Szacowanie szybkości produkcji wirusów w systemach wodnych

Podsumowanie

Szybkość wymiany wirusów w systemach morskich i słodkowodnych można oszacować za pomocą techniki redukcji i ponownego pojawienia się. Uzyskane dane pozwalają badaczom wywnioskować tempo śmiertelności mikroorganizmów indukowanej przez wirusy w systemach wodnych.

Streszczenie

Wirusy są powszechnymi składnikami systemów morskich i słodkowodnych i wiadomo, że stanowią istotne czynniki śmiertelności drobnoustrojów. Opracowanie ilościowych szacunków tego procesu jest kluczowe, ponieważ pozwala na tworzenie lepszych modeli struktury i funkcji społeczności drobnoustrojów, a także na poszerzenie wiedzy o tym, w jaki sposób wirusy modyfikują wodne cykle biogeochemiczne. Technika redukcji wirusów pozwala badaczom oszacować tempo uwalniania cząstek wirusowych z endemicznej społeczności drobnoustrojów. W skrócie, liczba wolnych (zewnątrzkomórkowych) wirusów w próbce jest redukowana, podczas gdy społeczność drobnoustrojów jest utrzymywana w stężeniu zbliżonym do otoczenia. Następnie społeczność drobnoustrojów jest inkubowana w nieobecności wolnych wirusów, a tempo ponownego pojawiania się wirusów w próbce (poprzez lizę już zainfekowanych członków społeczności) można określić za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub, w przypadku specyficznych wirusów, za pomocą ilościowej PCR. Wartości te mogą być następnie wykorzystane do oszacowania tempa śmiertelności drobnoustrojów wynikającej z indukowanej przez wirusy lizy komórkowej.

Protokół

1. Ultrafiltracja wody morskiej w celu otrzymania wody „wolnej od wirusów” (Wilhelm & Poorvin 2001)

1. Pobiera się około 20L wody morskiej / jeziornej, zachowując jak największą aseptykę.
2. Wodę poddaje się wstępnej filtracji seryjnej przez poliwęglanowe filtry o średnicy 142 mm i wielkości porów 0.8 μm, które można przechowywać w temperaturze -20 °C do analizy społeczności. W przypadku systemów o bardzo wysokiej produktywności przed tym krokiem można zastosować filtry o większej średnicy porów.
3. W celu uzyskania wody ultrafiltrowanej w systemie Amicon M12 (Millipore) stosuje się spiralny wkład z progiem odcięcia 30 kDa, aby wykluczyć wszystkie wirusy, w tym małe wirusy RNA.
4. Próbki są przetwarzane i zagęszczane przy prędkości ~ 25% i ciśnieniu wstecznym ~15-16 kPa.
5. Pozostała próbka o objętości ~500 mL wody będzie zawierać zagęszczoną społeczność wirusów (którą można zachować do innych eksperymentów), natomiast pozostałe 19.5 L wody wolnej od wirusów zostanie wykorzystane do testów produkcji wirusowej.
6. Po każdym dniu użytkowania system Amicon M12 musi zostać oczyszczony, aby zapobiec uszkodzeniu membrany wkładu filtra.
7. W przypadku pracy z wodą morską membranę należy przepłukać co najmniej 6L wody Milli-Q, a następnie przemyć roztworem 0.1N NaOH przez 30-45 minut.
8. Wkład należy ponownie przepłukać co najmniej 6L wody Milli-Q.
9. Po zakończeniu pracy z systemem M12 wkład spiralny należy przechowywać w roztworze 0.05M H₃PO₄ w temperaturze 4°C.

2. Metoda redukcji wirusa w produkcji wirusowej (Wilhelm et al. 2002)

1. Pobrano do 500 mL próbki wody morskiej / jeziornej zawierającej gospodarzy i wirusy, a następnie umieszczono ją w jednostce do sterylnej filtracji z filtrem o nominalnej wielkości porów 0,2-μm o niskim powinowactwie do białek (np. Durapore).
2. Próbkę poddano delikatnemu podciśnieniu w zakresie <200 mmHg, stale resuspensując zawiesinę za pomocą sterylnej pipety transferowej, aby zapobiec koncentracji komórek bakteryjnych na filtrze.
3. Do zawiesiny bakteryjnej powoli dodano trzy objętości ultrafiltratu, aby znacząco zredukować liczbę wolnych wirusów w próbce.
4. Frakcję bakteryjną rozcieńczono wodą wolną od wirusów do objętości 500 mL, a następnie podzielono na trzy powtórzenia po 150 mL każde i umieszczono w przezroczystych, poliwęglanowych butelkach o pojemności 250ml.

3. Metoda filtracji stycznej (TFF) w produkcji wirusów (Weinbauer et al. 2002, Winget et al. 2005)

TFF stanowi alternatywne podejście do metody redukcji wirusów.

1. Zgodnie z powyższym opisem pobiera się około 500 mL próbki naturalnej.
2. Próbkę tę zagęszcza się przy użyciu systemu filtracji przepływowej stycznej o nominalnej wielkości porów 0,2-μm.
3. Gdy objętość frakcji bakteryjnej zostanie zredukowana do około 10-15 mL, dodaje się ultrafiltrowaną wodę wolną od wirusów i rozdziela ją w opisany wcześniej sposób.
4. Powielone butelki inkubuje się w warunkach in situ z wykorzystaniem komór środowiskowych.
   1. Poziom oświetlenia dostosowuje się do warunków powierzchniowych, stosując niebieski akryl lub przezroczysty akryl z siatką cieniującą w celu zmniejszenia natężenia światła.
   2. Temperatury powierzchniowe otoczenia uzyskuje się często za pomocą inkubatora pokładowego z przepływem wody morskiej.
5. Próbki do szacowania liczebności bakterii i wirusów pobiera się w czasie 0, dodając do probówek kriogenicznych sterylny glutaraldehyd do stężenia końcowego 2,0-2,5%. Próbki te są natychmiast zamrażane szokowo w ciekłym azocie i przechowywane w zamrożeniu do czasu analizy.
   1. W przypadku braku dostępu do ciekłego azotu można przygotować preparaty na szkiełkach mikroskopowych i poddać je natychmiastowej obróbce (patrz procedura poniżej)
6. Podpróbki pobiera się co 2,5 godziny przez co najmniej 10 godzin metodą opisaną powyżej.
   1. W tym czasie można pobrać wodę do analizy ilościowej PCR. Do probówki kriogenicznej bez środka utrwalającego można dodać do 5 mL próbki, a następnie natychmiast zamrozić ją szokowo w ciekłym azocie.

