Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ulegających ekspresji w oocytach Xenopus

Summary

Prąd jonowy kanałów BK jest rejestrowany za pomocą technik patch clamp. Kanały BK ulegają ekspresji w oocytach Xenopus poprzez wstrzyknięcie informacyjnego RNA. Roztwór wewnątrzkomórkowy podczas nagrań patch clamp jest kontrolowany przez system perfuzyjny.

Abstract

Przedstawiony tutaj protokół jest przeznaczony do badania aktywacji kanałów K⁺ (BK) aktywowanych dużą konduktancją, napięciem i Ca²⁺. Protokół może być również wykorzystany do badania zależności struktura-funkcja dla innych kanałów jonowych i receptorów neuroprzekaźników¹. Kanały BK są szeroko eksprymowane w różnych tkankach i są zaangażowane w wiele funkcji fizjologicznych, w tym regulację skurczu mięśni gładkich, dostrajanie częstotliwości wewnętrznych komórek rzęsatych i regulację uwalniania neuroprzekaźników^2-6. Kanały BK są aktywowane przez depolaryzację błony oraz przez wewnątrzkomórkowe Ca²⁺ i Mg^{2 + 6-9}. Dlatego protokół ma na celu kontrolowanie zarówno napięcia błony, jak i roztworu wewnątrzkomórkowego. W tym protokole informacyjny RNA kanałów BK jest wstrzykiwany do oocytów Xenopus laevis (stadium V-VI), a następnie przez 2-5 dni inkubacji w temperaturze^{18°C 10-13}. Łaty membranowe, które zawierają jeden lub wiele kanałów BK, są wycinane w konfiguracji od wewnątrz na zewnątrz przy użyciu technik zaciskania krosowego^10-13. Wewnątrzkomórkowa strona plastra jest perfundowana pożądanymi roztworami podczas nagrywania, dzięki czemu można zbadać aktywację kanału w różnych warunkach. Podsumowując, mRNA kanałów BK jest wstrzykiwane do oocytów Xenopus laevis w celu ekspresji białek kanałowych na błonie oocytów; Techniki patch clamp służą do rejestrowania prądów przepływających przez kanały pod kontrolowanym napięciem i roztworami wewnątrzkomórkowymi.

Protocol

1. Wstrzyknięcie mRNA do oocytów

1. Wstrzyknąć 0,05 - 50 ng informacyjnego RNA, który został transkrybowany in vitro, do oocytów Xenopus laevis (stadium V-VI) za pomocą wstrzykiwacza Nanoject II Auto-Nanolitr (Drummond Scientific Company, model 3-000-204). Powtórz iniekcję na kilkunastu oocytach dla każdego mRNA.
2. Dwukrotnie przepłukać wstrzyknięte oocyty roztworem ND-96 (96 mM chlorku sodu (NaCl, Mr 58,44 g/mol), 2 mM chlorku potasu (KCl, Mr 74,56 g/mol), 1,8 mM chlorku wapnia (CaCl₂•2H₂O, Mr 147.02), 1 mM chlorku magnezu (MgCl₂•6H₂O, Mr 203,31 g/mol), 5 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES, Mr 238,31 g/mol), 2,5 mM pirogronianu sodu (Mr 110,04 g/mol) i 1x penicylina-streptomycyna. pH 7,6), a następnie umieść je na płytce hodowlanej i inkubuj w temperaturze 18°C przez 2+ dni.

2. Przygotowanie systemu perfuzyjnego

Ilustracja systemu perfuzji Automate ValveLink 16. System perfuzyjny wykorzystuje azot pod ciśnieniem do wypychania roztworów perfuzyjnych ze zbiorników roztworu, przez rurki perfuzyjne oraz do ołówka i końcówki perfuzyjnej. Przepływ każdego strumienia roztworu perfuzyjnego jest kontrolowany przez jeden zawór zbiornika i jeden zawór elektroniczny. W tym protokole jeden ze zbiorników nie jest pod ciśnieniem i pełni funkcję kolektora odpadów, a także mechanizmu zwalniającego ciśnienie. (Zdjęcie zaczerpnięte ze strony internetowej sprzedawcy http://www.autom8.com)

