Wielkoskalowe badania z wykorzystaniem rybek zebrafish In vivo Przesiewanie małych cząsteczek

Podsumowanie

Danio pręgowany stał się potężną platformą in vivo do przesiewowych badań leków opartych na fenotypie oraz analiz genetyki chemicznej. W niniejszej pracy prezentujemy prostą i praktyczną metodę wielkoskalowego przesiewu małych cząsteczek z wykorzystaniem embrionów danio pręgowanego.

Streszczenie

Ze względu na niewielki rozmiar zarodka, szybki rozwój, przezroczystość, płodność oraz liczne podobieństwa molekularne, morfologiczne i fizjologiczne do ssaków, zebrafish stał się potężnymin vivoplatforma do przesiewania leków w oparciu o fenotyp oraz analizy genetyki chemicznej. W niniejszej pracy prezentujemy prostą, praktyczną metodę wielkoskalowego przesiewania małych cząsteczek z wykorzystaniem embrionów zebrafish.

Protokół

1) Pobieranie ikry danio pręgowanego

1. Popołudniem w dniu poprzedzającym badanie chemiczne przygotować od 10 do 20 zbiorników hodowlanych dla danio pręgowanych. Napełnić każdy zbiornik wodą z systemu akwakultury. Za pomocą siatki przenieść jednego dorosłego samca oraz jedną do dwóch dorosłych samic do wewnętrznego pojemnika w każdym zbiorniku hodowlanym. Oddzielić samca od samic za pomocą przegrody. Opisać klatki i przykryć je pokrywkami.
2. Rano w dniu badania usunąć przegrody ze zbiorników hodowlanych, umożliwiając danio pręgowanym rozród. Przez następną 1 godzinę pozwolić zapłodnionym ikrom opaść przez kratkę znajdującą się na dnie każdego wewnętrznego pojemnika.
3. Po 1 godzinie przenieść dorosłe danio pręgowane z powrotem do zbiorników stałych, wyjąć wewnętrzne pojemniki i zebrać ikrę, przecedzając wodę z każdego zbiornika hodowlanego przez plastikowe sitko do herbaty.
4. Odwrócić sitko nad szalką Petriego i delikatnie wypłukać ikrę do szalki, używając butelki z wodą destylowaną zawierającej pożywkę E3.
5. Wszystkie niezapłodnione ikry, które są nieprzezroczyste, należy usunąć za pomocą jednorazowej plastikowej pipety. Każda krzyżówka powinna dać około 200 embrionów.

2) Rozmieszczanie embrionów w płytkach 96-dołkowych

1. Za pomocą szklanej pipety Pasteura przenieś około 5 embrionów w medium E3 do każdego dołka płytki 96-dołkowej.
2. Po rozmieszczeniu embrionów na płytce 96-dołkowej, usuń z dołków jak najwięcej medium E3 za pomocą pipety 12-kanałowej (30 - 300 μL), uważając, aby nie uszkodzić embrionów. Używając pipety 12-kanałowej, jak najszybciej wprowadź do każdego dołka 250 μL medium E3 zawierającego 0.5μg/ml kanamycyny, aby zapobiec wysychaniu embrionów.
3. Umieść płytki 96-dołkowe w inkubatorze w temperaturze 28.5°C do momentu osiągnięcia przez embriony pożądanego stadium, w którym zostaną dodane związki.

3) Transfer biblioteki małych cząsteczek

Choć przenoszenie związków można zautomatyzować za pomocą robotycznych metod transferu, w niniejszym opisie skupimy się na metodzie manualnej.

1. Biblioteki małych cząsteczek są zazwyczaj dostarczane w formacie 96-dołkowym, przy czym każdy związek jest przechowywany w DMSO jako roztwór stokowy o stężeniu 10 mM. Około 60 minut przed osiągnięciem przez embriony stadium, w którym należy dodać związki, rozmrozić odpowiednią liczbę płytek 96-dołkowych zawierających alikwoty małych cząsteczek (płytka źródłowa). Zanotować numery seryjne lub inne numery identyfikacyjne płytek źródłowych. Aby zminimalizować kondensację na płytkach, rozmrażanie można przeprowadzić w komorze osuszającej zawierającej Drierite (W.A. HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH).
2. Krótko odwirować płytki w wirówce nakładkowej wyposażonej w adapter do płytek wielodołkowych.
3. Usunąć aluminiową taśmę uszczelniającą z płytki źródłowej. Używając pipety 12-kanałowej, rozcieńczyć związki w płytce źródłowej do stężenia 0,5 mM (na przykład, zaczynając od alikwotów 250 nL roztworu stokowego 10 mM, dodać 4,75 μL DMSO do każdego dołka).
4. Gdy embriony w płytce 96-dołkowej (płytka odbiorcza) osiągną pożądane stadium, użyć pipety 12-kanałowej (2-20 μL), aby przenieść 2,5 μL związków (0,5 mM) z płytek źródłowych do płytek odbiorczych zawierających embriony.
5. Zanotować numery identyfikacyjne płytek źródłowych na płytkach odbiorczych z embrionami. Przykryć pokrywkami płytki odbiorcze zawierające embriony i związki, delikatnie wymieszać zawartość płytek poprzez powolne okrążanie, a następnie umieścić je w inkubatorze w temperaturze 28,5°C.
6. Każdą płytkę źródłową zawierającą niewykorzystane małe cząsteczki (0,5 mM) zakryć aluminiową taśmą uszczelniającą i umieścić w zamrażarce -80°C do długotrwałego przechowywania.

