Test immunospot z enzymatycznym sprzężeniem (ELISPOT): Ilościowe oznaczenie komórkowych odpowiedzi immunologicznych Th-1 przeciwko antygenom mikrobiologicznym

Podsumowanie

Identyfikacja mikrobiologicznych celów odporności adaptacyjnej w chorobach idiopatycznych może zostać przeprowadzona przy użyciu testu ELISpot (enzyme-linked immunospot assay).

Streszczenie

Odporność adaptacyjna jest istotnym elementem eliminacji patogenów wewnątrzkomórkowych. Zdolność do wykrywania i ilościowego określania tych odpowiedzi u ludzi stanowi ważne narzędzie diagnostyczne. Test immunospot z zastosowaniem enzymów (ELISPOT) zyskuje na popularności dzięki możliwości identyfikacji komórkowych odpowiedzi immunologicznych przeciwko antygenom drobnoustrojów, w tym w populacjach z immunosupresją, takich jak osoby z zakażeniem HIV, po transplantacji oraz stosujące sterydy. Test ten pozwala na ilościowe określenie odpowiedzi immunologicznych przeciwko specyficznym antygenom drobnoustrojów, a także na rozróżnienie, czy odpowiedzi te mają charakter Th1 czy Th2. Metoda ELISPOT nie jest ograniczona do miejsca stanu zapalnego. Jest wszechstronna i umożliwia ocenę odpowiedzi immunologicznych we krwi obwodowej, jak i w miejscach aktywnego procesu zapalnego, takich jak płukanie pęcherzyków płucnych, płyn mózgowo-rdzeniowy i wysięk w jamie brzusznej. Możliwe jest wykrywanie odpowiedzi immunologicznych przeciwko pojedynczemu lub wielu antygenom, a także przeciwko specyficznym epitopom w białkach drobnoustrojów. Test ten ułatwia monitorowanie odpowiedzi immunologicznych w czasie oraz rozróżnianie antygenów rozpoznawanych przez limfocyty T gospodarza. Dostępne są dwukolorowe testy ELISPOT do jednoczesnego wykrywania ekspresji dwóch cytokin. Niedawne zastosowania tej techniki obejmują diagnostykę gruźlicy pozapłucnej oraz badanie wpływu antygenów zakaźnych na rozwój chorób autoimmunizacyjnych.

Protokół

W poniższym protokole jako komórki docelowe wykorzystano mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC). Protokół ten można jednak zastosować również w przypadku innych typów komórek. Analizę należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza, stosując technikę sterylną.

Dzień 1: Przygotowanie płytki i komórek

1. Wyjąć płytkę ELISPOT i otworzyć ją w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
2. Przemyć płytkę 3 razy 150 μL 1X PBS, używając pipety wielokanałowej, jeśli jest dostępna; w przeciwnym razie dopuszczalne jest pipetowanie pojedynczych dołków.
3. Wyjąć opakowanie zbiorników i otworzyć je w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
4. Dodać 2 μg/mL przeciwciała wychwytującego, anty-ludzkiego Interferonu-γ, do 11 mL 1X PBS. Dokładnie wymieszać na wirówce typu vortex. Przenieść mieszaninę przeciwciał do zbiornika.
5. Nanieść 100 μL roztworu powlekającego do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej.
6. Owinąć płytkę parafilmem.
7. Umieścić płytkę w lodówce na noc. Płytki zachowują trwałość przez kilka tygodni. Przyjmuje się, że jeśli w dołkach wciąż znajduje się ciecz, płytka nadaje się do użycia.

Przygotowanie komórek

Jeśli PBMC są świeże, należy policzyć komórki i inkubować je przez noc w temperaturze 37°C przy 5% CO₂. W przypadku PBMC przechowywanych w ciekłym azocie konieczne jest rozmrożenie komórek. Protokół przebiega w następujący sposób:

1. Rozmrozić krio probówkę z komórkami w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C, aż zostaną niemal całkowicie rozmrożone.
2. Natychmiast resuspendować w 5 mL pożywki R10.
3. Wirować przez 5 minut przy 225 x g.
4. Ponownie resuspendować w 5 mL pożywki R10 i policzyć żywe komórki przy użyciu błękitu trypanu.
5. Dostosować stężenie do 2 x 10⁶ komórek/mL w pożywce R10.
6. Inkubować przez noc w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO₂.

