Test immunoenzymatyczny (ELISPOT): Kwantyfikacja odpowiedzi immunologicznej komórek Th-1 przeciwko antygenom drobnoustrojów

Summary

Identyfikacja celów mikrobiologicznych odporności adaptacyjnej w chorobach idiopatycznych może być dokonana za pomocą testu immunopunktowego połączonego z enzymem.

Abstract

Odporność adaptacyjna jest ważnym elementem usuwania patogenów wewnątrzkomórkowych. Zdolność do wykrywania i ilościowego określania tych reakcji u ludzi jest ważnym narzędziem diagnostycznym. Test immunoenzymatyczny immunopunktowy (ELISPOT) zyskuje na popularności ze względu na jego zdolność do identyfikowania komórkowych odpowiedzi immunologicznych przeciwko antygenom drobnoustrojów, w tym populacji z obniżoną odpornością, takich jak osoby z zakażeniem wirusem HIV, przeszczepami i stosowaniem sterydów. Test ten ma zdolność do ilościowego określenia odpowiedzi immunologicznych przeciwko określonym antygenom drobnoustrojów, a także do rozróżnienia, czy te odpowiedzi mają charakter Th1 czy Th2. ELISPOT nie ogranicza się do miejsca zapalenia. Jest wszechstronny pod względem zdolności do oceny odpowiedzi immunologicznych we krwi obwodowej, a także w miejscach aktywnego zaangażowania, takich jak płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, płyn mózgowo-rdzeniowy i wodobrzusze. Możliwe jest wykrycie odpowiedzi immunologicznej przeciwko jednemu lub wielu antygenom, a także specyficznym epitopom w białkach drobnoustrojów. Test ten ułatwia wykrywanie odpowiedzi immunologicznych w czasie, a także różnic w antygenach rozpoznawanych przez limfocyty T gospodarza. Dostępne są dwukolorowe testy ELISPOT do wykrywania jednoczesnej ekspresji dwóch cytokin. Ostatnie zastosowania tej techniki obejmują diagnostykę gruźlicy pozapłucnej, a także badanie udziału antygenów zakaźnych w chorobach autoimmunologicznych.

Protocol

Dla poniższego protokołu, używamy komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) jako komórek będących przedmiotem zainteresowania. Jednak ten protokół może być używany z innymi typami komórek. Wykonać test w kapturze do hodowli tkankowej przy użyciu sterylnej techniki.

Dzień 1: Przygotowanie płytki i komórek

1. Wyjmij płytkę ELISPOT i otwórz ją w masce.
2. Umyć płytkę 3 razy 150 μl 1X PBS za pomocą pipetora wielokanałowego, jeśli jest dostępny, w przeciwnym razie dopuszczalne jest pipetowanie jednodołkowe.
3. Wyjmij pakiet zbiorników i otwórz go w masce.
4. Dodaj 2 μg/ml przeciwciała wychwytującego, anty-ludzkiego interferonu-γ, do 11 ml 1X PBS. Dobrze wirować. Przenieść mieszaninę przeciwciał do zbiornika.
5. Umieścić 100 μl roztworu powlekającego w każdej studzience za pomocą wielokanałówki.
6. Owiń płytkę w parafolię.
7. Umieść talerz w lodówce na noc. Talerze są dobre przez tygodnie. Ogólna zasada jest taka, że jeśli w studzienkach nadal pozostaje płyn, można użyć płytki.

Przygotowanie komórek

Jeśli PBMC są świeże, policz komórki i inkubuj przez noc w temperaturze 37°C z 5% CO₂. W przypadku PBMC przechowywanego w ciekłym azocie konieczne jest rozmrożenie komórek. Protokół jest następujący:

1. Rozmrozić kriowialne komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37°C, aż do prawie całkowitego rozmrożenia.
2. Natychmiast zawiesić ponownie w 5 ml pożywki R10.
3. Wirować przez 5 minut w temperaturze 225 x g.
4. Ponownie zawiesić w 5 ml pożywki R10 i policzyć żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego.
5. Doprowadzić stężenie do 2 x 10⁶ komórek/ml w pożywce R10.
6. Odpoczywaj przez noc w temperaturze 37°C z 5% CO₂ .