1. Podłącz rurki do ołówka perfuzyjnego. Włącz elektroniczny sterownik zaworu i otwórz zawory elektroniczne.
2. Aby upewnić się, że rurki i ołówek perfuzyjny są wolne od zatkania i pęcherzyków powietrza, przepchnij wodę dejonizowaną (DI) przez każdą rurkę za pomocą strzykawki wypełnionej wodą dejonizowaną.
3. Podłącz rurki do zbiorników roztworu i otwórz zawór butli z gazem, aby zastosować azot pod ciśnieniem.
4. Otwórz zawór zbiornika, aby napełnić rurkę roztworem zbiornika. W razie potrzeby przesuń zawór zbiornika, aby usunąć pęcherzyki z roztworu. Zamknij zawór po napełnieniu rurki roztworem.
5. Napełnij końcówkę perfuzyjną wodą i przykręć ją do ołówka perfuzyjnego. Uważaj, aby nie uwięzić żadnych bąbelków podczas podłączania końcówki.
6. Przymocuj kredkę perfuzyjną do etapu kąpieli za pomocą plasteliny. Upewnij się, że końcówka perfuzyjna znajduje się w przestrzeni wanny. System perfuzyjny jest teraz skonfigurowany.
7. Dodaj wodę DI do kąpieli. Upewnij się, że końcówka perfuzyjna jest zanurzona w wodzie.
8. Sprawdź, czy każdy roztwór perfuzyjny prawidłowo wypływa z końcówki perfuzyjnej. Zamknąć zawór elektroniczny podłączony do przewodu kolektora odpadów i otworzyć zawór dla jednego roztworu perfuzyjnego na raz (140 mM wodorotlenku potasu (KOH, M_r 56,1 g/mol), 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES, M_r 238,31 g/mol), 2 mM chlorku potasu (KCl, M_r 74,56 g/mol), 1 mM Glikol-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′-tetraoctowy kwas (EGTA, M_r 380,35 g/mol), pH dostosowuje się do 7,1-7,2 za pomocą kwasu metanosulfonowego (MeSO3, M_r 96,1 g/mol), Ca²⁺ lub Mg2+ dodaje się do żądanego stężenia w razie potrzeby). Pod mikroskopem obserwuj strumień płynu perfuzyjnego wychodzący z końcówki perfuzyjnej. Zamknij zawór roztworu perfuzyjnego i otwórz zawór kolektora odpadów. Strumień perfuzyjny powinien prawie zniknąć. Powtórzyć ten sam test dla wszystkich roztworów perfuzyjnych.
9. Po sprawdzeniu, czy wszystkie roztwory perfuzyjne przepływają prawidłowo, zastąpić wodę demineralizowaną w kąpieli roztworem do kąpieli (140 mM wodorotlenku potasu (KOH, M_r 56,1 g/mol), 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES, M_r 238,31 g/mol), 2 mM chlorku potasu (KCl, M_r 74,56 g/mol), pH dostosować do 7,1-7,2 za pomocą kwasu metanosulfonowego (_MeSO3, M_r 96,1 g/mol)).