Dzień 2: Przygotowanie płytki

1. Oznacz pokrywkę płytki numerem identyfikacyjnym próbki, warunkami w dołkach oraz datą.
2. Przemyj płytkę 6 razy 150 μL sterylnego 1x PBS, stosując metodę odlewania i osuszania (dump and blot). Należy uważać, aby nie rozpryskać zawartości podczas odlewania, ponieważ może to spowodować zabarwienie dołków płytki na fioletowo.
3. Dodaj 100 μL medium R20 do każdego dołka.
4. Inkubuj płytkę w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.
5. Podczas inkubacji płytki policz komórki, które odpoczywały przez noc.
6. Wirować zawiesinę komórkową z prędkością 1500 rpm przez 5 minut. Odlej nadosad i resuspenduj osad tak, aby uzyskać końcowe stężenie 1X10⁶ komórek na 1mL w medium R10.
7. Po 1-godzinnej inkubacji usuń medium R20 metodą odlewania i osuszania. Należy uważać, aby nie rozpryskać zawartości podczas odlewania.
8. Dodaj 100 μL roztworu komórek (10⁵ komórek) do każdego dołka. Dodaj odpowiednie peptydy i/lub antygeny do odpowiadających im dołków w duplikacie. Używaj nowej końcówki do pipety za każdym razem, gdy pobierasz roztwór roboczy peptydu. Standardowe stężenie peptydów wynosi 10-40 μg/mL. Ze względu na zróżnicowanie peptydów, każdy badacz powinien miareczkować peptydy w celu uzyskania optymalnych wyników.
9. W dołkach kontroli negatywnej dodaj tylko komórki (bez peptydów).
10. W dołkach kontroli pozytywnej dodaj fitohemaglutyninę (PHA; 10 μg/mL; Sigma).
11. Inkubuj przez noc w temperaturze 37°C z 5% CO₂ (~18 godzin).

