$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Indukcja i monitorowanie przewlekłego nawracającego EAE
Emulsja jest mieszaniną w stosunku 1:1 antygenu w roztworze wodnym dodanego do uzupełnionego pełnego adjuwantu Freunda. Bardzo ważne jest, aby dodawać antygen do adjuwantu, a nie odwrotnie!!!
Podczas przygotowywania i wstrzykiwania emulsji powstaje dużo odpadów. Zawsze przygotowuj 1,5 lub 2 razy więcej materiału, niż jest potrzebne.
Należy używać autoklawowanego moździerza, tłuczka, szklanych strzykawek i mostków. Wszystkie elementy plastikowe powinny być sterylne. Przygotowanie można przeprowadzić na zwykłym stole laboratoryjnym.
1. Przygotowanie suplementowanego adiuwantu
Odważ 30 mg Mycobacterium tuberculosis (numer katalogowy Difco # 231141) i umieść w moździerzu. Rozetrzyj na drobny proszek, nie naciskając zbyt mocno, aby uniknąć rozbicia bakterii. Dodaj 10 ml kompletnego adjuwantu Freunda H37Ra (numer katalogowy Difco # 231131) i wymieszaj. Tak uzupełniony adjuwant zawiera obecnie 4 mg/ml Mycobacterium tuberculosis. Przenieś zawartość do probówki.
2. Przygotowanie homogenatu rdzenia kręgowego
Pobrać rdzenie kręgowe od szczurów DA (bez względu na wiek i płeć) i przechowywać je w zamrożeniu w temperaturze -80°C. Zważyć zamrożone rdzenie kręgowe, aby uzyskać ilość pozwalającą na zmieszanie w stosunku 1:1 (masa:objętość) z uzupełnionym adiuwantem. Posiekać rdzenie kręgowe tak drobno, jak to możliwe, za pomocą żyletki, przenieść do moździerza użytego w sekcji 1 i przygotować pastę za pomocą tłuczka.
3. Przygotowanie emulsji
- Do probówki wlać uzupełniony kompletny adiuwant Freunda. Mieszać w wortexerze z wysoką prędkością. Kroplami dodawać homogenizat rdzenia kręgowego podczas wortexowania. Po dodaniu całego homogenizatu rdzenia kręgowego wortexować przez kolejne 5 minut. Mieszanina powinna zmienić kolor na jasnoróżowy.
- Emulsję przenieść do szklanej strzykawki o pojemności 5 ml i połączyć ją z drugą szklaną strzykawką 5 ml za pomocą mostka 18G (katalog Fisher nr 14-825-17L). Przesyłać emulsję z jednej strzykawki do drugiej, aż stanie się gęsta (5-10 min). Jeśli przygotowano więcej niż 5 ml emulsji, należy użyć kilku strzykawek 5 ml; NIE używać większych strzykawek.
- Emulsję można przechowywać w strzykawkach w temperaturze 4°C przez 3 tygodnie. Zaleca się jej przygotowanie co najmniej 12 godzin wcześniej, aby sprawdzić, czy nie uległa rozwarstwieniu. Powinna pozostać gęsta i nie rozdzielać się na dwie fazy. Kolor w ciągu nocy zmieni się na jasnoyellow lub beżowy.
4. Immunizacja szczurów
- Mieszaj emulsję w strzykawkach przez kilka minut, a następnie przenieś ją do strzykawki przeznaczonej do iniekcji. Wstrzyknij 200 µl podskórnie u samej nasady ogona, używając igieł 23G i strzykawek 3 ml Luer-Lock w krótkotrwałej narkozie.
- Odbiorcami są samice szczurów DA w wieku 7-9 tygodni. Szczury pozyskiwane są z Harlan-Sprague Dawley.
- Szczury należy obserwować dwa razy dziennie i ważyć codziennie. Objawów klinicznych należy spodziewać się od 7 do 15 dni po wstrzyknięciu emulsji.
Ocena kliniczna:
0: brak choroby
0,5: dystalny wiotki ogon
1: wiotki ogon
2: łagodna parapareza, ataksja
3: umiarkowana parapareza, szczury od czasu do czasu potykają się
3.5: jedna kończyna tylna jest sparaliżowana, druga się porusza
4: całkowity paraliż kończyn tylnych
5: całkowity paraliż kończyn tylnych i nietrzymanie moczu
6: stan agonalny, trudności w oddychaniu, brak przyjmowania pokarmu i wody. Bezzwłocznie przeprowadzić eutanazję.