Przygotowanie silnie sprzężonych mitochondriów serca szczura

Podsumowanie

Opisujemy protokół izolacji czystych, silnie sprzężonych mitochondriów serca szczura do funkcjonalnych lub strukturalnych badań bioenergetyki komórkowej, pomiarów biofizycznych, proteomiki oraz analizy mitochondrialnego DNA i lipidów.

Streszczenie

Rola mitochondriów w generowaniu komórkowego ATP w procesie fosforylacji oksydacyjnej jest powszechnie znana. W ciągu ostatnich dekad nastąpił znaczący postęp w zrozumieniu funkcji mitochondriów wykraczających poza wytwarzanie energii. Obejmuje to ich rolę w apoptozie, działanie jako organelle sygnalizacyjne, udział w rozwoju i starzeniu się ssaków, a także wkład w koordynację między metabolizmem a proliferacją komórek. Nasza wiedza na temat procesów biologicznych modulowanych przez mitochondria opiera się na solidnych metodach izolacji i preparatyki nienaruszonych mitochondriów z tkanek zwierząt laboratoryjnych. Mitochondria z serca szczura stanowią jedną z najczęściej stosowanych preparacji w dawnych i obecnych badaniach nad metabolizmem komórkowym, w tym w badaniach nad zwierzętami z knockoutem.

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy szczegółową, szybką metodę izolacji nienaruszonych mitochondriów o wysokim stopniu sprzężenia. Tak przygotowane mitochondria serca szczura stanowią doskonały obiekt do badań funkcjonalnych i strukturalnych nad bioenergetyką komórkową, transportem biomolekuł, badań proteomicznych oraz analizy mitochondrialnego DNA, białek i lipidów.

Protokół

Wstęp

Mitochondria z serca szczura stanowią jedną z najczęściej stosowanych preparatów w przeszłych i obecnych badaniach nad metabolizmem komórkowym. Można je szybko i niezawodnie pozyskać w dużych ilościach od zwierząt typu dzikiego lub z nokautem genowym. Ogólna procedura obejmuje trawienie tkanki trypsyną, frakcjonowanie oraz wirowanie różnicowe.

Podczas izolacji mitochondriów z różnych tkanek, w tym z serca, należy zachować szereg określonych warunków (Rys. 1).

• Tkankę należy dokładnie rozdrobnić, ponieważ ma to bezpośredni wpływ na wydajność uzyskiwanych mitochondriów. Tkankę serca najlepiej rozdrabniać małymi zakrzywionymi nożyczkami, a następnie użyć homogenizatora Latapie lub, w przypadku braku homogenizatora, praski do czosnku z otworami wylotowymi o średnicy około 1.0 mm.
• Niezbędne jest utrzymanie temperatury roztworów na każdym etapie. Dlatego całą procedurę należy przeprowadzić w pomieszczeniu chłodniczym, a wszystkie instrumenty i roztwory muszą zostać przygotowane i schłodzone z wyprzedzeniem. Jeśli warunki temperaturowe nie zostaną utrzymane na stałym poziomie, może dojść do utraty kilku właściwości preparatu. Struktura mitochondriów jest bardzo wrażliwa na zamrażanie, dlatego dopuszczalne nie jest nadmierne zamrożenie zawiesiny (na przykład podczas wirowania), szczególnie jeśli istotne są badania transportu aktywnego.
• Ważnym parametrem jest czas trwania procedury; izolację należy przeprowadzić jak najszybciej, a otrzymany preparat należy wykorzystać niezwłocznie. W związku z tym instrumenty chirurgiczne, roztwory i urządzenia muszą być przygotowane z wyprzedzeniem.

Materiały i instrumenty

Instrumenty

1. Proste nożyczki operacyjne, ostre końce
2. Nożyczki zakrzywione
3. Pinceta
4. Szalka Petriego
5. Mały lejek + kawałek filtra nylonowego (wstępnie przemyty)
6. 6 zlewków 50 ml
7. Dwa mieszadła magnetyczne i dwie łaźnie lodowe
8. Jedna duża łaźnia lodowa
9. 2 małe mieszadełka magnetyczne
10. Spatułki do zgarniania osadu
11. Probówki do wirowania
12. Prasa do tkanek Latapie (można zastąpić praską do czosnku)
13. Homogenizatory teflonowo-szklane 20ml i 1-2ml
14. Zlewek na odpady
15. Probówki Eppendorf do końcowej zawiesiny mitochondrialnej i próbek do oznaczania białka
16. Łaźnie lodowe

Roztwory (obliczone dla 2 szczurów):