Dzień 3: Wywoływanie płytki

1. Płytkę należy przemyć 6 razy 150 μL 1xPBS, stosując metodę wylewania i osuszania (dump and blot).
2. Do każdego dołka płytki należy dodać 100 μL PBS za pomocą pipety wielokanałowej.
3. Płytkę należy wstawić do lodówki na 15 minut.
4. Płytkę należy wyjąć z lodówki i umieścić w komorze do hodowli tkanek.
5. Przygotowanie roztworu przeciwciał biotynylowanych:
   • Do 11 mL PBS należy dodać 0,5 μg/mL przeciwciał biotynylowanych (mAB 7-B6-1).
   • Roztwór należy wymieszać za pomocą wstrząsarki vortex.
   • W przypadku planowania aplikacji roztworu pipetą wielokanałową, należy przelać go do zbiornika.
6. Pozostały PBS należy usunąć, wylewając go do pojemnika na odpady. Należy uważać, aby nie rozpryskać zawartości podczas wylewania.
7. Do każdego dołka należy nanieść 100 μL roztworu.
8. Płytkę należy inkubować w komorze do hodowli tkanek w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę.
9. Płytkę należy przemyć 6 razy 150 μL 1xPBS, stosując metodę wylewania i osuszania. Po 6^tym płukaniu PBS należy pozostawić na płytce do czasu przygotowania przeciwciał streptawidynowych.
10. Przygotowanie przeciwciał streptawidynowych:
    • Do 11 mL PBS należy dodać 5,5 μl przeciwciał streptawidynowych (Streptavidin-ALP) (rozcieńczenie 1:2000).
    • Roztwór należy wymieszać za pomocą wstrząsarki vortex.
    • W przypadku planowania aplikacji roztworu pipetą wielokanałową, należy przelać go do zbiornika.
11. Pozostały w dołkach PBS należy usunąć, a płytkę osuszyć.
12. Do każdego dołka należy dodać 100 μL roztworu streptawidyny.
13. Płytkę należy inkubować w komorze do hodowli tkanek w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
14. Płytki należy przemyć 6 razy PBS, stosując metodę wylewania i osuszania. Po 6^tym płukaniu PBS należy pozostawić na płytce do czasu przygotowania roztworu barwiącego.
15. Prace należy prowadzić w ciemności. Przygotowanie roztworu substratu fosfatazy alkalicznej (Alkaline Phosphatase Substrate Kit IV BCIP/NBT):
    • Do 11 mL buforu Tris należy dodać 4 krople odczynnika substratowego 1 i dobrze wymieszać na wstrząsarce vortex. Następnie dodać 4 krople odczynnika substratowego 2 do buforu Tris i ponownie wymieszać. Na koniec dodać 4 krople odczynnika substratowego 3 do buforu Tris i ponownie wymieszać na wstrząsarce vortex.
16. Pozostały PBS należy usunąć, a płytkę osuszyć.
17. Do każdego dołka płytki należy nanieść 100 μL roztworu barwiącego za pomocą pipety wielokanałowej.
18. Światło należy zapalić po 5 do 10 minutach rozwoju barwy.
19. Odczynniki barwiące należy pozostawić na płytce, aż plamki zaczną zmieniać kolor na fioletowy i staną się ciemne. Powinno to zająć od 5 do 20 minut. Należy uważać, aby nie pozostawić roztworu substratu zbyt długo, gdyż może to spowodować wysokie tło.
20. Płytkę ELISPOT należy przemyć 3 razy wodą z kranu.
21. Płytkę należy pozostawić do wyschnięcia na około godzinę lub na całą noc.
22. Odczyt płytki należy przeprowadzić manualnie lub za pomocą czytnika płytek ELISPOT.
23. Płytkę należy przechowywać w pudełku, chroniąc ją przed ekspozycją na światło.

Reprezentatywne wyniki:

Metoda ELISPOT służy do ilościowego oznaczania odpowiedzi immunologicznej przeciwko antygenom mikrobiologicznym. Każda plamka wskazuje na pojedynczą komórkę reagującą, która wydziela analizowaną cytokinę. Plamki można liczyć ręcznie lub za pomocą czytnika płytek ELISPOT.

Ocena prawidłowości wykonania testu ELISPOT powinna rozpocząć się od zbadania kontroli negatywnej pod kątem tła produkcji analizowanej cytokiny. W studzienkach kontroli negatywnej nie powinno być widocznych plamek, choć może wystąpić niewielkie tło (kolor fioletowy). Zazwyczaj średnia liczba plamek na studzienkę powinna być mniejsza niż pięć. Studzienki kontroli pozytywnej potwierdzają, że reakcja przebiegła prawidłowo, a komórki reagują na stymulację antygenową. W studzienkach kontroli pozytywnej należy spodziewać się intensywnie fioletowego tła wynikającego ze zlewania się plamek (Rys. 1). Tło białe powinno być minimalne lub nieobecne. Jeśli próbki kontroli pozytywnej i negatywnej są prawidłowe, można przystąpić do zliczenia plamek w studzienkach zawierających analizowany antygen. Wynik „suboptymalny” objawia się wysokim tłem (studzienki są fioletowe), brakiem lub bardzo małą liczbą plamek, pustym środkiem, słabo zdefiniowanymi plamkami lub plamkami zlewającymi się. Lista wskazówek dotyczących rozwiązywania problemów została przedstawiona w Tabeli 1.