Dzień 2: Ustawianie płyty

1. Na pokrywie płytki etykietowej umieścić numer identyfikacyjny próbki, stan studzienki i datę.
2. Umyj płytkę 6 razy 150 μL sterylnego 1x PBS metodą dump and blot. Uważaj, aby nie zachlapać talerza podczas zrzucania. Może to spowodować, że dołki płytki zmienią kolor na fioletowy.
3. Dodaj 100 μl R20 do każdej studzienki.
4. Inkubować płytkę w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.
5. Podczas inkubacji płytki policz komórki, które odpoczywały przez noc.
6. Obracaj zawiesinę ogniw z prędkością 1500 obr./min przez 5 minut. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad, aby uzyskać końcowe stężenie 1X10⁶ komórek na 1 ml w pożywce R10.
7. Po 1-godzinnej inkubacji usunąć R20 metodą dump and blot. Uważaj, aby nie zachlapać talerza podczas zrzucania.
8. Dodaj 100 μl roztworu komórkowego (10⁵ komórek) do każdej studzienki. Dodaj odpowiednie peptydy i/lub antygeny do odpowiednich studzienek w dwóch egzemplarzach. Używaj nowej końcówki do pipety za każdym razem, gdy wchodzisz do roztworu roboczego peptydu. Normalne stężenie peptydów wynosi 10-40 μg/ml. Ponieważ peptydy różnią się między sobą, każdy badacz powinien miareczkować peptydy, aby uzyskać optymalne wyniki.
9. W studzienkach kontroli ujemnej dodaj tylko komórki (bez peptydów)
10. W studzienkach kontroli dodatniej dodać fitohemaglutyninę (PHA; 10 μg/ml; Sigma).
11. Inkubować przez noc w temperaturze 37°C z 5% CO₂ (~18 godzin).

Dzień 3: Opracowanie płyty

1. Umyj płytkę 6 razy 150 μL 1xPBS metodą dump and blot.
2. Dodać 100 μl PBS do każdego dołka płytki za pomocą pipetora wielokanałowego.
3. Wstaw talerz do lodówki na 15 minut.
4. Wyjmij płytkę z lodówki i umieść ją w kapturze do hodowli tkankowych.
5. Przygotuj roztwór przeciwciała biotyny
   • Dodaj 0,5 μg/ml przeciwciała biotyny (mAB 7-B6-1) do 11 ml PBS.
   • Odwiruj roztwór, aby dobrze wymieszać.
   • Jeśli planujesz dodać roztwór za pomocą wielokanałowego, wlej go do zbiornika.
6. Wyrzuć PBS, wrzucając go do kosza na śmieci. Uważaj, aby nie zachlapać talerza podczas zrzucania.
7. Umieścić 100 μl roztworu w każdym dołku.
8. Inkubować płytkę w kapturze do hodowli tkankowej w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.
9. Umyj płytkę 6 razy 150 μl 1xPBS metodą dump and blot. Po 6^praniu należy pozostawić PBS na płytce do momentu przygotowania przeciwciała przeciwko streptawidynie.
10. Przygotować przeciwciało przeciwko streptawidynie.
    • Dodać 5,5 μ l przeciwciała przeciwko streptawidynie (Streptawidyna-ALP) do 11 ml PBS (rozcieńczenie 1:2000).
    • Odwiruj roztwór, aby dobrze wymieszać.
    • Jeśli planujesz dodać roztwór za pomocą wielokanałowego, wlej go do zbiornika.
11. Wyrzuć PBS pozostały w studzienkach i osusz płytkę.
12. Do każdej studzienki dodać 100 μl roztworu streptawidyny.
13. Inkubować płytkę w kapturze do hodowli tkankowej w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
14. Umyj talerze 6 razy PBS metodą dump and blot. W 6^praniu pozostaw PBS na talerzu, aż zrobisz roztwór kolorystyczny.
15. Praca w ciemności. Przygotować roztwór substratu fosfatazy alkalicznej (zestaw substratu fosfatazy alkalicznej IV BCIP/NBT):
    • Dodać 4 krople odczynnika substratowego 1 do 11 ml buforu Tris, dobrze zawirować. Dodaj 4 krople odczynnika substratowego 2 do buforu Tris, dobrze zawiruj. Dodaj 4 krople odczynnika substratowego 3 do buforu Tris, dobrze odwiruj.
16. Wyrzuć pozostały PBS i osusz płytkę.
17. Dodać 100 μl roztworu barwnego do każdego dołka płytki za pomocą wielokanałowego.
18. Włącz światło po 5 do 10 minutach rozwijania koloru.
19. Pozwól, aby odczynniki barwiące pozostały na płytce, aż plamy zaczną zmieniać kolor na fioletowy i staną się dość ciemne. Powinno to zająć od 5 do 20 minut. Uważaj, aby nie pozostawić roztworu podłoża zbyt długo, ponieważ może to spowodować wysokie tło.
20. Umyj płytkę ELISPOT 3 razy wodą z kranu.
21. Pozostaw do wyschnięcia na około godzinę lub na noc.
22. Odczyt płytki ręcznie lub za pomocą czytnika płytek ELISPOT.
23. Przechowuj płytkę w pudełku z dala od światła nasłonecznienego.

