Analiza interakcji między komórkami Schwanna a astrocytami z wykorzystaniem testów in vitro

Podsumowanie

Niniejszy artykuł ma na celu opisanie w sposób etapowy powszechnie stosowanych testów in vitro wykorzystywanych w badaniu oddziaływań między komórkami Schwanna a astrocytami.

Streszczenie

Komórki Schwanna są jednymi z najczęściej wykorzystywanych komórek w strategiach naprawczych po urazach rdzenia kręgowego. Komórki Schwanna są zdolne do wspierania regeneracji i kiełkowania aksonów poprzez wydzielanie czynników wzrostu ^1,2 oraz dostarczanie promujących wzrost cząsteczek adhezyjnych ³ i cząsteczek macierzy zewnątrzkomórkowej ⁴. Dodatkowo mielinizują one zdemielinizowane aksony w miejscu urazu ⁵.

Jednakże po transplantacji komórki Schwanna nie migrują z miejsca implantacji i nie mieszają się z astrocytami gospodarza ^6,7. Prowadzi to do powstania ostrej granicy między komórkami Schwanna a astrocytami, co stanowi przeszkodę dla rosnących aksonów próbujących opuścić przeszczep i powrócić do tkanki gospodarza proksymalnie i dystalnie. Astrocyty w kontakcie z komórkami Schwanna ulegają również hipertrofii i zwiększają ekspresję cząsteczek inhibicyjnych ^8-13.

In vitro testy były wykorzystywane do modelowania interakcji między komórkami Schwanna a astrocytami i odegrały istotną rolę w zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw zachowania komórkowego.

Te testy in vitro obejmują test granicy, w którym tworzona jest ko-kultura z dwóch różnych typów komórek, przy czym każdy typ zajmuje odrębne obszary, oddzielone jedynie niewielką przerwą między frontami komórkowymi. W miarę jak komórki dzielą się i migrują, dwa fronty komórkowe zbliżają się do siebie, aż w końcu dochodzi do ich zderzenia. Pozwala to na analizę zachowania dwóch populacji komórkowych na granicy styku. Inną odmianą tej samej techniki jest zmieszanie dwóch populacji komórkowych w kulturze, co z czasem prowadzi do segregacji obu typów komórek, w wyniku czego komórki Schwanna skupiają się w postaci wysepek pomiędzy astrocytami, tworząc w ten sposób liczne granice między komórkami Schwanna a astrocytami.

Drugim testem stosowanym w badaniu interakcji dwóch typów komórek jest test migracji, w którym ruch komórek może być śledzony na powierzchni monowarstwy drugiego typu komórek ^14,15. Test ten jest powszechnie znany jako test odwróconego szkiełka podstawowego. Komórki Schwanna hoduje się na małych fragmentach szkła, które następnie odwraca się i kładzie powierzchnią do dołu na powierzchni monowarstw astrocytów, a migrację ocenia się od krawędzi szkiełka.

Oba testy odegrały kluczową rolę w badaniu mechanizmów leżących u podstaw wykluczania komórkowego i tworzenia granic. Do cząsteczek zidentyfikowanych przy użyciu tych technik należą m.in. N-kadheryny 15, proteoglikany siarczanu chondroityny (CSPGs) ^16,17, FGF/heparyna ¹⁸ oraz Eph/efryny¹⁹.

Niniejszy artykuł ma na celu opisanie testu granicznego (boundary assay) oraz testu migracji w sposób etapowy i wyjaśnienie możliwych problemów technicznych, które mogą wystąpić.