Rycina 1. Reprezentatywny obraz płytki ELISPOT. Każda płytka powinna zawierać kontrolę pozytywną, kontrolę negatywną oraz wybrany peptyd, przy czym badanie należy przeprowadzić w co najmniej dwóch dołkach. Dołki C9, C10, D9 i D10 stanowią kontrolę pozytywną; widoczny jest w nich głęboki fioletowy kolor, zlane komórki i niemal całkowity brak białego tła. Dołki kontroli negatywnej to G11, G12, H11 i H12. Zgodnie z oczekiwaniami, w dołkach tych nie występuje fioletowe tło ani plamki. Plamki w dołkach G7, G8, H7 i H8 obrazują odpowiedzi komórkowe na peptydy mikrobiologiczne; fioletowe plamki reprezentują pojedyncze komórki odpowiadające poprzez ekspresję badanej cytokiny.

Tabela 1

Obserwacja	Możliwy problem	Możliwe rozwiązanie
Wysokie tło	1. Niewłaściwe wypłukanie obu stron membrany 2. Zbyt duża liczba komórek wydzielających cytokiny 3. Płytka niedostatecznie wysuszona 4. Prześwietlona płytka	1. Obie strony membrany należy przemyć wodą destylowaną przed i po wywołaniu barwy. Odczynniki mogą przesiąkać przez membranę do podstawy płytki, co w przypadku braku wypłukania może spowodować wysoki poziom tła. 2. Zmniejszyć liczbę komórek na dołek; będzie to wymagało optymalizacji 3. Suszyć płytkę dłużej przed odczytem 4. Skrócenie czasu wywoływania
Brak plamek/Bardzo mało plamek	1. Niewystarczająca liczba komórek wydzielających interesującą cytokinę/białko 2. Upewnij się, że komórki zostały prawidłowo stymulowane 3. Komórki nie były inkubowane wystarczająco długo lub mogą potrzebować czasu na odpowiedź na stymulator 4. Niewystarczający rozwój barwy 5. Niewystarczająca ilość przeciwciała pierwszorzędowego lub drugorzędowego	1. Zwiększyć liczbę komórek. Wymaga to optymalizacji 2. Należy również zastosować pozytywną kontrolę stymulacji – stymulant, o którym wiadomo, że indukuje ekspresję badanego cytokiny/białka 3. Wydłużyć czas inkubacji komórek lub zastosować metodę pośrednią (wcześniejsze traktowanie komórek stymulatorem) 4. Monitoruj rozwój barwy za pomocą mikroskopu odgórnego i upewnij się, że odczynniki do wywoływania były przechowywane prawidłowo i nie utraciły swojej aktywności 5. Konieczne będzie zwiększenie stężenia przeciwciała pierwszorzędowego i/lub drugorzędowego. Wymaga to optymalizacji.
Obszary puste	1. Membrana niepoddana wstępnej obróbce 2. Membrana w pewnym momencie wyschła 3. Nierównomierne rozmieszczenie komórek	1. Należy upewnić się, że membrana została odpowiednio poddana wstępnej obróbce 70% etanolem (nie wszystkie membrany wymagają tego etapu, dlatego należy sprawdzić informacje u dostawcy). Następnie membranę należy dokładnie przemyć trzy razy w PBS. 2. Należy dopilnować, aby membrana nie wyschła 3. Należy delikatnie wymieszać komórki, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórkową przed pipetowaniem ich do dołków.
Puste centrum	1. Uszkodzenia powstałe w wyniku płukania	1. Przepływ w automatycznej myjce (lub podczas pipetowania) może być zbyt wysoki. Wymagane jest zastosowanie łagodniejszej procedury płukania.
Wyniki fałszywie dodatnie	1. Agregaty przeciwciał wtórnych 2. Komórki pozostałe na membranie 3. Kontaminacja hodowli komórkowych	1. Przefiltruj przeciwciało wtórne 2. Przed inkubacją z przeciwciałem wtórnym należy upewnić się, że wszystkie komórki zostały wypłukane z membrany za pomocą buforu PBS Tween 20. Komórki pozostałe na membranie spowodują powstanie plam o nieregularnych kształtach. 3. Odczynniki należy utrzymać w jak największej sterylności i czystości. Należy upewnić się, że technika hodowli komórkowej jest aseptyczna. W celu wykluczenia wyników fałszywie dodatnich należy przeprowadzić kontrolę negatywną z użyciem medium. W przypadku przemieszczania płytek, widoczne słabo zdefiniowane plamki
Zlewające się plamki	1. Niewłaściwa powłoka, zbyt duża ilość przeciwciał 2. Przedłużona hodowla komórek 3. Komórki nadstymulowane	1. Zmniejszyć stężenie przeciwciała pierwszorzędowego 2. Im dłużej komórki są inkubowane, tym więcej cytokin/białek wydzielają. Będzie to skutkować powstaniem większych plamek, które zaczną się zlewać i staną się nierozróżnialne. 3. Skróć czas inkubacji na etapie hodowli komórkowej. Nadmierna stymulacja spowoduje wydzielenie przez komórki dużej ilości cytokin/białek. Doprowadzi to do powstania plamek, które zaczną się zlewać i staną się nierozróżnialne. Zmniejsz ilość stymulatora w pożywce lub skróć czas hodowli.
Niewyraźne plamki	1. Membrana niepoddana wstępnej obróbce (jeśli membrana wymaga takiej procedury, należy sprawdzić informacje u dostawcy) 2. Przesuwanie płytek podczas inkubacji komórek	1. Membranę należy uprzednio potraktować etanolem, w przeciwnym razie mogą powstać rozmyte, słabo zdefiniowane plamki. Będzie to utrudniać ich rozróżnienie przez badacza. 2. Nie dopuszczać do przesuwania się płytki podczas inkubacji komórek, ponieważ komórki, które ulegną przemieszczeniu, stworzą więcej niż jedną plamkę. Jeśli to możliwe, należy użyć dedykowanego inkubatora, który nie będzie otwierany w czasie inkubacji. Nie opukiwać płytki po dodaniu komórek.
Sygnał w studzienkach kontroli pozytywnej jest niski	1. Niedostateczny wywołać – może być wynikiem zastosowania roztworów Streptawidyny-ALP i/lub BCIP/NBT, które nie zostały doprowadzone do temperatury pokojowej	1. Przed dodaniem do dołków doprowadzić odczynniki do temperatury pokojowej
Gęstość plamek utrudnia ich kwantyfikację	1. Do dołków dodano zbyt wiele komórek	1. Przygotować rozcieńczenia komórek (tj. 1 x 106, 5 x 105, 1 x 105, 5 x 104, 1 x 104 komórek na dołek), aby określić optymalną liczbę komórek, która pozwoli na utworzenie wyraźnych skupisk (spotów)