Reprezentatywne wyniki:

ELISPOT jest przeznaczony do ilościowego określania odpowiedzi immunologicznej przeciwko antygenom mikrobiologicznym. Każda plamka wskazuje pojedynczą reagującą komórkę, wyrażającą interesującą nas cytokinę. Plamki można zliczać ręcznie lub za pomocą czytnika płytek ELISPOT.

Ocena, czy test ELISPOT został wykonany prawidłowo, powinna rozpocząć się od zbadania negatywnej kontroli produkcji tła interesującej nas cytokiny. W studzienkach kontroli ujemnej można by się spodziewać, że nie będzie żadnych plam, chociaż może być obecne niewielkie tło (kolor fioletowy). Zazwyczaj na studzienkę powinno przypadać mniej niż średnio pięć miejsc. Studzienki kontroli pozytywnej potwierdzają, że reakcja została przeprowadzona prawidłowo, a komórki reagują na stymulację antygenową. W studzienkach kontroli pozytywnej można spodziewać się ciemnofioletowego tła z powodu zbiegania się plam (ryc. 1). Białe tło powinno być niewielkie lub żadne. Jeśli próbki kontroli pozytywnej i kontroli ujemnej są odpowiednie, można następnie policzyć studzienki zawierające interesujący nas antygen. "Nieoptymalny" wynik byłby odzwierciedlony przez wysokie tło (studzienki są fioletowe), brak plam lub bardzo mało plam, pusty środek, słabo zdefiniowane plamy lub zbiegające się plamy. Znajduje się tam lista wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów (Tabela 1).

Rysunek 1. Przedstawiciel płyty ELISPOT. Każda płytka powinna zawierać kontrolę dodatnią, kontrolę ujemną i peptyd będący przedmiotem zainteresowania przeprowadzony co najmniej w dwóch studzienkach. C9, C10, D9 i D10 to studzienki kontroli pozytywnej, jak widać, jest ciemnofioletowy kolor, zbiegające się komórki i prawie nie ma białego tła. Studzienki kontroli ujemnej to G11, G12, H11 i H12. Te studnie nie mają fioletowego tła ani plam, zgodnie z oczekiwaniami. Plamki G7, G8, H7 i H8 ilustrują odpowiedzi komórkowe na peptydy drobnoustrojów; Fioletowe plamki reprezentują pojedynczą reagującą komórkę wyrażającą interesującą cytokinę.