Protokół

1. Analiza granic:

1. Podstawowe przygotowanie: Slajdy komorowe są powlekane poli-D-lizyną przez noc, a sterylizowane szkiełka przedmiotowe są przygotowywane przed rozpoczęciem eksperymentu. Pożywkę przygotowuje się, stosując Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) uzupełnione o 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) oraz 1% penicyliny-streptomycyny-fungizonu (PSF). Przygotowywana jest również butelka zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) wolnego od wapnia i magnezu.
2. Pierwotne hodowle komórek Schwanna szczura w kolbach są trypsynizowane przez 3 minuty przy użyciu 0,1% trypsyny. Pierwotne hodowle astrocytów szczura są trypsynizowane przez 5 minut przy użyciu 0,1% trypsyny.
   Trypsynę dezaktywuje się poprzez dodanie DMEM uzupełnionego o 10% FCS i 1% PSF.
3. Trypsynizowane komórki Schwanna i astrocyty przenosi się do oddzielnych probówek Falcon o pojemności 15 mL i wiruje przy 300G przez 5 minut.
4. Komórki Schwanna i astrocyty resuspenduje się do gęstości 2 x 10⁶ (zmiany w gęstości komórek opisano w sekcji wyników reprezentatywnych).
5. Kroplę 50 μL zawiesiny komórek Schwanna umieszcza się na jednym końcu dołków slajdu komorowego powleczonego PDL. Do rozmazania kropli w kierunku centrum komory w celu uzyskania prostej krawędzi użyto paska szklanego. (Za pomocą przecinaka do szkła wycinane są podłużnie prostokątne szkiełka zakrywki tak, aby pasowały do szerokości slajdów komorowych używanych w testach granic).
6. Drugą kroplę 50 μL zawiesiny astrocytów umieszczono na przeciwległym końcu tego samego dołka i rozmazano w kierunku centrum, aby utworzyć prostą krawędź równoległą do rozmazania pierwszej kropli, z niewielką przerwą 0,2 mm między nimi.
7. Slajdy komorowe z kroplami umieszcza się w inkubatorze w temperaturze 37°C na 2 godziny.
8. Po 2 godzinach hodowle przemyto DMEM w celu usunięcia nieprzylegających szczątków komórkowych i dodano świeżą pożywkę DMEM/ 10%FCS/ 1% PSF.
   Uwaga: Pożywkę DMEM/ 10%FCS/ 1% PSF można uzupełnić o forskolinę (2μM) i ekstrakt z przysadki wołowej (BPE) (10μg/mL), aby stymulować proliferację komórek Schwanna. BPE dostarcza czynników wzrostu niezbędnych do długoterminowej hodowli komórek Schwanna, a forskolina podnosi poziom cyklicznego adenozynomonofosforanu w komórkach Schwanna w celu indukcji proliferacji.
9. Komórki hoduje się przez około 8-10 dni w inkubatorze w temperaturze 37°C i 7% CO₂. Pożywkę należy wymieniać co 3 dni. Dwa fronty komórek ostatecznie spotkają się, a między dwoma typami komórek utworzy się wyraźna granica. Na tym etapie można przeprowadzić eksperymenty analizujące czynniki zaangażowane w tworzenie granicy.
10. Współhodowlę można utrwalić za pomocą 4% formaldehydu; komórki Schwanna można poddać immunobarwieniu przeciwciałem anty-P75, a astrocyty przeciwciałami anty-GFAP, aby zidentyfikować komórki w współhodowli. Przeciwciało P75 rozpoznaje receptor NGF o niskim powinowactwie na komórkach Schwanna, którego brakuje astrocytom. Przeciwciało anty-GFAP rozpoznaje kwaśne białko włókniste glii, które lokalizuje się w cytoplazmie astrocytów. (Przedstawicielską granicę przedstawiono na rysunku 1A).

2. Test migracji:

1. Płytki 4-dołkowe (dołki 15 mm) są powlekane PDL przez noc i przygotowywane do tworzenia monowarstw astrocytów.
2. Pierwotna hodowla astrocytów jest trypsynizowana przez 5 minut przy użyciu 0,1% trypsyny. Trypsynę inaktywuje się poprzez dodanie DMEM uzupełnionego o 10% FCS i 1% PSF, a następnie komórki odwiruje się przy 300G przez 5 minut. (Patrz Rysunek 2)
3. Astrocytów resuspenduje się do stężenia 1x10⁵ cells/ mL. 1 mL tego roztworu dodaje się do każdego powlekanego PDL dołka w płytkach 4-dołkowych. Astrocytów hoduje się przez 24-48 godzin, aż monowarstwa stanie się całkowicie konfluenta.
4. Aby ocenić migrację komórek Schwanna na monowarstwach astrocytów, równolegle do tworzenia monowarstw astrocytów, okrągłe, powlekane PDL szklane przykrywki umieszcza się w probówce 50 mL i kruszy za pomocą plastikowej pipety, aby stworzyć małe fragmenty szkła.
5. Fragmenty szkła przenosi się do dołka w płytce 6-dołkowej, a następnie za pomocą pincety wybiera się fragmenty o odpowiedniej wielkości i umieszcza je w pozostałych dołkach. W każdym dołku płytki 6-dołkowej umieszcza się 5 fragmentów szkła.
6. Pierwotne komórki Schwanna hodowane w kolbie są trypsynizowane przez 3 minuty przy użyciu 0,1% trypsyny. Trypsynizowane komórki Schwanna przenosi się do oddzielnej probówki Falcon 15 mL i odwiruje przy 300 G przez 5 minut. Komórki Schwanna resuspenduje się do stężenia 2x 10⁶ cells/ mL w DMEM/10% FCS/1% PSF.
7. Kropelki 20 μL zawiesiny komórek Schwanna dodaje się na każde 5 fragmentów przykrywek umieszczonych w płytkach 6-dołkowych, a następnie komórki inkubuje przy 37°C, 7% CO₂ przez 2 godziny.
8. Po 2 godzinach komórki Schwanna przywierają do fragmentów przykrywek i do każdego dołka dodaje się DMEM/10% FCS/1% PSF (uzupełniony o 2μM forskoliny i 10μg/ mL BPE) tak, aby fragmenty były całkowicie przykryte medium.
9. Płytki 6-dołkowe zawierające fragmenty umieszcza się następnie w inkubatorze na 24-48 godzin, aż fragmenty szkła zostaną całkowicie pokryte konfluentnymi komórkami Schwanna.
10. Gdy fragmenty staną się konfluentne z komórkami Schwanna, każdy fragment ostrożnie podnosi się za pomocą ostrej pincety, zanurza w HBSS w celu usunięcia nieprzywierających komórek, a następnie odwraca stroną komórek do dołu na monowarstwę astrocytów.
11. Każdy dołek przykrywa się następnie 1 mL DMEM/10% FCS/1% PSF i pozwala komórkom Schwanna migrować przez okres od 24 do 48 godzin. W tym czasie można dodawać odczynniki eksperymentalne, takie jak czynniki wzrostu, aby ocenić ich wpływ na liczbę i dystans migracji komórek Schwanna.
12. Po okresie migracji fragmenty szkła utrwala się do dna każdego dołka, dodając 4% paraformaldehydu (PFA) na 30 minut. Po utrwaleniu wykonuje się immunostynowanie komórek Schwanna przeciwko p75 (rozpoznając receptor NGF o niskim powinowactwie), a następnie barwi się je przy użyciu zestawu ABC strepavidin-diaminobenzydyna (DAB), aby umożliwić wizualizację komórek Schwanna pod mikroskopem świetlnym.

3. Reprezentatywne wyniki:

Po 8–10 dniach kokultury komórek Schwanna i astrocytów wykazują wyraźną granicę między tymi dwoma typami komórek. Granica ta jest bardziej zaznaczona w przypadku zastosowania forskoliny i BPE w hodowli, ponieważ wzmacnia to proliferację komórek Schwanna.

Jeśli w ciągu 10 dni nie zaobserwowano granicy, czas hodowli można dodatkowo wydłużyć do momentu ukształtowania się granic. Alternatywnym sposobem na zwiększenie formowania się granic jest zmiana stosunku gęstości komórek. Podczas przygotowywania zawiesin komórkowych można zastosować stosunek gęstości komórek Schwanna do astrocytów wynoszący 3:1 ^8,18.

Po przeprowadzeniu immunobarwienia w celu identyfikacji komórek Schwanna i astrocytów, aby ocenić stopień przemieszania się komórek, można wyznaczyć linię stanowiącą granicę i pod mikroskopem fluorescencyjnym policzyć liczbę komórek Schwanna migrujących na obszar zajęty przez astrocyty.

Poniżej przedstawiono dwa przykłady obrazów uzyskanych granic, jeden z dobrze uformowaną segregacją komórek Schwanna i astrocytów (Rycina 1A) oraz jeden, w którym komórki nie oddzieliły się prawidłowo na różne obszary z powodu błędnej techniki (Rycina 1B).

Rycina 1. Test granicy: interakcja komórek Schwanna i astrocytów. A) 10-dniowy test kokultury w obecności forskoliny i BPE w celu stymulacji proliferacji komórek Schwanna wykazuje wyraźną granicę między dwoma typami komórek (czerwony=P75, zielony=GFAP). B) 10-dniowy test kokultury, w którym nie utworzyła się granica, a fronty obu typów komórek wymieszały się. Było to spowodowane zmieszaniem dwóch kropel podczas umieszczania kropel astrocytów i komórek Schwanna obok siebie podczas przygotowywania granicy (czerwony=P75, zielony=GFAP).

Rysunek 2. Reprezentatywny obraz konfluencyjnej monowarstwy astrocytów

Testy migracji oceniają przemieszczanie się jednego typu komórek po powierzchni innego typu komórek, a zatem analizują zjawisko odmienne od formowania się granicy.

Wymagana jest praktyka, aby upewnić się, że odwracanie szkiełek nakrywkowych na monowarstwy nie prowadzi do uszkodzenia fragmentów szkła pokrytych komórkami Schwanna oraz monowarstw astrocytów przez ostre pęsety. Aby ocenić migrację komórek Schwanna, pod mikroskopem świetlnym można zmierzyć maksymalny dystans migracji oraz liczbę komórek migrujących z krawędzi szkiełka nakrywkowe.

Poniżej znajduje się obraz komórek Schwanna wybarwionych przeciwciałem P75 z zastosowaniem barwienia DAB na powierzchni monowarstwy astrocytów (Rysunek 3).

Rycina 3. Test migracji z wykorzystaniem metody odwróconego szkiełka podstawowego. A) Komórki Schwanna (brązowe, wybarwione immunochemicznie przeciwciałem p75) migrujące od krawędzi szkiełka podstawowego. Strzałka wskazuje kierunek migracji komórek od szkiełka.

Dyskusja

Opisane powyżej testy zostały wykorzystane w różnych badaniach wykazujących rolę wielu czynników zaangażowanych w tworzenie granicy między astrocytami a komórkami Schwanna oraz ograniczoną migrację komórek Schwanna w środowisku astrocytarnym.

Zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw tych zdarzeń jest kluczowe, ponieważ pozwoliłoby na opracowanie strategii optymalizacji i poprawy integracji przeszczepów komórek Schwanna po transplantacji, a tym samym ułatwiłoby wyjście regenerujących się aks...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Invitrogen	41966-029
HBSS	Invitrogen	14170-088
FCS	Invitrogen	10091-148
PSF	Invitrogen	15240-062
BPE	Invitrogen	13028-014
Forskolina	Calbiochem	344273
Kryszki	VWR international	631-0149
Kryszki (prostokątne)	Menzel-Glaser	BB022050A1
Szkiełka z komorami	Nalge Nunc international	177380
Płytki 4-dołkowe, płytki 6-dołkowe	Nalge Nunc international		Płytki 4-dołkowe, płytki 6-dołkowe
przeciwciało przeciwko rat p75	EMD Millipore	MAB365
przeciwciało przeciwko GFAP	Dako	Z0334
Przeciwciała wtórne (sprzężone z Alexa)	Invitrogen	A-11004 A-11034	Kozie anty-mysie 568, Kozie anty-królicze 488
Przeciwciała wtórne biotynylowane	Vector Laboratories		Kozie anty-mysie
Tabletki DAB	Sigma-Aldrich	D4418
Zestaw ABC elite	Vector Laboratories	PK-6100
Precyzyjna pęseta	Fine Science Tools	11295-10
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6168
Fluorosave	Calbiochem	345789