórek śródbłonka naczyniowego, VEC mają unikalną zdolność do transformacji w mezenchymę, co normalnie zachodzi podczas embrionalnego tworzenia się zastawki¹. Może to również wystąpić podczas znacznie przedłużonej hodowli in vitro po osiągnięciu konfluencji, dlatego należy dbać o pasażowanie komórek w momencie osiągnięcia lub w pobliżu konfluencji. Po izolacji VEC można łatwo uzyskać czyste populacje VIC.

Protokół

1. Przygotowanie

1. Autoklawować w przykrytej kuwecie następujące elementy:
   1. Pinceta chirurgiczna z ząbkami – do manipulowania tkanką płatka
   2. Nożyczki chirurgiczne (8 cm) – do przycinania tkanki płatka i kuspisów
   3. Patyczki bawełniane – do izolowania warstwy śródbłonka z płatka lub kuspisa
2. Przygotować sterylny roztwór kolagenazy
   1. Dodać 4,0 g proszku DMEM do 250 mL wody 18 MΩ.
   2. Dodać 1,11 g wodorowęglanu sodu.
   3. Dodać 180 000 jednostek kolagenazy (600 U/mL).
   4. Dodać 1% (3 mL) Penicyliny/Streptomycyny.
   5. Dostosować pH roztworu do 7,2.
   6. Dopełnić roztwór do objętości 270 mL.
   7. Zsterylizować roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,2 μm.
   8. Dodać 10% (30 mL) sterylnej płodowej surowicy bydlęcej.
3. Przygotować sterylne pożywkę dla komórek śródbłonka
   1. Dodać 6,7 g proszku DMEM do 400 mL wody 18 MΩ.
   2. Dodać 1,85 g wodorowęglanu sodu.
   3. Dodać 25 000 jednostek heparyny (50 U/mL).
   4. Dodać 1% (5 mL) Penicyliny/Streptomycyny.
   5. Dostosować pH roztworu do 7,2.
   6. Dopełnić roztwór do objętości 450 mL.
   7. Zsterylizować roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,2 μm.
   8. Dodać 10% (50 mL) sterylnej płodowej surowicy bydlęcej.
4. Przygotować sterylną pożywkę dla komórek śródmiąższowych
   1. Dodać 13,37 g proszku DMEM do 800 mL wody 18 MΩ.
   2. Dodać 3,7 g wodorowęglanu sodu.
   3. Dodać 1% (10 mL) Penicyliny/Streptomycyny.
   4. Dostosować pH roztworu do 7,2.
   5. Dopełnić roztwór do objętości 900 mL.
   6. Zsterylizować roztwór, przepuszczając go przez filtr 0,2 μm.
   7. Dodać 10% (100 mL) sterylnej surowicy bydlęcej.

2. Izolacja płatków zastawek serca

1. Natychmiast po uśmierceniu zwierzęcia aseptycznie wyciąć pierścień aorty.
2. Dokładnie wypłukać krew z pierścienia aorty zimnym, sterylnym DPBS. Niezbędne jest jak najszybsze usunięcie wszystkich składników krwi, aby ograniczyć obumieranie VEC oraz kontaminację bakteryjną. Na tym etapie nie zaleca się stosowania antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych, ponieważ mogą one być szkodliwe dla VEC.
3. Wyizolować płatki zastawki (3 na zastawkę) bezpośrednio z pierścienia i umieścić je w sterylnej probówce stożkowej o pojemności 15 mL wypełnionej 12 mL zimnego DPBS. Kilkukrotnie wstrząsnąć, aby usunąć zanieczyszczenia, a następnie wymienić DPBS na świeży.
4. Przetransportować próbkę do laboratorium w lodzie.
5. Po przybyciu do laboratorium umieścić pojemnik z tkanką pod sterylnym dygestorium.