Tabela 1

obserwacja Możliwy problem Możliwe rozwiązanie Wysokie tło 1. Obie strony membrany nie są prawidłowo umyte
2. Zbyt wiele komórek wydzielających cytokinę
3. Talerz nie jest prawidłowo wysuszony
4. Nadmiernie rozwinięta płyta 1. Umyj obie strony membrany wodą destylowaną przed i po opracowaniu koloru. Odczynniki mogą przeciekać przez membranę do podstawy płytki, a te mogą powodować wysokie tło, jeśli nie zostaną zmyte.
2. Zmniejsz liczbę komórek w studzience, będzie to wymagało optymalizacji
3. Suszyć płytkę dłużej przed odczytaniem
4. Skróć czas opracowywania Brak plam/Bardzo mało miejsc 1. Za mało komórek wydzielających cytokinę/białko będące przedmiotem zainteresowania
2. Upewnij się, że komórki są prawidłowo stymulowane
3. Komórki nie inkubowane wystarczająco długo lub mogą potrzebować czasu, aby zareagować na stymulant
4. Nieodpowiednie opracowanie koloru
5. Za mało przeciwciał pierwszorzędowych lub drugorzędowych 1. Zwiększ liczbę komórek. Będzie to wymagało optymalizacji
2. Stosuj również pozytywną kontrolę stymulacji - stymulant, o którym wiesz, że wywoła ekspresję interesującej Cię cytokiny / białka
3. Wydłuż czas inkubacji komórek lub użyj metody pośredniej (wstępne potraktowanie komórek stymulantem)
4. Monitoruj rozwój koloru za pomocą mikroskopu górnego i upewnij się, że odczynniki wywołujące były prawidłowo przechowywane i nie straciły aktywności
5. Konieczne będzie zwiększenie stężenia przeciwciała pierwszorzędowego i/lub drugorzędowego. Będzie to wymagało optymalizacji. Puste obszary 1. Membrana nie poddana wstępnej obróbce
2. Membrana wyschła na pewnym etapie
3. Komórki nierównomiernie rozmieszczone 1. Upewnij się, że membrana jest odpowiednio wstępnie potraktowana 70% etanolem (wszystkie membrany tego nie potrzebują, więc skontaktuj się z dostawcą). Następnie dobrze umyć PBS 3X
2. Upewnij się, że membrana nie wysycha
3. Upewnij się, że delikatnie wymieszałeś komórki, aby uzyskać dobrą homologiczną zawiesinę komórek przed pipetowaniem do studzienek Pusty środek 1. Uszkodzenia spowodowane praniem 1. Natężenie przepływu w myjce automatycznej (lub pipetowaniu) może być zbyt wysokie. Potrzebujesz delikatniejszej procedury prania Wyniki fałszywie dodatnie 1. Agregaty przeciwciał drugorzędowych
2. Komórki nadal na błonie
3. Zanieczyszczenie kultur komórkowych 1. Przefiltruj przeciwciało wtórne
2. Upewnij się, że wszystkie komórki zostały wypłukane z błony za pomocą PBS Tween 20 przed wtórną inkubacją przeciwciał. Komórki pozostawione na błonie dadzą plamki o nieregularnym kształcie
3. Utrzymuj odczynniki tak sterylne i czyste, jak to tylko możliwe. Upewnij się, że technika hodowli komórkowej jest aseptyczna. Sprawdź, czy nie ma wyników fałszywie dodatnich, uruchamiając kontrolę ujemną pożywki. Aby uzyskać informacje o ruchu płyty, zobacz słabo zdefiniowane miejsca Zlewające się plamy 1. Słaba powłoka, za dużo przeciwciał
2. Przedłużona hodowla komórkowa
3. Komórki nadmiernie stymulowane 1. Zmniejsz stężenie przeciwciał pierwszorzędowych
2. Im dłużej komórki są inkubowane, tym więcej cytokin / białka będą wydzielać. Spowoduje to powstanie większych plam, które zaczną się łączyć i staną się nie do odróżnienia.
3. Skróć czas inkubacji etapu hodowli komórkowej. Nadmierna stymulacja spowoduje, że komórka będzie wydzielać dużo cytokin/białka. Spowoduje to powstanie plam, które zaczną się łączyć i staną się nie do odróżnienia. Zmniejsz ilość stymulantu w pożywce hodowlanej lub kulturze przez krótszy czas Słabo zdefiniowane plamy 1. Membrana nie jest wstępnie obrobiona (jeśli Twoja membrana tego wymaga, skontaktuj się z dostawcą)
2. Ruch płytki podczas inkubacji komórek 1. Membrana musi być wstępnie potraktowana etanolem, w przeciwnym razie może to spowodować rozmyte, słabo zdefiniowane plamy. Czytelnikowi trudno będzie je rozróżnić
2. Nie pozwól, aby płytka poruszała się podczas inkubacji komórek, ponieważ komórki, które się przesunęły, utworzą więcej niż jedną plamkę. Jeśli to możliwe, użyj dedykowanego inkubatora, który nie zostanie otwarty podczas inkubacji. Nie stukaj w płytkę po dodaniu komórek Studzienki kontroli pozytywnej są niskie 1. Niedorozwój - może być wynikiem stosowania roztworów Streptavidin-ALP i/lub BCIP/NBT, które nie zostały doprowadzone do temperatury pokojowej 1. Doprowadź odczynniki do temperatury pokojowej przed dodaniem do studzienek Gęstość plam utrudnia ich ilościowe określenie 1. Do studzienek dodano zbyt wiele komórek 1. Wykonaj rozcieńczenia komórek (tj. 1 x 10⁶, 5 x 10⁵, 1 x 10⁵, 5 x 10⁴, 1 x 10⁴ komórki na studzienkę), aby określić optymalną liczbę komórek, która spowoduje powstanie wyraźnych plamek

Discussion

Test ELISPOT stał się jednym z najważniejszych i najszerzej stosowanych testów do monitorowania odpowiedzi immunologicznej u ludzi i wielu innych gatunków. Dzięki testowi ELISPOT częstość występowania komórek odpornościowych może być mierzona na poziomie pojedynczej komórki bez konieczności ekspansji lub manipulacji populacjami komórek. Test ELISPOT jest szeroko stosowany do badania specyficznych dla antygenu odpowiedzi immunologicznych w różnych chorobach, w tym infekcjach, nowotworach, alergiach i chorobach autoimmuno...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A. Przygotowanie mediów
B. Przygotowanie bufora Tris
Dodać 800 ml ddH2O do 1 l zlewki. Odmierzyć 12 gramów Tris i dodać do zlewki. Dodać 0,12 grama sześciowodnego chlorku magnezu (MgCl2:6H2O) do zlewki. Wymieszać za pomocą mieszadła magnetycznego na automatycznej płycie mieszającej. Po rozpuszczeniu pH roztworu do 9,5. Dodać 200 ml ddH2O do zlewki, doprowadzając do 1000 ml. Przefiltrować roztwór za pomocą 0,22 μ m filter.
C. Materiały niezbędne do analizy ELISPOT: