Szacowanie szybkości produkcji wirusów w systemach wodnych

Podsumowanie

Szybkość wymiany wirusów w systemach morskich i słodkowodnych można oszacować za pomocą techniki redukcji i ponownego pojawienia się. Uzyskane dane pozwalają badaczom wywnioskować tempo śmiertelności mikroorganizmów indukowanej przez wirusy w systemach wodnych.

Streszczenie

Wirusy są powszechnymi składnikami systemów morskich i słodkowodnych i wiadomo, że stanowią istotne czynniki śmiertelności drobnoustrojów. Opracowanie ilościowych szacunków tego procesu jest kluczowe, ponieważ pozwala na tworzenie lepszych modeli struktury i funkcji społeczności drobnoustrojów, a także na poszerzenie wiedzy o tym, w jaki sposób wirusy modyfikują wodne cykle biogeochemiczne. Technika redukcji wirusów pozwala badaczom oszacować tempo uwalniania cząstek wirusowych z endemicznej społeczności drobnoustrojów. W skrócie, liczba wolnych (zewnątrzkomórkowych) wirusów w próbce jest redukowana, podczas gdy społeczność drobnoustrojów jest utrzymywana w stężeniu zbliżonym do otoczenia. Następnie społeczność drobnoustrojów jest inkubowana w nieobecności wolnych wirusów, a tempo ponownego pojawiania się wirusów w próbce (poprzez lizę już zainfekowanych członków społeczności) można określić za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub, w przypadku specyficznych wirusów, za pomocą ilościowej PCR. Wartości te mogą być następnie wykorzystane do oszacowania tempa śmiertelności drobnoustrojów wynikającej z indukowanej przez wirusy lizy komórkowej.

Protokół

1. Ultrafiltracja wody morskiej w celu uzyskania wody „wolnej od wirusów” (Wilhelm & Poorvin 2001)

1. Pobiera się około 20 L wody morskiej lub jeziornej, zachowując maksymalną możliwą aseptykę.
2. Wodę poddaje się wstępnej filtracji seryjnej przez filtry poliwęglanowe o średnicy 142 mm i wielkości porów 0.8 μm, które można przechowywać w temperaturze -20 °C do analizy konsorcjum mikroorganizmów. W przypadku układów o bardzo wysokiej produktywności przed tym krokiem można zastosować filtry o większej wielkości porów.
3. W celu uzyskania wody ultrafiltrowanej z systemu Amicon M12 (Millipore) stosuje się spiralny wkład z progiem odcięcia 30 kDa, aby usunąć wszystkie wirusy, w tym małe wirusy RNA.
4. Próbki są przetwarzane i zagęszczane przy prędkości ~ 25% i ciśnieniu wstecznym ~ 15-16 kPa.
5. Pozostała próbka o objętości ~ 500 mL wody będzie zawierać zagęszczone konsorcjum wirusów (które można zachować do innych doświadczeń), natomiast pozostałe 19,5 L wody wolnej od wirusów zostanie wykorzystane do testów produkcji wirusowej.
6. Po każdym dniu użytkowania system Amicon M12 musi zostać wyczyszczony, aby zapobiec uszkodzeniu membrany wkładu filtrującego.
7. W przypadku pracy z wodą morską membranę należy wypłukać co najmniej 6 L wody Milli-Q, a następnie przemyć roztworem 0.1N NaOH przez 30-45 minut.
8. Wkład należy ponownie wypłukać co najmniej 6 L wody Milli-Q.
9. Po zakończeniu pracy z systemem M12 wkład spiralny należy przechowywać w roztworze 0.05M H₃PO₄ w temperaturze 4°C.

2. Metoda redukcji wirusa w celu produkcji wirusowej (Wilhelm et al. 2002)

1. Pobiera się do 500 mL próbki wody morskiej / jeziornej zawierającej zarówno gospodarzy, jak i wirusy, a następnie umieszcza ją w jednostce sterifiltru z nałożonym filtrem o nominalnej wielkości porów 0,2-μm o niskim stopniu wiązania białek (np. Durapore).
2. Próbkę poddaje się delikatnemu podciśnieniu próżniowemu <200 mmHg, stale resuspendując ją za pomocą sterylnej pipety transferowej, aby zapobiec koncentracji komórek bakteryjnych na filtrze.
3. Do zawiesiny bakteryjnej powoli dodaje się trzy objętości ultrafiltratu, aby znacząco zredukować liczbę wolnych wirusów w próbce.
4. Frakcję bakteryjną rozcieńcza się z powrotem do 500 mL wodą wolną od wirusów, a następnie dzieli na trzy powtórzenia po 150 mL każde i umieszcza w przezroczystych poliwęglanowych butelkach o pojemności 250ml.

3. Metoda filtracji przepływu stycznego (TFF) w produkcji wirusowej (Weinbauer et al. 2002, Winget et al. 2005)

TFF stanowi alternatywne podejście do metody redukcji wirusów.

1. Zgodnie z powyższym opisem pobiera się około 500 mL naturalnej próbki.
2. Próbkę tę zagęszcza się przy użyciu systemu filtracji przepływowej stycznej o nominalnej wielkości porów 0,2-μm.
3. Gdy frakcja bakteryjna zostanie zredukowana do około 10-15 mL, dodaje się ultrafiltrowaną wodę wolną od wirusów i rozdziela ją w sposób opisany powyżej.
4. Powielone butelki inkubuje się w warunkach in situ w komorach środowiskowych.
   1. Poziom oświetlenia dostosowuje się do warunków powierzchniowych, stosując niebieski akryl lub przezroczysty akryl z siatką cieniującą w celu zmniejszenia natężenia światła.
   2. Temperatury powierzchniowe otoczenia często uzyskuje się za pomocą pokładowego inkubatora z przepływem wody morskiej.
5. Próbki do szacowania liczebności bakterii i wirusów pobiera się w czasie 0, dodając do krioproletek sterylny glutaraldehyd o stężeniu końcowym 2,0-2,5%. Próbki te są natychmiast zamrażane szokowo w ciekłym azocie i przechowywane w zamrożeniu do czasu przetworzenia.
   1. W przypadku braku dostępności ciekłego azotu można natychmiast przygotować i przetworzyć preparaty na szkiełkach mikroskopowych (patrz procedura poniżej)
6. Podpróbki pobiera się co 2,5 godziny przez co najmniej 10 godzin metodą opisaną powyżej.
   1. W tym czasie można pobrać wodę do analizy ilościowej PCR. Do krioproletki bez środka utrwalającego można dodać do 5 mL próbki, a następnie natychmiast zamrozić ją szokowo w ciekłym azocie.