Dyskusja

Test ELISPOT stał się jednym z najważniejszych i najszerzej stosowanych testów do monitorowania odpowiedzi immunologicznych u ludzi oraz u wielu innych gatunków. Dzięki testowi ELISPOT częstotliwość występowania komórek odpornościowych można mierzyć na poziomie pojedynczych komórek, bez konieczności ekspansji lub manipulacji populacjami komórkowymi. Test ELISPOT był szeroko stosowany do badania swoistych odpowiedzi immunologicznych na antygeny w różnych schorzeniach, w tym w infekcjach, nowotworach, alergiach i chorobach...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
A. Przygotowanie pożywek
B. Przygotowanie buforu Tris
Wlać 800 ml ddH2O do zlewki o pojemności 1 L. Odważyć 12 g Trisu i dodać do zlewki. Dodać do zlewki 0,12 g sześciowodnego chlorku magnezu (MgCl2:6H2O). Mieszać za pomocą magnetycznego mieszadła na automatycznej płycie grzejno-mieszalnej. Po rozpuszczeniu składników dostosować pH roztworu do 9,5. Dodać do zlewki 200 mL ddH2O, aby uzyskać objętość 1000 mL. Przefiltrować roztwór przez filtr o rozmiarze porów 0,22 μm.
C. Materiały niezbędne do analizy ELISPOT: