Przedstawiamy procedurę, w której dwuwymiarowa analiza w żelu agarozowym może zostać wykorzystana do identyfikacji struktury produktów pośrednich replikacji powstających po napromieniowaniu UV.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wizualizacja indukowanych promieniami UV produktów pośrednich replikacji w E. coli przy użyciu dwuwymiarowej elektroforezy w żelu agarozowym
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nieprawidłowa replikacja w obecności uszkodzeń DNA odpowiada za większość przemieszczeń komórkowych i mutagenezę obserwowaną we wszystkich typach komórek i powszechnie uważa się, że jest ona bezpośrednio związana z rozwojem nowotworów u ludzi. Uszkodzenia DNA, takie jak te wywołane promieniowaniem UV, poważnie upośledzają zdolność replikacji do dokładnego powielania matrycy genomowej. Zidentyfikowano szereg produktów genów, które są niezbędne w sytuacjach, gdy podczas replikacji napotkane zostają uszkodzenia DNA w matrycy. Jednakże wyzwaniem pozostaje ustalenie, w jaki sposób białka te przetwarzają te uszkodzenia w trakcie replikacji.in vivoWykorzystując *Escherichia coli* jako układ modelowy, opisujemy procedurę, w której dwuwymiarowa analiza w żelu agarozowym może zostać zastosowana do identyfikacji produktów pośrednich strukturalnych powstających na replikujących się plazmidachin vivopo uszkodzeniu DNA indukowanym promieniowaniem UV. Procedura ta została wykorzystana do wykazania, że widły replikacyjne zablokowane przez uszkodzenia wywołane promieniowaniem UV ulegają przejściowemu odwróceniu, które jest stabilizowane przez białko RecA oraz kilka produktów genów związanych ze ścieżką RecF. Technika ta dowodzi, że te produkty pośrednie replikacji są utrzymywane do czasu korelującego z usunięciem uszkodzeń poprzez naprawę przez wycinanie nukleotydów, po czym replikacja zostaje wznowiona.
Protokół
1. Wzrost i naświetlanie UV.
- 200 μl świeżej kultury nocnej zawierającej plazmid pBR322, hodowanej w pożywce Davisa1 uzupełnionej o 0,4% glukozy, 0,2% kwasów kasamino i 10 μg/ml tyminy (pożywka DGCthy) oraz 100 μg/ml ampicyliny, poddaje się wirowaniu w celu uzyskania osadu. Osad komórkowy resuspenduje się następnie w 200 μl pożywki DGCthy bez ampicyliny i wykorzystuje do zaszczepienia 20 ml pożywki DGCthy.
- Kultury hoduje się bez selekcji ampicyliną w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37° C do osiągnięcia wartości OD600 równej 0,5 (~ 5 x 108 komórek/ml). Wzrost bez ampicyliny pozwala uniknąć selekcji przeciwko nieprawidłowym lub nieproduktywnym produktom pośrednim replikacji, które mogą powstać w niektórych mutantach. Ponadto, w przypadku wykorzystania światła UV do indukowania uszkodzeń, usunięcie ampicyliny z pożywek jest konieczne, ponieważ silnie absorbuje ona promieniowanie o tych długościach fal i osłania komórki, zmniejszając efektywną dawkę UV.
- Pracując przy żółtym świetle, kulturę przenosi się do szalki Petriego o średnicy 15 cm, umieszczonej na platformie rotacyjnej w celu mieszania. Nasze kultury są umieszczane w określonej odległości od 15-watowej lampy bakteriobójczej, która generuje natężenie ekspozycji wynoszące ~1 J/m2/sec, mierzone za pomocą fotometru UVC. Kultury naświetla się dawką 50 J/m2, a następnie bezzwłocznie przenosi z powrotem do inkubatora z wytrząsaniem w temperaturze 37° C na czas trwania eksperymentu. Dawka ta powoduje powstanie średnio jednego dimeru cyklobutanowego pirymidyn na każde 4,5 kb ssDNA. Żółte oświetlenie zapobiega fotoreaktywacji, czyli odwróceniu dimerów cyklobutanowych pirymidyn przez fotoliazę.
2. Izolacja DNA.
- W momentach, w których należy zbadać produkty pośrednie replikacji, 0,75 ml alikwot kultury przenosi się do 0,75 ml lodowatego buforu NET30 (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8.0, 30 mM EDTA) i utrzymuje na lodzie do końca przebiegu czasowego. Zazwyczaj przeprowadzamy przebieg czasowy trwający 90 minut, badając próbki w 0, 15, 30, 45, 60 i 90 minucie. EDTA oraz niska temperatura służą do skutecznego zatrzymania replikacji i naprawy przez wycinanie nukleotydów.
- Każdą próbkę następnie wiąże się w wirówce, resuspensuje w 150 μl lizozymu (1,5 mg/ml) i RNazy A (0,2 mg/ml) w buforze TE (10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA) i poddaje lizie w temperaturze 37°C przez 20 min. Następnie dodaje się 10 μl proteinazy K (10 mg/ml) i 10 μl 20% sarkozylu, a inkubację kontynuuje się przez 1 h. Proteinaza K i sarkozyl pomagają uwolnić fragmenty DNA, które mogą być związane z błoną lub białkami przed ekstrakcją fenolem. Ponieważ aktywnie replikowany DNA jest często związany z kompleksami białkowymi lub błonowymi, pomaga to zwiększyć wydajność odzyskiwanych fragmentów replikacyjnych.
- Próbki ekstrahuje się poprzez dodanie 2 objętości fenolu do każdej próbki, a probówki delikatnie odwraca się przez 5 minut. Następnie dodaje się 2 objętości chloroformu/alkoholu izoamylowego (24/1) i ponownie delikatnie odwraca probówki przez 5 minut.
- Próbki wiruje się w mikrowirówce przy 14 000 rpm przez 5 minut, a górną fazę wodną z każdej próbki pobiera się i przenosi do nowej probówki. Następnie dodaje się 4 objętości chloroformu/alkoholu izoamylowego (24/1), delikatnie odwraca probówki przez 5 minut i ponownie wiruje przy 14 000 rpm przez 5 minut.
- Górna faza wodna każdej próbki jest następnie dializowana przez 1 godzinę poprzez naniesienie 100 μl każdej próbki na dysk Whatman 47 mm o rozmiarze porów 0,025 μm, który pływa na 250 ml 0,1X TE w zlewce. Ponieważ struktury replikacyjne z regionami jednoniciowymi lub punktami rozgałęzień są bardziej podatne na ścinanie, zazwyczaj odcinamy końcówki pipet żyletką, aby poszerzyć wlot i zminimalizować siły ścinające. Generalnie należy ograniczyć pipetowanie do minimum aż do momentu trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi.
- Każdą próbkę trawi się następnie enzymem PvuII (New England Biolabs), który linearyzuje plazmid tuż za miejscem inicjacji replikacji.
- Przed naniesieniem na żel agarozowy do każdej próbki dodaje się 100 μl chloroformu i 20 μl 6X barwnika do nakładania zawierającego błękit bromofenolowy i ksylen cyjanol, a następnie miesza. Następnie do żelu nanosi się 40 μl fazy wodnej z barwnikiem. Aby zminimalizować błędy strukturalne, artefakty strukturalne oraz ścinanie DNA, niniejsza procedura izolacji nie obejmuje żadnych kroków mających na celu wzbogacanie w regiony jednoniciowe, wytrącanie lub zagęszczanie próbek DNA po lizie komórek.
3. Analiza Southern i elektroforeza w żelu 2D.
- Analiza w 2-wymiarowym żelu agarozowym jest zmodyfikowaną wersją procedury 3. W 1. WYMIARZE próbki DNA poddane restrykcji są rozdzielane w żelu agarozowym 0,4% w 1X TBE przy napięciu 1V/cm. Jeden litr roztworu stokowego 10X TBE zawiera:
- 108 g Tris Base
- 55 g kwasu borowego
- 40 ml 0,5M EDTA (pH 8,0)
- W pierwszej ścieżce nanosi się marker wielkości lambda Hind III, a następnie próbki nanosi się w co drugiej ścieżce. Pierwszy wymiar prowadzimy zazwyczaj przez ~12-15 h. Pominięcie ścieżek ułatwia wycinanie pasm w celu odlania ich w drugim wymiarze. Niskie napięcie i niskie stężenie agarozy w żelu służą przede wszystkim do rozdzielenia fragmentów DNA na podstawie wielkości.