4. Mikroskopia produkcji wirusowej (Noble & Fuhrman 1998, Wen et al. 2004)

1. Zamrożone próbki przeznaczone do filtracji przez filtr 0,02-μm przed badaniem mikroskopowym należy rozmrozić na lodzie.
2. Przygotować roztwór zapasowy SYBR Green, rozcieńczając roztwór macierzysty w stosunku 1:10 sterylną wodą. Następnie z roztworu zapasowego przygotować roztwór roboczy, dodając 1 mL roztworu zapasowego do 39 mL sterylnej wody. Przed rozpoczęciem należy również przygotować roztwory 50% glicerolu i 50% fosforanowo-buforowanej soli fizjologicznej (PBS, 0,05 M Na₂HPO₄, 0,85% NaCl, pH 7,5) oraz świeży 2,5% roztwór zapasowy p-fenylenodiaminy. Roztwór 50% glicerolu/50% PBS przechowywać w temperaturze 4°C, a roztwór zapasowy p-fenylenodiaminy w temperaturze -20°C w ciemności do momentu rozpoczęcia procedury. Bezpośrednio przed filtrowaniem dodać p-fenylenodiaminę do 50% glicerolu/50% PBS do końcowego stężenia 0,1%, aby uzyskać roztwór Antifade.
3. Umieścić filtr Anodisc 0,02-μm o średnicy 25 mm na wierzchu filtra podkładowego MicronStep 0,45-μm z celulozy. Dodać 850 μL utrwalonej próbki na wierzch filtra Anodisc i odsysać próżniowo przy 20 pKa aż do całkowitego wyschnięcia. Nalać 100 μL roboczego roztworu SYBR Green do sterylnejy szalki Petriego i, przy wciąż włączonej próżni, ostrożnie wyjąć filtr Anodisc z wieży filtracyjnej i położyć go na SYBR Green. Inkubować próbki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Ostrożnie wyjąć filtr z roztworu SYBR Green i osuszyć tył filtra chusteczką Kimwipe, aby usunąć cały pozostały barwnik. W razie potrzeby ponownie umieścić filtr w wieży i przepuścić przez niego do 800 μL wody filtrowanej przez filtr 0,02-μm lub sterylnej pożywki, aby wypłukać nadmiar barwnika.
4. Nanieść małą kroplę roztworu antifade na szkiełko przedmiotowe i położyć na niej szkiełko nakrywkowe. Zdjąć szkiełko nakrywkowe i położyć wysuszony filtr na szkiełku przedmiotowym zwilżonym roztworem antifade. Ponownie nanieść niewielką ilość roztworu antifade na szkiełko nakrywkowe i powoli położyć je na filtrze, dbając o usunięcie wszelkich pęcherzyków powietrza, które mogą powstać.
5. Natychmiast zamrozić preparaty w temperaturze -20° C do czasu użycia (należy ich użyć w ciągu kilku miesięcy, aby zapobiec blaknięciu fluorescencji i spadkowi liczby wirusów).
6. Wirusy są zliczane przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej (w naszym przypadku mikroskopu Leica DMRXA) z szerokim zestawem filtrów niebieskich (λ_Ex= 450 do 490 nm, λ_Em= 510 nm z filtrem tłumiącym przy λ= 510 nm). Dla każdego filtra należy przeliczyć co najmniej 20 pól widzenia, upewniając się, że ilościowo określono wszystkie wirusy z każdej siatki pola, aby zapewnić równomierny rozkład wirusów na membranie filtra.
7. Następnie oblicza się średnie wskaźniki ponownego wystąpienia wirusów z trzech niezależnych powtórzeń i wyznacza odchylenie standardowe dla tempa produkcji.

5. Reprezentatywne wyniki

Surowe dane zebrane przez badacza wymagają minimalnego przetwarzania matematycznego w celu wyznaczenia wskaźników powtarzalności liczebności wirusów. Głównym zbiorem danych wynikającym z niniejszego badania są wskaźniki powtarzalności liczebności wirusów w podpróbkach z inkubacji. Wyniki te stanowią niezależne regresje liczebności wirusów w funkcji czasu dla każdej z próbek. W przypadku każdej próbki poszczególne inkubacje stanowią jedną jednostkę badawczą, zatem poprzez przeprowadzenie trzech inkubacji powtórzonych badacz może obliczyć wskaźniki oraz oszacować wariancję (np. odchylenie standardowe) (patrz Rycina 1).

Jednym z zastrzeżeń dotyczącym tego procesu jest fakt, że redukcja liczebności wirusów nieuchronnie prowadzi do redukcji komórek gospodarza w próbce, które niosą ładunek wirusowy. Aby zrekompensować tę stratę, konieczne jest oznaczenie liczebności bakterii zarówno w materiale źródłowym (niefiltrowanej wodzie morskiej lub jeziornej), jak i w próbce inkubacyjnej dla T = 0. Informacje te mogą zostać wykorzystane do obliczenia procentowego ubytku komórek: zakładając, że proces redukcji liczebności wirusów nie jest selektywny względem żadnych członków społeczności mikrobowej, czynnik ten można następnie wykorzystać do oszacowania szybkości produkcji wirusów in situ.

Rysunek 1. Produkcja cząsteczek przypominających wirusy podczas 10-godzinnej inkubacji w warunkach in situ z wykorzystaniem mikroskopii epifluorescencyjnej. Próbki pobrano podczas zakwitu fitoplanktonu u wybrzeży Nowej Zelandii we wrześniu 2008 roku.

Rysunek 2. Schematyczny diagram procesu analizy produkcji wirusów. Proces rozpoczyna się od ultrafiltracji wody z próbki w celu uzyskania wody wolnej od wirusów. Jest to realizowane przy użyciu systemu ultrafiltracji. Równolegle z tego samego miejsca pobierane są próbki wody; wolne wirusy przechodzą przez filtr, natomiast społeczność mikrobiologiczna (zawierająca mieszankę komórek zainfekowanych i niezinfekowanych) zostaje zatrzymana. Społeczność ta jest następnie resuspendowana w wodzie wolnej od wirusów i inkubowana w warunkach in situ. Następnie przez kolejne 10 godzin monitoruje się tempo ponownego pojawiania się wirusów, aby określić szybkość ich produkcji.

Dyskusja

Kluczowym elementem zrozumienia, w jaki sposób wirusy wpływają na morskie społeczności drobnoustrojów, jest określenie szybkości produkcji cząsteczek wirusów. Biorąc pod uwagę, że ich liczebność jest (mniej lub bardziej) statyczna w większości systemów (Wilhelm & Suttle 1999, Weinbauer 2004), a wirusy są szybko usuwane lub tracą zdolność infekowania w systemach wodnych (Wilhelm et al. 1998), tempo produkcji musi być względnie wysokie, aby zastąpić utracone cząsteczki.

Szacowanie śmiertelności mikrobów wywołanej przez wirusy w obrębie społeczności mikrobiologicznej wymaga wiedzy o tym, ile wirusów powstaje podczas każdego procesu lizy komórki (tzw. „wielkość wyrzutu”, ang. burst size). Wielkość wyrzutu wirusów w próbkach naturalnych może się znacznie różnić. Można ją wyznaczyć bezpośrednio za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (np. Weinbauer & Peduzzi 1994), jednak często wykracza to poza możliwości danego laboratorium lub nie zawsze jest praktyczne. W sytuacjach, gdy nie można ich wyznaczyć empirycznie, dla systemów morskich można przyjąć wartości literaturowe wynoszące 24 wirusy na zdarzenie lityczne, a dla systemów słodkowodnych 34 (Parada et al. 2006). Jeśli tempo produkcji wirusów zostanie podzielone przez tę liczbę, wynikiem będzie liczba komórek na jednostkę objętości niszczonych przez wirusy w skali doby. Otrzymaną wartość liczby zlizowanych mikrobów można następnie podzielić przez całkowitą liczebność bakterii, co pozwoli wyznaczyć śmiertelność indukowaną przez wirusy w badanym systemie: istniejące szacunki wahają się od kilku procent do prawie całej populacji i często zależą od innych czynników w badanym systemie (Wilhelm & Matteson 2008). Aby określić procent całkowitej śmiertelności, liczbę tę często mnoży się przez dwa (przy założeniu, że 50% komórek przechodzi do reprodukcji, a 50% komórek zostaje utraconych, Weinbauer 2004).

Biorąc pod uwagę, że biodostępność składników odżywczych i pierwiastków śladowych (np. N, P, Fe) może ograniczać tempo pierwotnej produktywności, a tym samym przepływ węgla przez systemy wodne, zrozumienie roli śmiertelności mikroorganizmów indukowanej przez wirusy w tym procesie stało się przedmiotem zainteresowania geochemików morskich. Istnieje obecnie kilka szacunków sugerujących, że wirusy codziennie uwalniają do kolumny wody znaczne stężenia pierwiastków odżywczych (Rowe et al. 2008, Higgins et al. 2009) i że pierwiastki te są szybko asymilowane przez społeczność mikrobiologiczną (Poorvin et al. 2004, Mioni et al. 2005). Tempo przepływu składników odżywczych do środowiska można określić, mnożąc liczbę zniszczonych komórek przez ilość składnika odżywczego na komórkę (oznaczaną jako „kwoty”). Informacje te mogą dostarczyć kluczowego elementu do zrozumienia sposobu funkcjonowania mikrobiologicznych sieci troficznych w systemach wodnych.

Bieżące kierunki rozwoju: Obecne działania szeregu grup badawczych koncentrują się na adaptacji powyższej strategii w celu enumeracji konkretnych wirusów w obrębie społeczności, a tym samym określenia, w jaki sposób konkretne organizmy są pod wpływem aktywności wirusów. W tym celu badacze stosują ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR), aby oszacować liczebność konkretnych grup lub rodzin wirusów równolegle do szacowania całkowitej społeczności wirusów. Wyniki te są następnie bezpośrednio wykorzystywane do określenia śmiertelności wirusów, obrotu składników odżywczych itp. dla konkretnych grup planktonu. To potężne, nowe podejście pozwoli badaczom w nadchodzących latach znacznie głębiej zgłębić procesy związane z ekologią wirusów i po raz pierwszy ilościowo określić interakcje w konkretnych społecznościach wirus-gospodarz poza ograniczeniami systemów laboratoryjnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2,5% p-fenylenediamina	Acros Organics	130575000	Roztwór zapasowy do Antifade
System Amicon Proflux M12	EMD Millipore	N/A	Do tego etapu można użyć dowolnego urządzenia do ultrafiltracji
Barwnik do żeli kwasów nukleinowych SYBR Green I	Invitrogen	S-7563
Filtr Helicon S10 30kDa	EMD Millipore	CDUF010LT
Filtry Pelicon XL 0,22 μm	Fisher Scientific	PXGVPPC50
Filtry membranowe GE 0,2 μm PCTE (47 mm)	Fisher Scientific	09-732-35
System do filtracji stycznej w skali laboratoryjnej Millipore Labscale Tangential Flow Filtration System	EMD Millipore	XX42LSS11	Do tego etapu można użyć innych systemów TFF
Filtry Micronstep 0,45 μm, celulozowe, białe, gładkie (25 mm)	Fisher Scientific	E04WP02500
Filtry GE Whatman Anodisc 0,02 μm (25 mm)	Fisher Scientific	68-09-6002
Mikroskop Leica DMRXA			Można użyć dowolnego mikroskopu epifluorescencyjnego z zestawem filtrów niebieskich
Poliwęglanowe baniaki 20L	Fisher Scientific
Glicerol	Fisher Scientific	BP229-4
PBS (0,05 M Na2HPO4, 0,85% NaCl, pH 7,5)	Fisher Scientific	BP329-500, S640-500
50% Glutaraldehyd	Fisher Scientific	G151-1
Krioprobówki Corning 2 mL – polipropylenowe z gwintem zewnętrznym	Fisher Scientific	09-761-71	Można użyć dowolnych kriopróbek
Krioprobówki Corning 5 mL – polipropylenowe z gwintem zewnętrznym	Fisher Scientific	09-761-74	Można użyć dowolnych kriopróbek
85% H3PO4	Fisher Scientific	A242-212	Przechowywanie membran spiralnych
Granulki NaOH	Fisher Scientific	S318-3	Czyszczenie M12
Miarki graduowane
Filtr membranowy Isopore o rozmiarze porów 0,8-μm (142 mm)	EMD Millipore	ATTP14250
Stalowy uchwyt filtra ciśnieniowego Millipore (142 mm)	Fisher Scientific	YY30 090 00