1. Bufor płuczący: 0,3 M sacharozy, 10 mM HEPES (pH=7,2), 0,2 mM EDTA (1000 ml)
2. Bufor izolacyjny: 0,3 M sacharozy, 10 mM HEPES (pH=7,4), 0,2 mM EDTA, 1 mg/ml BSA (Sigma A6003) (100 ml przygotowanych z buforu płuczącego). Albuminę surowicy bydlęcej można zastąpić tańszymi analogami wolnymi od kwasów tłuszczowych. Ten sam bufor lub jego warianty izotoniczne mogą być stosowane jako bufor do resuspensji.
3. Roztwór trypsyny (Sigma T8003): 2,5 mg/ml w 1 mM HCl (0,5 ml)
4. Inhibitor trypsyny z soi (Sigma T9128): 6,5 mg / 10 ml buforu izolacyjnego

Protokół

Ogólny schemat procedury przedstawiono na Rys. 1. Serca należy schłodzić i przemyć buforem do mycia, wyciąć tkankę komór, posiekać i homogenizować podczas obróbki fotolitycznej z trypsyną. Zawiesinę wiruje się z niską prędkością, a otrzymany nadsącz wiruje się ponownie z większą prędkością w celu zebrania mitochondriów. W zależności od planowanych eksperymentów bufor do resuspensji można zastąpić dowolnym innym roztworem izotonicznym.

Zwierzęta uśmiercono zgodnie z brytyjską ustawą „Animals (Scientific Procedures) Act” poprzez zwichnięcie stawów szyjnych, a następnie dekapitację. Serce należy wyciąć natychmiast po dekapitacji zwierzęcia, aby uniknąć opóźnienia między uśmierceniem zwierzęcia a pobraniem narządu. Jeśli planowana jest równoległa izolacja mitochondriów wątrobowych, szczury powinny być głodzone przez noc przed eksperymentem.

1. Przygotuj trzy zlewki zawierające 40 ml buforu piorącego (Washing Buffer). Chłodź je w łaźni lodowo-solnej przez 3 do 5 min przed przejściem do następnego kroku. Należy uważać, aby ich nie zamrozić zbyt mocno; należy ich użyć natychmiast po pojawieniu się pierwszych kryształków lodu.
2. Otwórz klatkę piersiową zdekapitowanego szczura i wyjmij serce. Wykonaj niewielkie nacięcia, a następnie natychmiast przenieś serce do lodowatego roztworu w pierwszej zlewce. Ściśnij serce, aby usunąć krew, i przełóż je do drugiej zlewki. Powtórz tę operację dla każdego serca.
3. Osusz serca na papierze filtracyjnym. Usuń cały tłuszcz, skrzepy krwi, uszka i powięzi, a następnie połącz tkankę komór.
4. Posiekaj połączoną tkankę małymi zakrzywionymi nożyczkami na szalce Petriego na lodzie przez około 5 min, aż wielkość cząstek wyniesie około 1-2 mm.
5. Umieść posiekaną tkankę w prasie do tkanek i przepuść ją przez urządzenie. Należy pamiętać, że znaczna ilość materiału może pozostać w prasie, dlatego należy zebrać całą tkankę serca ze ścianek i dna prasy.
6. Przenieś materiał do zlewki z 50 ml buforu piorącego (Washing Buffer) i wymieszaj. Następnie przefiltruj zawiesinę przez filtr nylonowy. Przepłucz posiekaną tkankę na filtrze 3 razy buforem piorącym i odrzuć filtrat.
7. Przenieś wypłukaną tkankę do 20 ml buforu piorącego (Washing Buffer) i umieść ją w łaźni lodowej na mieszadle magnetycznym. Dodaj 0,5 ml roztworu trypsyny przy ciągłym mieszaniu i uruchom stoper. Przygotuj drugie mieszadło magnetyczne, łaźnię lodową oraz drugą zlewkę o pojemności 50 ml.
8. W 4^th minucie krótko homogenizuj zawiesinę partiami, używając małego, luźno dopasowanego homogenizatora szklano-teflonowego (10-15 ml), wykonując kilka ruchów góra-dół w celu rozproszenia zawiesiny. Po homogenizacji przenieś zawiesinę do drugiej zlewki. Powtórz procedurę w 9^th minucie, tak aby przeprowadzić homogenizację zawiesiny łącznie dwa razy. Po 15 min inkubacji dodaj 10 ml buforu izolacyjnego zawierającego inhibitor trypsyny i inkubuj przez 1 min.
9. Ponownie przefiltruj zawiesinę przez filtr nylonowy i zachowaj filtrat. Zbierz frakcję cząsteczkową pozostałą na filtrze i homogenizuj przez 1 min w 15-20 ml buforu piorącego (Washing Buffer).
10. Połącz homogenat z filtratem i wiruj przez 15 min przy 600g.
11. Ostrożnie przefiltruj otrzymany nadsącz do nowej probówki wirówkowej. Unikaj zanieczyszczenia osadem i wiruj ponownie przez 15 min przy 8500g.
12. Po wirowaniu wysokoobrotowym odrzuć nadsącz i przepłucz osad 2-3 razy 1 ml buforu, usuwając puszystą, białą zewnętrzną warstwę krawędziową. Rozbij osad szpatułką, unikając czerwonej plamki erytrocytów na dnie. Jeśli komórki krwi się poluzowały, usuń czerwone fragmenty z zawiesiny przed homogenizacją.
13. Resuspenduj osad za pomocą małego homogenizatora lub alternatywnie poprzez delikatne pipetowanie. Rozcieńcz zawiesinę większą ilością buforu izolacyjnego (Isolationbuffer) i wiruj ponownie przez 15 min przy 8500g.
14. Odrzuć nadsącz, resuspenduj osad w buforze resuspendującym (Resuspending Buffer – dowolny wybrany bufor izotoniczny) i wiruj ponownie.
15. Otrzymany brązowy osad zawiera wypłukane, nienaruszone mitochondria. Resuspenduj osad w bardzo małej objętości wybranego buforu izotonicznego.