3. Izolacja warstwy śródbłonka

1. Napełnij sterylną szalkę 35 mm 3 mL zimnego roztworu kolagenazy na każdą zastawkę (3 płatki).
2. Przenieś wszystkie trzy płatki z probówki 15 mL do szalki wypełnionej roztworem kolagenazy.
3. Inkubuj tkankę przez 5-10 minut w temperaturze 37°C.
4. Delikatnie usuń warstwę śródbłonka, obracając suchym sterylnym wymazem po powierzchni płatka. Kierunek obrotu i siła przyłożonego ścinania są kluczowe dla czystości próbki. Obrót wymazu powinien odbywać się w kierunku przeciwnym do liniowego ruchu ręki, co wytworzy kontrolowane ścinanie. To ścinanie powoduje oddzielenie komórek śródbłonka od tkanki. Siła nacisku powinna być wystarczająca, aby poczuć opór tkanki, ale nie może przebić błony podstawnej.
5. Okazjonalnie dotykaj wymazem roztworu kolagenazy, aby uwolnić komórki z włókien końcówki. Po zakończeniu pobierania wymazem struktura warstwy śródbłonka powinna być nieco gładsza niż wcześniej.
6. Zbierz zawiesinę komórkową/kolagenazę i przenieś ją do nowej sterylnej probówki 15 mL.
7. Wiruj probówki przy 1000 rpm przez 5 minut, aby osadzić wyizolowane komórki, a następnie odessij nadosad. Jeśli izolujesz również komórki śródmiąższowe, wykonaj ten protokół w czasie wirowania tych komórek.
8. Dodaj 3 mL pożywki dla śródbłonka świni do probówek 15 mL, wiruj po raz drugi i odessij pożywkę. To drugie wirowanie pomaga odfiltrować część niepożądanych materiałów, takich jak włókna z końcówki wymazu.
9. Resuspenduj odwirowane komórki śródbłonka w 5 mL pożywki dla śródbłonka świni i wysiej komórki do wcześniej pokrytego kolagenem)): flaska T-25 (użyj jednej flaski na każdą probówkę do wirowania).
10. Pozostaw komórki do wzrostu przez co najmniej 2-3 dni przed wymianą pożywki dla śródbłonka. Pomaga to komórkom w regeneracji i podziałach, ponieważ proces izolacji jest dość obciążający, a wydajność komórkowa może być niska. Krytyczne jest pasażowanie komórek w pobliżu konfluencji, ponieważ inhibicja kontaktowa mogłaby doprowadzić do transformacji komórek.

4. Przygotowanie 60 mm szalki hodowlanej do izolacji specyficznej dla strony

1. Wyłóż szklane szalki Petriego o średnicy 60 mm folią aluminiową (2 szalki na jeden ulotkowy fragment tkanki). Folia aluminiowa ułatwia usunięcie parafiny, dzięki czemu szklana szalka Petriego może zostać ponownie wykorzystana do innych izolacji.
2. Napełnić naczynia kuleczkami parafinowymi do około połowy ich wysokości, a następnie przykryć przed autoklawowaniem.
3. Po zakończeniu autoklawowania i roztopieniu parafiny należy przenieść zestaw z szalką na chłodną, płaską powierzchnię. W miarę stygnięcia parafina stężeje, tworząc warstwę umożliwiającą nakłuwanie igłą.
4. Po 30 minutach wysterylizowana szalka może zostać użyta jako komora izolacyjna do unieruchomienia tkanki liścika.