3. Zaciskanie łat

1. Ponownie pokryj elektrodę rejestrującą Ag AgCl przed każdą sesją zaciskania łaty. Najpierw wyjmij drut elektrody z uchwytu na pipety i zanurz końcówkę drutu elektrody w fiolce zawierającej świeży wybielacz na co najmniej 15 minut. Powoduje to osadzenie warstwy AgCl na drucie.
2. Opłucz drut elektrody wodą dejonizowaną i osusz. Następnie zainstaluj elektrodę Ag/AgCl z powrotem w uchwycie pipety.
3. Podłącz elektrodę kąpielową (referencyjną) do stopnia głównego i umieść ją w wannie. W ten sposób elektrody są przygotowywane do zapisu.
4. Teraz przygotuj się do pozyskiwania danych. Włącz komputer i podłącz klucz sprzętowy do portu drukarki w komputerze. Klucz sprzętowy musi być podłączony, aby można było korzystać z oprogramowania do akwizycji danych, którym jest HEKA pulse.
5. Włącz wzmacniacz (Axon Instruments, AXOPATCH 200B) i uruchom HEKA Pulse. Załaduj plik protokołu i dostosuj ustawienia konfiguracyjne, takie jak skala bodźców. Celem dostosowania ustawień konfiguracyjnych jest zapewnienie, że potencjał testowy jest dokładnie równy potencjałowi dowodzenia. W ten sposób przygotowuje się sprzęt do akwizycji danych.
6. Przygotuj oocyty. Zanurzyć oocyt w roztworze do odpędzania (200 mM N-metylo-D-glukaminy (NMG, M_r 195,22 g/mol), 200 mM asparaginianu (bez K⁺) (M_r 133,1 g/mol), 2 mM chlorku potasu (KCl, M_r 74,56 g/mol), 10 mM glikolu etylenowego-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′-tetraoctowy kwas (EGTA, M_r 380,35 g/mol), 1 mM chlorek magnezu (MgCl₂•6H₂O, M_r 203,31 g/mol), 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES, M_r 238,31 g/mol), pH dostosowuje się do 7,4 za pomocą wodorotlenku sodu (NaOH, M_r 40,0 g/mol) przez 5 - 10 min. Roztwór do usuwania oddziela błonę witeliny od błony plazmatycznej, co umożliwia usunięcie błony witelinowej.
7. Delikatnie usuń błonę witeliny z oocytu za pomocą dwóch par kleszczy. Zdewitynizowany oocyt jest niezwykle delikatny i dlatego powinien być przenoszony tak rzadko, jak to konieczne.
8. Uważając, aby nie dopuścić do wystawienia zdewitynizowanego oocytu na działanie powietrza lub pęcherzyków, użyj szklanej pipety wypełnionej wystarczającą ilością roztworu, aby przenieść oocyt do kąpieli. To przygotowuje oocyt do rejestracji.
9. Przygotować pipety z łatkami. Wyciągnij szklane pipety po włożeniu szklanej rurki kapilarnej (VWR International, Cat # 53432-921) do ściągacza do mikropipet Sutter P-97 Flaming/Brown. Obserwuj pipety pod mikroskopem, aby określić kształt końcówki i średnicę otworu. Średnica otworu powinna wynosić 2-4 mikrometry.
10. Aby zmniejszyć prąd pojemnościowy podczas nagrywania i zapewnić gładką końcówkę, pokryj końcówkę woskiem, a następnie wypoleruj ją ogniowo.
11. Napełnić końcówkę pipety, umieszczając końcówkę pipety w roztworze pipety (140 mM wodorotlenku potasu (KOH, M_r 56,1 g/mol), 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES, M_r 238,31 g/mol), 2 mM chlorku potasu (KCl, M_r 74,56 g/mol), 2 mM chlorku magnezu (MgCl₂•6H₂O, M_r 203,31 g/mol), pH dostosowuje się do 7,1-7,2 za pomocą kwasu metanosulfonowego (MeSO₃, M_r 96,1 g/mol)) i pociągnięcia tłoka. To zwilża końcówkę.
12. Napełnij pipetę 1/3 roztworem pipety za pomocą strzykawki i umieść pipetę w uchwycie na pipety, tak aby elektroda Ag/AgCl znajdowała się w środku i stykała się z roztworem pipety. Spowoduje to przygotowanie pipety z plastrem.
13. Aby wyciąć plaster wywrócony na lewą stronę z przygotowanego oocytu, znajdź przezroczystą krawędź oocytu pod mikroskopem. Przesunąć pipetę z plastrem w pobliże oocytu za pomocą manipulatora. Zapisz rezystancję szeregową pipety. Idealna rezystancja szeregowa pipety krosowej wynosi od 1 do 1,5 MΩ po napełnieniu roztworem pipety i zanurzeniu w roztworze do kąpieli.
14. Powoli dociskaj pipetę do oocytu, aż opór w przybliżeniu się podwoi.
15. Delikatnie odsysać membranę ustnie przez rurkę ssącą, która jest podłączona do uchwytu pipety, aż do uzyskania gigaomowego uszczelnienia. Ustabilizuj łatkę, przytrzymując ją pod napięciem -30 mV przez kilka minut.
16. Aby uzyskać plaster wywrócony na lewą stronę, należy go wyciąć, szybko wciskając pipetę głębiej w komórkę jajową, a następnie delikatnie ją wyciągając.
17. Łatka wywrócona na lewą stronę jest teraz gotowa do zaciśnięcia. Przesuń pipetę trzymającą plaster na lewą stronę na około 100 mikronów od otworu końcówki perfuzyjnej.
18. Zamknij elektroniczny zawór do zbierania odpadów i otwórz zawór zbiornika, aby uzyskać żądany roztwór perfuzyjny
19. Rozpocznij rejestrowanie prądów na łacie. Zmień napięcie i roztwory perfuzyjne zgodnie z potrzebami.
20. Po zakończeniu nagrywania wyczyść rurki perfuzyjne, ołówek i końcówkę, przepychając się przez wodę dejonizowaną, aby uniknąć zatkania.