Rysunek 1. Schemat przedstawiający procedurę izolacji mitochondriów serca szczura krok po kroku. Górna część, etapy 1-9: rozdrabnianie tkanek, traktowanie trypsyną i homogenizacja; dolna część, etapy 10-15: wirowanie różnicowe.

Dyskusja

Opisano szczegółowy, szybki protokół izolacji nienaruszonych mitochondriów o wysokim stopniu sprzężenia. Uzyskany preparat może być wykorzystany w badaniach funkcjonalnych lub strukturalnych bioenergetyki komórkowej, w badaniach proteomicznych lub analizie zawartości mtDNA i lipidów. Możliwe jest również przeprowadzenie badań biofizycznych nad aktywnym transportem jonów i produktów pośrednich metabolizmu. Preparat mitochondrialny można poddać dalszej obróbce w celu wyizolowania cząstek submitochondrialnych, błony zewnętrznej lub oczyszczenia poszczególnych komponentów fosforylacji oksydacyjnej. Opisana metoda jest modyfikacją standardowego protokołu izolacji opracowanego przez Jacobusa i Saksa¹. Przewidywana wydajność przygotowanych mitochondriów wynosi około 10-15 mg białka mitochondrialnego z jednego serca, a współczynnik kontroli oddechowej na malonianie/glutaminianie takiego preparatu waha się od 8 do 12, przy oddychaniu w stanie IV na poziomie około 0.12 μmol O₂xmin^-1xmg protein^-1 w temperaturze 23°C w medium zawierającym 0.25 M sacharozy, 10 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 5 mM fosforanu potasu (pH 8.0) z dodatkiem 150 μM ADP w celu zainicjowania oddychania w stanie III (dokładne warunki eksperymentalne i dodatki opisano w ref. ²).

Przed rozpoczęciem procedury izolacji należy zwrócić szczególną uwagę na kilka szczegółów technicznych. Kluczowe jest użycie czystych probówek wirówkowych z poliwęglanu lub polipropylenu; probówki powinny być zatem dokładnie umyte czystą szczoteczką i gorącą wodą, przy czym należy ograniczyć stosowanie detergentów do minimum. Wskazane jest również zgromadzenie całego niezbędnego szkła i instrumentów w pomieszczeniu chłodniczym dzień przed izolacją.

Podczas izolacji, przy przenoszeniu buforów z kolb do zlewów, należy zwrócić szczególną uwagę, aby do roztworów nie dostały się krople wody z lodu. Przy pracy z tkankami należy podkreślić, że ekstrakcję serca należy przeprowadzić jak najszybciej, ponieważ nawet krótkie opóźnienie między dekapitacją zwierzęcia a schłodzeniem tkanki spowodowałoby częściowe rozprzężenie mitochondriów. Szybkie schłodzenie i dokładne przemycie wyjętych serc jest niezbędne do uzyskania standardowego preparatu, wolnego od hemoglobiny i erytrocytowej NADazy.

Trypsynę stosuje się do degradacji białek łącznych, aby zwiększyć podatność tkanki na siły ścinające podczas homogenizacji. Należy unikać przedłużonej ekspozycji tkanki na proteazę, ponieważ prowadzi to do uzyskania mitochondriów gorszej jakości.

Po wirowaniu przy wysokich prędkościach ścianki probówek do wirowarki należy przetrzeć ręcznikiem papierowym, aby usunąć wszelkie osady tłuszczu nagromadzone na ściankach.

Do końcowego resuspensowania zaleca się użycie małej objętości buforu końcowego, aby zminimalizować utratę funkcji mitochondriów podczas przechowywania (150 do 200 μl buforu na serce). W badaniach nad transportem kationów dwuwartościowych w końcowym preparacie nie mogą znajdować się żadne środki chelatujące, dlatego mitochondria należy kilkukrotnie przemyć medium wolnym od EGTA i wykorzystać w ciągu pierwszych godzin po izolacji.