5. Izolacja specyficznej dla strony warstwy śródbłonka

1. Wyjąć płatki z probówek 15 mL i umieścić je na przygotowanej szalce hodowlanej 60 mm w celu izolacji specyficznej dla danej strony.
2. Ułożyć płatek tak, aby strona ventricularis była skierowana w dół, przylegając do powierzchni parafiny, pozostawiając stronę fibrosa odsłoniętą. Przymocować brzegi płatka szpilkami, aby odsłonić warstwę śródbłonka.
3. Nanieść kilka kropli zimnej kolagenazy na każdą (skierowaną ku górze) powierzchnię śródbłonka i inkubować tkankę przez 5-10 minut w temperaturze 37°C.
4. Podobnie jak poprzednio, delikatnie usunąć warstwę śródbłonka, obracając suchym, sterylnym wymazem po powierzchni płatka. Kierunek obrotu i siła przyłożonego ścinania są kluczowe dla czystości próbki. Obrót wymazu powinien odbywać się w kierunku przeciwnym do liniowego ruchu ręki, co wytworzy kontrolowane ścinanie. Właśnie to ścinanie oddziela komórki śródbłonka od tkanki i nic innego. Przyłożona siła powinna być wystarczająca, aby wyczuć opór tkanki, ale nie może doprowadzić do penetracji tkanki.
5. Okazjonalnie dotykać wymazem roztworu kolagenazy, aby uwolnić komórki z włókien końcówki. Po zakończeniu wymazu tekstura warstwy śródbłonka powinna wydawać się nieco gładsza niż wcześniej.
6. Zebrać zawiesinę komórkową/kolagenazę i przenieść ją do nowej sterylnej probówki 15 mL. Oznaczyć na etykiecie specyficzność strony (płatki z tej samej zastawki można łączyć).
7. Przenieść płatki do nowej szalki hodowlanej tak, aby tym razem odsłonięta była strona ventricularis, i powtórzyć kroki (5.3-5.6).
8. Po zebraniu całej zawiesiny komórkowej/kolagenazy, odwirować probówki przy 1000 rpm przez 5 minut w celu osadzenia wyizolowanych komórek i odessać nadsącz. Jeśli izolowane są również komórki śródmiąższowe, przeprowadzić ten protokół podczas wirowania tych komórek.
9. Dodać 3 mL pożywki dla śródbłonka świńskiego do probówek, odwirować po raz drugi i odessać pożywkę. To drugie wirowanie pomaga odfiltrować część niepożądanych materiałów, takich jak włókna z końcówki wymazu.
10. Resuspendować odwirowane komórki śródbłonka w 5 mL pożywki dla śródbłonka świńskiego i wysiać komórki do uprzednio powleczonej kolagenem kolby T-25 (użyć 1 kolby na probówkę z wirówki).
11. Pozostawić komórki do wzrostu przez co najmniej 2-3 dni przed wymianą pożywki dla śródbłonka. Pomaga to komórkom zregenerować się i dzielić, ponieważ proces izolacji jest dość agresywny. Jeśli zauważy się bardzo niską wydajność, należy rozważyć przeniesienie do mniejszej kolby lub płytki wielodołkowej, ponieważ adhezja międzykomórkowa sprzyja wzrostowi komórek. Pamiętać o pasażowaniu w pobliżu konfluencji, ponieważ inhibicja kontaktowa może prowadzić do transformacji komórek.

6. Izolacja komórek śródmiąższowych

1. Napełnij sterylną probówkę wirówkową o pojemności 15 mL ilością 10 mL roztworu kolagenazy na jedną zastawkę (3 płatki).
2. Po pobraniu wymazu komórek śródbłonka z płatków, umieść je natychmiast w odpowiedniej probówce 15 mL z roztworem kolagenazy.
3. Inkubuj przez około 12 do 18 godzin (w razie potrzeby delikatnie mieszaj).
4. Delikatnie wymieszaj zdegradowaną tkankę za pomocą pipety serologicznej, aż zawiesina komórkowa/kolagenaza stanie się jednorodna. Homogenizacja ta pomaga rozbić tkankę i uwolnić komórki śródmiąższowe.
5. Wirował strawioną tkankę przez 5 minut przy 1000 rpm, a następnie odessaj nadsącz.
6. Dodaj 5 mL pożywki dla komórek śródmiąższowych świni do probówek 15 mL, odwirowuj po raz drugi i odessaj nadsącz.
7. Resuspenduj odwirowane komórki śródbłonka w 5 mL pożywki dla komórek śródmiąższowych świni i wysiej komórki do kolby T-75 (użyj 1 kolby na każdą probówkę wirówkową).
8. Pozostaw komórki do wzrostu na co najmniej 1-2 dni przed wymianą pożywki dla komórek śródmiąższowych. Będzie obecne znacznie więcej resztek tkankowych niż w przypadku komórek śródbłonka, co jest zjawiskiem oczekiwanym. Komórki powinny również szybciej osiągnąć konfluencję niż komórki śródbłonka ze względu na wydajność komórkową oraz ich naturę.

7. Reprezentatywne obrazy

Rycina 1. Morfologia izolowanych komórek 2-3 dni po izolacji. (A) VEC wykazują typową morfologię śródbłonka i tworzą skupiska, aby wspomóc wzrost. (B) Morfologia VIC jest podobna do miofibroblastów, które mają zazwyczaj kształt wrzecionowaty i są równomiernie rozłożone w całej kolbie.

Rysunek 2. Morfologia wyizolowanych komórek przy pełnej konfluencji. (A) VEC wykazują typową morfologię endotelialną, mając zazwyczaj strukturę przypominającą bruk i wykazując hamowanie wzrostu w kontakcie. (B) Morfologia VIC jest podobna do miofibroblastów, które mają zazwyczaj kształt wrzecionowaty i nie wykazują hamowania wzrostu w kontakcie.

Rycina 3. Charakterystyka funkcjonalna wyizolowanych komórek⁶. (A) VEC charakteryzują się wysokim poziomem wychwytu acetylowanego LDL (kolor czerwony). (B) VIC charakteryzują się niskim poziomem wychwytu acetylowanego LDL.

Rysunek 4. Markery komórkowe wyizolowanych komórek ⁶. (A) Fenotyp VEC potwierdzono poprzez pozytywne barwienie na czynnik Von Willebranda (zielony), niebieski (jądra). (B) Fenotyp VIC potwierdzono poprzez negatywne barwienie na czynnik Von Willebranda.

Rycina 5. Markery komórkowe wyizolowanych komórek. (A) Fenotyp VEC potwierdzony ujemnym barwieniem na alpha SMA (zielony), niebieski (jądra). (B) Fenotyp VIC potwierdzony dodatnim barwieniem na alpha SMA.

Środek dysocjujący	Technika dysocjacji	Pozyskiwanie komórek	Liczba komórek	Komórka Czystość	Zanieczyszczenie
EDTA (3 mM) bez CaCl22	5, 20, 60 min. przed CaCl22 dodawanie	20, 60, 120 min przed pobraniem	-	+/-	+++
EDTA (6mM) bez CaCl22	5, 20, 60 min. przed CaCl22 dodawanie	20, 60, 120 min przed pobraniem	+/-	+	+++
Trypsyna-EDTA (0,5 g/L)	5, 10, 15 min. przed dezaktywacją	Pożywka zebrana niezwłocznie	+	+	++
Kolagenaza II (300 U/ml)	5, 10, 15 min. przed dezaktywacją	Pożywka zebrana natychmiast	-, +, ++	-, ++, +	+
Kolagenaza II (600 U/ml)	5, 10, 15 min. przed dezaktywacją	Medium pobrane natychmiast	+, ++, + ++	++, ++, -	-

Tabela 1. Wyniki wstępnych protokołów izolacji komórek śródbłonka zastawkowego.

Dyskusja

Zrozumienie biologii zastawek było utrudnione ze względu na problemy techniczne związane z izolacją i hodowlą czystych populacji komórek śródbłonka zastawek. Typowe techniki izolacji obejmują trawienie enzymatyczne podstawowej macierzy lub chemiczną dysocjację wiązań adhezyjnych śródbłonka^2,3. Wstępne eksperymenty z izolacją oceniano jakościowo, zmieniając stosowane środki dysocjujące oraz okresy inkubacji. Wyniki tych eksperymentów wykazały, że inkubacja w EDTA (lub Trypsynie-EDTA) przez maksymalnie 60 minut ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Modyfikowane pożywka Eagle'a Dulbecco’	Mediatech, Inc.	50-103-PB
Płodowa surowica bydlęca	GIBCO, by Life Technologies	26140
Penicylina-streptomycyna	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
0.25% Trypsyna-EDTA	GIBCO, by Life Technologies	25200
Sól sodowa heparyny	Sigma-Aldrich	H4784-1G
Kolagenaza Typ 2	Worthington Biochemical	LS004176
DPBS	GIBCO, by Life Technologies	21300-058
Kolagen z ogona szczura	BD Biosciences	354236
Wymazówki Critical Swabs	VWR international	89031-270
Węglan sodu	Sigma-Aldrich	55761
Kolby T25	BD Biosciences	353018
Kolby T75	BD Biosciences	353136
Płytka 24-dołkowa	Falcon BD	353047
Szkiełka 60x15 mm	VWR international	25384-092
Szkiełka szklane 60x15	VWR international	89000-310
Wosk do zatapiania w parafinie	Electron Microscopy Sciences	19304-01
Igły Precision Glide	BD Biosciences	305165
Filtry Nalgene 500 mL	VWR international	73520-985
Filtry Nalgene 1L	VWR international	73520-986
Pinceta tkankowa	Fine Science Tools	11023-15
Pinceta FSC #5	Fine Science Tools	11295-00