4. Reprezentatywne wyniki

Podczas przygotowywania oocytów do zacisku plastrowego, 5-10 minutowa obróbka roztworem strippingowym odczepiłaby błonę witeliny od błony plazmatycznej, co umożliwiłoby usunięcie błony witeliny.

Idealna rezystancja szeregowa pipety krosowej wynosi od 1 do 1,5 MΩ po napełnieniu roztworem pipety i zanurzeniu w roztworze do kąpieli.

Poniżej znajduje się reprezentatywny zapis kanałów BK typu dzikiego na plamie błony oocytów. Po lewej stronie u góry fale prostokątne wskazują napięcie przyłożone do łaty - drugi stopień napięcia wzrasta z 50 mV do 200 mV z przyrostem 50 mV. Poniżej znajdują się odpowiednie ślady prądu, gdy roztwór perfuzyjny ma nominalne 0 Ca²⁺ (wolny [Ca²⁺] wynosi około 0,5 nM). Wzrost amplitudy prądu wskazuje, że prawdopodobieństwo otwarcia kanałów BK wzrasta wraz z napięciem. Po prawej stronie ten sam plaster jest perfuzjowany 1,0 μM Ca²⁺, gdy jest nakładany tym samym protokołem napięciowym. Amplituda prądu wzrasta bardziej przy tym samym napięciu, co wskazuje, że prawdopodobieństwo otwarcia wzrasta wraz z [Ca²⁺].

Discussion

System ekspresji oocytów jest idealny do elektrofizjologicznej charakterystyki kanałów jonowych zależnych od napięcia ze względu na stosunkowo niskie tło kanałów endogennych. Ponadto, ponieważ jest to przejściowy system ekspresji, zapewnia skuteczną metodę przeprowadzania badań mutagenezy tych kanałów. Należy jednak zauważyć, że system ekspresji oocytów różni się od tego w komórkach ssaków, dlatego mogą występować różnice w modyfikacji potranslacyjnej i asocjacji z różnymi podjednostkami. Ponadto stężenie lipidów może si...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nanoject II Auto-Nanolitr Injector	Drummond Scientific	3-000-204
P-97 Flaming/Brown Ściągacz do mikropipet	Sutter Instrument Co.	P-97
i sterownik elektroniczny	AutoMate Scientific, Inc.	ValveLink 16	Wewnętrzna średnica końcówki perfuzyjnej: 100 mikronów
Mikroskop odwrócony	Olympus Corporation	CKX31
Szklane pipety	VWR international	53432-921
Flaming/Brown Ściągacz do mikropipet	Sutter Instrument Co.	Wzmacniacz P-97
	Axon Instruments	AXOPATCH 200B
Interfejs komputerowy	INSTRUTECH Corporation	ITC-18
Scena czołowa	Axon Instruments	CV 203BU