4) Przesiewowe badanie wpływu małych cząsteczek poprzez wizualną ocenę fenotypów

1. Przed przeprowadzeniem przesiewu należy sformułować konkretne kryterium określające, co będzie stanowiło tzw. „hit” (pozytywny wynik).
2. W wybranych momentach rozwoju należy wyjąć z inkubatora płytki 96-dołkowe zawierające embriony traktowane związkami i zbadać każdy dołek pod stereomikroskopem. W celu lepszej wizualizacji subtelnych zmian, takich jak zmiany w schemacie krążenia, można zastosować odwrócony mikroskop fazowo-kontrastowy. Do badania zaburzeń ekspresji białek GFP lub DsRed pod promotorem tkankowo specyficznym można wykorzystać mikroskopię fluorescencyjną.
3. Należy szybko przeszukać płytki 96-dołkowe w poszukiwaniu dołków, w których co najmniej 3 z 5 embrionów wykazują określony fenotyp „hit”. Należy odnotować identyfikator płytki oraz położenie dołka dla każdego potencjalnego hitu.
4. Potencjalny hit należy potwierdzić poprzez ponowne przetestowanie działania związku w kilku dawkach (1 uM, 5 uM, 10 μM oraz 50 μM). Dla każdej dawki testuje się 10 embrionów w 0,5 mL pożywki E3 w formacie płytki 48-dołkowej. Moment dodania związku podczas powtórnych testów powinien być identyczny jak w pierwotnym przesiewie. Hit zostaje potwierdzony, gdy wywołany fenotyp zostanie odtworzony podczas ponownego testowania związku.
5. Należy zidentyfikować związek będący hitem w bazie danych małych cząsteczek w bibliotece chemicznej.

Dyskusja

Podczas planowania przesiewu chemicznego z wykorzystaniem danio pręgowanego należy zwrócić szczególną uwagę na stabilność rozważanego fenotypu oraz częstość jego występowania w tle. Jest to szczególnie istotne w przypadku poszukiwania chemicznych supresorów fenotypu indukowanego. Przykładowo, w przypadku fenotypu wywołanego indukcją transgenu szokiem termicznym, warunki umożliwiające powtarzalną indukcję fenotypu muszą zostać precyzyjnie określone przed rozpoczęciem przesiewu, aby uniknąć nieakceptowalnie wysokiego odset...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Nazwa materiału	Typ	Firma	Numer katalogowy
Minimum 20 par dorosłych danio pręgowanych o pożądanym genotypie.
Siatki do ryb, zbiorniki hodowlane z wyjmowanym pojemnikiem wewnętrznym i przegrodami (Aquatic Habitats).
Szalki Petriego (10 cm).
Plastikowe sitko do herbaty.
Butelka zmywaczka zawierająca wodę do embrionów.
Jednorazowe polietylenowe pipety transferowe.
Polistyrenowe 96-dołkowe płytki analityczne o okrągłym dnie (Corning COSTAR; Lowell, MA).
Szklana pipeta Pasteura (Fisher Scientific).
Ręczna pompka do pipet, 10 mL (Bel-Art Products, Pequannock, NJ).
Pożywka E3 dla embrionów: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 , zawierająca 0.003% PTU (fenylotiomocznik, Sigma; St. Louis, MO). PTU można przygotować jako roztwór 10x, rozpuszczając 0.3-g PTU w 1 L pożywki E3 dla embrionów. Roztwory zawierające PTU należy chronić przed światłem, owijając je folią aluminiową.
Pipety 12-kanałowe, 2-20 μL (Eppendorf).
Pipety 12-kanałowe, 3-300 μL (Eppendorf).
Jednorazowy polistyrenowy zbiornik na końcówki pipet, 50 mL (Fisher Scientific).
Biblioteka małych cząsteczek o zróżnicowanej strukturze rozmieszczona w formacie 96-dołkowym w stężeniu zapasowym 10 mM w DMSO. Każda płytka matrycowa jest rozdzielana na 96-dołkowe polipropylenowe płytki do przechowywania (Corning) i przechowywana w temperaturze -80°C do momentu użycia.
Aluminiowa taśma uszczelniająca do płytek 96-dołkowych (Nunc, Rochester, NY).
DMSO (Sigma, St. Louis, MO).
Podstawowy inkubator, 28.5°C (Fisher Scientific).
Stereomikroskop z podstawą do oświetlenia przechodzącego (Leica Microsystems, Bannockburn, IL).