Wizualizacja produktów pośrednich replikacji indukowanych promieniowaniem UV w E. coli za pomocą dwuwymiarowej analizy żelu agarozowego

Summary

Przedstawiamy procedurę, dzięki której dwuwymiarowa analiza agarozowo-żelowa może być wykorzystana do identyfikacji struktury produktów pośrednich replikacji, które zachodzą po naświetlaniu UV.

Abstract

Niedokładna replikacja w obecności uszkodzenia DNA jest odpowiedzialna za większość rearanżacji komórkowych i mutagenezy obserwowanych we wszystkich typach komórek i powszechnie uważa się, że jest bezpośrednio związana z rozwojem raka u ludzi. Uszkodzenia DNA, takie jak te wywołane promieniowaniem UV, poważnie upośledzają zdolność replikacji do dokładnego powielania matrycy genomowej. Zidentyfikowano szereg produktów genowych, które są wymagane, gdy replikacja napotyka zmiany DNA w szablonie. Pozostałym wyzwaniem pozostaje jednak ustalenie, w jaki sposób białka te przetwarzają zmiany chorobowe podczas replikacji in vivo. Używając Escherichia coli jako systemu modelowego, opisujemy procedurę, w której dwuwymiarowa analiza agarozowo-żelowa może być wykorzystana do identyfikacji strukturalnych produktów pośrednich, które powstają podczas replikacji plazmidów in vivo po uszkodzeniu DNA wywołanym promieniowaniem UV. Procedura ta została wykorzystana do wykazania, że widełki replikacyjne zablokowane przez uszkodzenia wywołane promieniowaniem UV ulegają przejściowemu odwróceniu, które jest stabilizowane przez RecA i kilka produktów genowych związanych ze szlakiem RecF. Technika ta pokazuje, że te produkty pośrednie replikacji są utrzymywane do czasu, który koreluje z usunięciem zmian przez wycinanie, naprawę i wznowienie replikacji.

Protocol

1. Wzrost i promieniowanie UV.

1. 200 μl świeżej kultury nocnej zawierającej plazmid pBR322 wyhodowany w pożywce Davis¹ uzupełnionej 0,4% glukozy, 0,2% casaminokwasów i 10 μg/ml tyminy (pożywka DGCthy) i 100 μg/ml ampicyliny jest granulowane. Osad komórkowy jest następnie ponownie zawieszany w 200 μl pożywki DGCthy bez ampicyliny i używany do zaszczepienia 20 ml pożywki DGCthy.
2. Kultury hoduje się bez selekcji ampicyliny w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 ° C do OD₆₀₀ 0,5 (~ 5 x 10⁸ komórek/ml). Wzrost bez ampicyliny pozwala uniknąć selekcji przeciwko nieprawidłowym lub nieproduktywnym produktom pośredn....

Discussion

Typowe wyniki uzyskane z komórek typu dzikiego w obecności i bez uszkodzeń wywołanych promieniowaniem UV przedstawiono na rysunku 1. W przypadku braku uszkodzeń ~ 1% całkowitego plazmidowego DNA można znaleźć w łuku Y, gdy komórki szybko rosną w fazie wykładniczej. Po napromieniowaniu obserwuje się przejściowy wzrost cząsteczek w kształcie litery Y, ponieważ zablokowane widełki replikacyjne gromadzą się w uszkodzonych miejscach. Półprodukty replikacji w kształcie litery X również przejściowo kumulują się i utrzymują do .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Przykład południowej analizy żelu 2D sondowanego	Healthcare	G15T8	Yellow Lighting
15 μ watowa lampa bakteriobójcza	Sylvania	F20T12/GO	Lampa UV
Blak-Ray Miernik intensywności UV 254nm	Daigger	EF28195T	Fotometr UVC
0,025 i mu; m krążki porowe	Whatman, GE Healthcare	VSWP04700	Pływające dyski dializacyjne
PvuII	Fermentas	ER0632	Ograniczenie endonukleazy
Zestaw do translacji nicków	Roche Group	976776	Do produkcji sondy z oznaczeniem 32P
Bibuła	Whatman, GE Healthcare	3030-704	Do południowego transferu
Membrana nylonowa	GE Healthcare	RPN203S	Na przelew południowy