- W drugim wymiarze ścieżki żelowe są wycinane z żelu pierwszego wymiaru przy użyciu dużego noża rzeźnickiego. Pierwszą ścieżkę zawierającą marker lambda Hind III można barwić bromkiem etydyny. Używając markera lambda Hind III jako punktu odniesienia, wycina się i odrzuca fragment żelu znajdujący się poniżej miejsca, w którym spodziewamy się przejścia zlinearyzowanego plazmidu. W tych warunkach stwierdzamy, że zlinearyzowany pBR322 wędruje nieco powyżej barwnika xylene cyanol.
- Aby odlać drugi wymiar, każdą ścieżkę kładzie się poziomo na górze pustej formy do żelu. Przygotowuje się roztwór 1,0% agarozy w 1X TBE i schładza go do 55°C. Następnie wlewa się roztwór żelu, aby odlać drugi wymiar, dbając o całkowite przykrycie wycinków żelu. Po zastygnięciu żelu prowadzi się elektroforezę przy 6,5V/cm w urządzeniu do elektroforezy umożliwiającym recyrkulację buforu. Drugi wymiar prowadzimy zazwyczaj przez ~5,5-7 h. Wysokie napięcie i wysokie stężenie agarozy w żelu skutecznie rozdzielają fragmenty DNA na podstawie ich kształtu oraz wielkości. Formy nieliniowe wędrują wolniej w drugim wymiarze.
- Po elektroforezie żel płucze się w H2O, dwukrotnie przemywa w 400 ml 0,25M kwasu solnego przez 15 minut, płucze w H2O, a następnie dwukrotnie przemywa w 400 ml 0,4M NaOH przez 30 minut. Przemywanie kwasem służy do częściowego wprowadzenia nacięć (nicking) w cząsteczkach DNA, co rozbija je na mniejsze fragmenty, które przenoszą się wydajniej. Krok ten jest niezbędny ze względu na dużą wielkość i nietypowe kształty produktów pośrednich replikacji DNA.
- DNA z żeli jest następnie przenoszone na membranę nylonową Hybond N+ 4. Stosujemy system transferu alkalicznego w kierunku w dół z użyciem 0,4M NaOH. W skrócie, dwa arkusze papieru do blotingu nasączone 0,4M NaOH kładzie się na dużym stosie ręczników papierowych. Membrana nylonowa jest również nasączona 0,4M NaOH i kładzie się ją na papierze do blotingu. Następnie ostrożnie nakłada się na to żel, a na wierzch kolejny kawałek papieru do blotingu zwilżonego w roztworze NaOH. Na koniec na górze układa się długi pas zwilżonego papieru do blotingu, a jego dwa końce umieszcza się w naczyniach zawierających 1 L roztworu 0,4M NaOH, aby pełniły funkcję knota. Transfer DNA trwa zazwyczaj od 6 do 12 h.
- Membranę nylonową wyjmuje się, płucze przez 20-30 s w buforze 5X SSC i umieszcza w obrotowej butelce do hybrydyzacji zawierającej 10,5 ml roztworu do prehybrydyzacji. Następnie membranę inkubuje się w 42°C przy obrotach przez ponad 6 h. Roztwór do prehybrydyzacji:
- 5,0 ml formamidu
- 0,5 ml 20% SDS
- 2,5 ml 20X SSC*
- 2,0 ml 50X Denhardt's*
- 0,5 ml DNA z plemników łososia (10mg/ml)
*przepisy na SSC i Denhardt's znajdują się w 5
- Podczas okresu prehybrydyzacji 1 μg plazmidu pBR322 jest znakowany 32P metodą translacji nacięć (nick translation) zgodnie z protokołem dostarczonym przez Roche, przy użyciu alfa-znakowanego [32-P]-dCTP. Radioznakowaną sondę (100μl) denaturuje się poprzez inkubację w 98°C przez 10 minut w probówce do mikrocentryfugi z zakrętką, a następnie natychmiast umieszcza na lodzie.