4. Mikroskopia produkcji wirusowej (Noble & Fuhrman 1998, Wen et al. 2004)

1. Zamrożone próbki przeznaczone do filtracji przez membranę 0,02 μm w celu przeprowadzenia mikroskopii należy rozmrozić na lodzie.
2. Należy przygotować roztwór zapasowy SYBR Green poprzez rozcieńczenie roztworu zapasowego w sterylnej wodzie w stosunku 1:10. Następnie, z roztworu zapasowego, należy przygotować roztwór roboczy, dodając 1 mL roztworu zapasowego do 39 mL sterylnej wody. Przed rozpoczęciem należy również przygotować roztwór 50% glicerolu i 50% fosforanowego buforu solnego (PBS, 0,05 M Na₂HPO₄, 0,85% NaCl, pH 7,5) oraz świeży, 2,5% roztwór zapasowy p-fenylenodiaminy. Roztwór 50% glicerolu/50% PBS należy przechowywać w temperaturze 4°C, a roztwór zapasowy p-fenylenodiaminy w temperaturze -20°C w ciemności do momentu rozpoczęcia pracy. Bezpośrednio przed filtracją należy dodać p-fenylenodiaminę do roztworu 50% glicerolu/50% PBS do stężenia końcowego 0,1%, aby uzyskać roztwór Antifade.
3. Na wierzchu filtra podkładowego z celulozy MicronStep 0,45 μm należy umieścić filtr Anodisc 25 mm 0,02 μm. Na wierzch Anodiscu należy nanieść 850 μL utrwalonej próbki i poddać działaniu próżni przy 20 pKa aż do całkowitego wyschnięcia. Do sterylnej szalki Petriego należy nalać 100 μL roboczego roztworu SYBR Green, a następnie, przy wciąż włączonej próżni, ostrożnie zdjąć Anodisc z wieży filtracyjnej i położyć go na SYBR Green. Próbki należy inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Ostrożnie należy zdjąć filtr z roztworu SYBR Green i osuszyć tył filtra chusteczką Kimwipe, aby usunąć cały pozostały barwnik. W razie potrzeby filtr można ponownie umieścić w wieży i przepuścić przez niego do 800 μL wody filtrowanej przez membranę 0,02 μm lub sterylnego medium, aby wypłukać nadmiar barwnika.
4. Na szkiełko mikroskopowe należy nanieść małą kroplę roztworu antifade i nałożyć na wierzch szkiełko nakrywkowe. Należy zdjąć szkiełko nakrywkowe i przyłożyć wysuszony filtr do szkiełka mikroskopowego zwilżonego roztworem antifade. Ponownie należy nanieść niewielką ilość roztworu antifade na szkiełko nakrywkowe i powoli położyć je na filtrze, upewniając się, że usunięto wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogły powstać.
5. Szkiełka należy niezwłocznie zamrozić w temperaturze -20° C do czasu użycia (należy ich użyć w ciągu kilku miesięcy, aby zapobiec blaknięciu i spadkowi liczby wirusów).
6. Wirusy są zliczane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (w naszym przypadku mikroskop Leica DMRXA) z szerokim zestawem filtrów niebieskich (λ_Ex= 450 do 490 nm, λ_Em= 510 nm z filtrem tłumiącym przy λ= 510 nm). Dla każdego filtra zostanie przeliczone co najmniej 20 pól widzenia, przy czym należy ilość wszystkich wirusów z każdej siatki pól, aby zapewnić równomierny rozkład wirusów na membranie filtra.
7. Następnie oblicza się średnie wskaźniki powstawania wirusów z trzech niezależnych powtórzeń i wyznacza odchylenie standardowe z szybkości produkcji.

5. Reprezentatywne wyniki

Surowe dane zebrane przez badacza wymagają minimalnego przetwarzania matematycznego w celu wyznaczenia wskaźników powtarzalności liczebności wirusów. Głównym zbiorem danych wynikającym z niniejszego badania są wskaźniki powtarzalności liczebności wirusów w podpróbkach z inkubacji. Wyniki te stanowią niezależne regresje liczebności wirusów w funkcji czasu dla każdej z próbek. Dla każdej próbki poszczególne inkubacje traktowane są jako jedna seria pomiarowa, zatem poprzez przeprowadzenie trzech inkubacji powtórzonych badacz może obliczyć wskaźniki oraz oszacować wariancję (np. odchylenie standardowe) (patrz Rysunek 1).

Jednym zastrzeżeniem dotyczącym tego procesu jest fakt, że zmniejszenie liczebności wirusów nieuchronnie prowadzi do redukcji liczby komórek gospodarza w próbce, które przenoszą ładunek wirusowy. Aby zrekompensować tę stratę, konieczne jest określenie liczebności bakterii zarówno w materiale źródłowym (niefiltrowanej wodzie morskiej lub jeziornej), jak i w próbce inkubacyjnej dla T = 0. Informacje te można wykorzystać do obliczenia procentowej utraty komórek: przyjmując, że proces redukcji liczebności wirusów nie jest selektywny względem żadnych członków społeczności mikrobiologicznej, czynnik ten można następnie wykorzystać do oszacowania tempa produkcji wirusów in situ.

Rysunek 1. Produkcja cząstek wirusopodobnych podczas 10-godzinnej inkubacji w warunkach in situ z wykorzystaniem mikroskopii epifluorescencyjnej. Próbki pobrano podczas zakwitu fitoplanktonu u wybrzeży Nowej Zelandii we wrześniu 2008 roku.

Rycina 2. Schemat przebiegu procesu badania produkcji wirusów. Proces rozpoczyna się od ultrafiltracji próbek wody w celu uzyskania wody wolnej od wirusów. Jest to realizowane przy użyciu systemu ultrafiltracji. Równolegle z tego samego miejsca pobierane są próbki wody; wolne wirusy przechodzą przez filtr, podczas gdy społeczność drobnoustrojów (zawierająca mieszankę komórek zainfekowanych i niezinfekowanych) zostaje zatrzymana. Następnie społeczność tę resuspendsuje się w wodzie wolnej od wirusów i inkubuje w warunkach in situ. Następnie monitoruje się tempo ponownego pojawiania się wirusów przez kolejne 10 godzin, aby określić tempo produkcji wirusów.

Dyskusja

Kluczowym elementem zrozumienia, w jaki sposób wirusy wpływają na morskie społeczności drobnoustrojów, jest określenie szybkości produkcji cząsteczek wirusów. Biorąc pod uwagę, że ich liczebność jest (mniej lub bardziej) statyczna w większości systemów (Wilhelm & Suttle 1999, Weinbauer 2004), a wirusy są szybko usuwane lub tracą zdolność infekowania w systemach wodnych (Wilhelm et al. 1998), tempo produkcji musi być względnie wysokie, aby zastąpić utracone cząsteczki.

Szacowanie śmiertelności mikrobów wywołanej przez wirusy w obrębie społeczności mikrobiologicznej wymaga wiedzy o tym, ile wirusów powstaje podczas każdego procesu lizy komórki (tzw. „wielkość wyrzutu”, ang. burst size). Wielkość wyrzutu wirusów w próbkach naturalnych może się znacznie różnić. Można ją wyznaczyć bezpośrednio za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (np. Weinbauer & Peduzzi 1994), jednak często wykracza to poza możliwości danego laboratorium lub nie zawsze jest praktyczne. W sytuacjach, gdy nie można ich wyznaczyć empirycznie, dla systemów morskich można przyjąć wartości literaturowe wynoszące 24 wirusy na zdarzenie lityczne, a dla systemów słodkowodnych 34 (Parada et al. 2006). Jeśli tempo produkcji wirusów zostanie podzielone przez tę liczbę, wynikiem będzie liczba komórek na jednostkę objętości niszczonych przez wirusy w skali doby. Otrzymaną wartość liczby zlizowanych mikrobów można następnie podzielić przez całkowitą liczebność bakterii, co pozwoli wyznaczyć śmiertelność indukowaną przez wirusy w badanym systemie: istniejące szacunki wahają się od kilku procent do prawie całej populacji i często zależą od innych czynników w badanym systemie (Wilhelm & Matteson 2008). Aby określić procent całkowitej śmiertelności, liczbę tę często mnoży się przez dwa (przy założeniu, że 50% komórek przechodzi do reprodukcji, a 50% komórek zostaje utraconych, Weinbauer 2004).

Biorąc pod uwagę, że biodostępność składników odżywczych i pierwiastków śladowych (np. N, P, Fe) może ograniczać tempo pierwotnej produktywności, a tym samym przepływ węgla przez systemy wodne, zrozumienie roli śmiertelności mikroorganizmów indukowanej przez wirusy w tym procesie stało się przedmiotem zainteresowania geochemików morskich. Istnieje obecnie kilka szacunków sugerujących, że wirusy codziennie uwalniają do kolumny wody znaczne stężenia pierwiastków odżywczych (Rowe et al. 2008, Higgins et al. 2009) i że pierwiastki te są szybko asymilowane przez społeczność mikrobiologiczną (Poorvin et al. 2004, Mioni et al. 2005). Tempo przepływu składników odżywczych do środowiska można określić, mnożąc liczbę zniszczonych komórek przez ilość składnika odżywczego na komórkę (oznaczaną jako „kwoty”). Informacje te mogą dostarczyć kluczowego elementu do zrozumienia sposobu funkcjonowania mikrobiologicznych sieci troficznych w systemach wodnych.

Bieżące kierunki rozwoju: Obecne działania szeregu grup badawczych koncentrują się na adaptacji powyższej strategii w celu enumeracji konkretnych wirusów w obrębie społeczności, a tym samym określenia, w jaki sposób konkretne organizmy są pod wpływem aktywności wirusów. W tym celu badacze stosują ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR), aby oszacować liczebność konkretnych grup lub rodzin wirusów równolegle do szacowania całkowitej społeczności wirusów. Wyniki te są następnie bezpośrednio wykorzystywane do określenia śmiertelności wirusów, obrotu składników odżywczych itp. dla konkretnych grup planktonu. To potężne, nowe podejście pozwoli badaczom w nadchodzących latach znacznie głębiej zgłębić procesy związane z ekologią wirusów i po raz pierwszy ilościowo określić interakcje w konkretnych społecznościach wirus-gospodarz poza ograniczeniami systemów laboratoryjnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2,5% p-fenylenediamina	Acros Organics	130575000	Roztwór zapasowy do Antifade
System Amicon Proflux M12	EMD Millipore	N/A	Do tego etapu można użyć dowolnego urządzenia do ultrafiltracji
Barwnik do żeli kwasów nukleinowych SYBR Green I	Invitrogen	S-7563
Filtr Helicon S10 30kDa	EMD Millipore	CDUF010LT
Filtry Pelicon XL 0,22 μm	Fisher Scientific	PXGVPPC50
Filtry membranowe GE 0,2 μm PCTE (47 mm)	Fisher Scientific	09-732-35
System do filtracji stycznej w skali laboratoryjnej Millipore Labscale Tangential Flow Filtration System	EMD Millipore	XX42LSS11	Do tego etapu można użyć innych systemów TFF
Filtry Micronstep 0,45 μm, celulozowe, białe, gładkie (25 mm)	Fisher Scientific	E04WP02500
Filtry GE Whatman Anodisc 0,02 μm (25 mm)	Fisher Scientific	68-09-6002
Mikroskop Leica DMRXA			Można użyć dowolnego mikroskopu epifluorescencyjnego z zestawem filtrów niebieskich
Poliwęglanowe baniaki 20L	Fisher Scientific
Glicerol	Fisher Scientific	BP229-4
PBS (0,05 M Na2HPO4, 0,85% NaCl, pH 7,5)	Fisher Scientific	BP329-500, S640-500
50% Glutaraldehyd	Fisher Scientific	G151-1
Krioprobówki Corning 2 mL – polipropylenowe z gwintem zewnętrznym	Fisher Scientific	09-761-71	Można użyć dowolnych kriopróbek
Krioprobówki Corning 5 mL – polipropylenowe z gwintem zewnętrznym	Fisher Scientific	09-761-74	Można użyć dowolnych kriopróbek
85% H3PO4	Fisher Scientific	A242-212	Przechowywanie membran spiralnych
Granulki NaOH	Fisher Scientific	S318-3	Czyszczenie M12
Miarki graduowane
Filtr membranowy Isopore o rozmiarze porów 0,8-μm (142 mm)	EMD Millipore	ATTP14250
Stalowy uchwyt filtra ciśnieniowego Millipore (142 mm)	Fisher Scientific	YY30 090 00