- Zdenaturowaną sondę dodaje się do 5,9 ml roztworu do hybrydyzacji, który zawiera:
- 3,0 ml formamidu
- 1,5 ml SSC
- 1,0 ml H2O
- 0,15 ml 50X Denhardt's
- 0,10 ml 20% SDS
- 0,15 ml 10mg/ml DNA z plemników łososia
- Roztwór do prehybrydyzacji wylewa się z butelki obrotowej i wlewa roztwór do hybrydyzacji. Butelkę obrotową umieszcza się ponownie w inkubatorze w 42°C i obraca przez ponad 12 h.
- Roztwór do hybrydyzacji wylewa się z butelki obrotowej. Następnie blot przemywa się 4 razy po 20 minut w butelce obrotowej z ~150 ml roztworu piorącego zawierającego 0,5X SSC i 0,1% SDS w 42°C przy obrotach.
- Po ostatnim przemywaniu membranę kładzie się na ręczniku papierowym, aż płyn widocznie zniknie. Następnie membranę owija się folią z polichlorku winylu i eksponuje na ekran phosphorimager. Radioaktywność wizualizujemy i kwantyfikujemy przy użyciu urządzenia Storm 840 oraz powiązanego z nim oprogramowania ImageQuant.
4. Reprezentatywne wyniki:
Rysunek 1. Produkty pośrednie replikacji plazmidu obserwowane w obecności i przy braku uszkodzeń DNA indukowanych przez UV. Przedstawiono schemat wzoru migracji plazmidu pBR322 trawionego enzymem PvuII, obserwowanego w analizie w 2D-żelu agarozowym. Niereplikujące się plazmidy liniowe wędrują jako liniowy fragment 4.4-kb. Replikujące się plazmidy tworzą struktury w kształcie litery Y, które migrują wolniej niż fragmenty niereplikujące się ze względu na większy rozmiar i nieliniowy kształt. Ten wzór migracji tworzy łuk rozciągający się od obszaru liniowego w stronę dołka. Po napromieniowaniu UV w obszarze stożka obserwuje się cząsteczki w kształcie podwójnego Y lub litery X, które migrują wolniej niż łuk cząsteczek w kształcie Y. Przedstawiono przykład analizy Southern żelu 2D z użyciem sondy pBR322 znakowanej 32P dla komórek bezpośrednio po napromieniowaniu UV oraz 15 minut po napromieniowaniu UV (reprodukowano za zgodą wydawcy).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Typowe wyniki uzyskane z komórek typu dzikiego w obecności i przy braku uszkodzeń indukowanych promieniowaniem UV przedstawiono na Rysunku 1. W przypadku braku uszkodzeń, około 1% całkowitej ilości plazmidowego DNA znajduje się w łuku Y, gdy komórki szybko rosną w fazie wykładniczej. Po naświetlaniu obserwuje się przejściowy wzrost liczby cząsteczek w kształcie Y, co wynika z gromadzenia się zablokowanych widełek replikacyjnych w miejscach uszkodzeń. Intermediaty replikacyjne w kształcie X również gromadzą się przejściow...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Prace w naszym laboratorium są wspierane przez grant CAREER MCB0551798 z National Science Foundation oraz grant AREA R15GM86839 z NIGMS-NIH.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przykład analizy Southern żelu 2D po hybrydyzacji | GE Healthcare | G15T8 | Yellow Lighting |
| Lampa bakteriobójcza 15 μW | Sylvania | F20T12/GO | Lampa UV |
| Miernik natężenia UV Blak-Ray 254nm | Daigger | EF28195T | Fotometr UVC |
| Dyski porowe 0,025 μm | Whatman, GE Healthcare | VSWP04700 | Pływające dyski dializacyjne |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restrykcyjna endonukleaza |
| Zestaw do translacji nacięć (Nick-translation kit) | Roche Group | 976776 | Do przygotowania sondy znakowanej 32P |
| Papier do transferu | Whatman, GE Healthcare | 3030-704 | Do transferu Southern |
| Membrana nylonowa | GE Healthcare | RPN203S | Do transferu Southern |
Bibliografia
- Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli. Science. 299, 1064-1067 (2003).
- Friedman, K. L., Brewer, B. J. Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).
- Spivak, G., Hanawalt, P. C. Determination of damage and repair in specific DNA sequences. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning - A laboratory manual. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (2001).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli. J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli. Genetics. 166, 1631-1640 (2004).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli. J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).
- Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest. J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli. Radiat Res. 168, 499-506 (2007).
- Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions. Mutat Res. 645, 19-26 (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
