Prąd jonowy kanałów BK rejestruje się przy użyciu technik patch clamp. Kanały BK są eksprymowane w oocytach Xenopus poprzez wstrzykiwanie mRNA. Roztwór wewnątrzkomórkowy podczas pomiarów patch clamp jest kontrolowany przez system perfuzyjny.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przedstawiony tutaj protokół został opracowany w celu zbadania aktywacji kanałów potasowych o dużym przewodnictwie, zależnych od napięcia i Ca2+2+aktywowany K+ kanały (BK). Protokół ten może być również wykorzystany do badania zależności między strukturą a funkcją w przypadku innych kanałów jonowych i receptorów neurotransmiterów1Kanały BK są szeroko ekspresjonowane w różnych tkankach i są zaangażowane w wiele funkcji fizjologicznych, w tym w regulację skurczu mięśni gładkich, strojenie częstotliwości komórek rzęskowych wewnętrznych oraz regulację uwalniania neurotransmiterów.2-6Kanały BK są aktywowane przez depolaryzację błony oraz wewnątrzkomórkowy Ca2+.2+ oraz Mg2+ 6-9W związku z tym protokół został opracowany w celu kontrolowania zarówno napięcia błony, jak i roztworu wewnątrzkomórkowego. W tym protokole mRNA kanałów BK jest wstrzykiwane do Xenopus laevis oocyty (stadium V-VI), a następnie 2–5 dni inkubacji w temperaturze 18°C10-13Platki błonowe zawierające pojedyncze lub wiele kanałów BK są wycinane w konfiguracji inside-out z wykorzystaniem techniki patch clamp.10-13Wewnętrzna strona patcha jest podczas rejestracji perfundowana odpowiednimi roztworami, co umożliwia zbadanie aktywacji kanałów w różnych warunkach. Podsumowując, mRNA kanałów BK wstrzykuje się do Xenopus laevis oocyty w celu ekspresji białek kanałowych w błonie oocytu; techniki patch-clamp są wykorzystywane do rejestrowania prądów przepływających przez kanały przy kontrolowanym napięciu i składzie roztworów wewnątrzkomórkowych.
Protokół
1. Iniekcja mRNA do oocytów
- Wstrzyknąć od 0,05 do 50 ng transkrybowanego in vitro mRNA do oocytów Xenopus laevis (stadium V-VI) przy użyciu auto-nanolitrowego injektora Nanoject II (Drummond Scientific Company, model 3-00-204). Zabieg powtórzyć dla kilkunastu oocytów w przypadku każdego mRNA.
- Wstrzyknięte oocyty przepłukać dwukrotnie roztworem ND-96 (96 mM chlorku sodu (NaCl, Mr 58,4 g/mol), 2 mM chlorku potasu (KCl, Mr 74,56 g/mol), 1,8 mM chlorku wapnia (CaCl2•2H2O, Mr 147,02), 1 mM chlorku magnezu (MgCl2•6H2O, Mr 203,31 g/mol), 5 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES, Mr 238,31 g/mol), 2,5 mM pirogronianu sodu (Mr 10,04 g/mol) oraz 1x penicyliny-streptomycyny, pH 7,6), następnie umieścić je na płytce hodowlanej i inkubować w temperaturze 18°C przez ponad 2 dni.
2. Przygotowanie systemu perfuzyjnego
Ilustracja systemu perfuzyjnego Automate ValveLink 16. System perfuzyjny wykorzystuje sprężony azot do wypychania roztworów perfuzyjnych z rezerwuarów, przez przewody perfuzyjne, do końcówki i pióra perfuzyjnego. Przepływ każdego strumienia roztworu perfuzyjnego jest kontrolowany przez jeden zawór rezerwuaru oraz jeden zawór elektroniczny. W niniejszym protokole jeden z rezerwuarów nie jest pod ciśnieniem i pełni funkcję kolektora odpadów oraz mechanizmu upustowego. (Rysunek zaadaptowany ze strony dostawcy http://www.autom8.com)
- Podłącz dreny do ołówka perfuzyjnego. Włącz elektroniczny sterownik zaworów i otwórz zawory elektroniczne.
- Aby upewnić się, że przewody i końcówka perfuzyjna są wolne od zatorów i pęcherzyków powietrza, należy przepchnąć wodę dejonizowaną (DI) przez każdy przewód, używając strzykawki wypełnionej wodą dejonizowaną.
- Podłączyć rurki do zbiorników z roztworami i otworzyć zawór butli z gazem, aby wprowadzić azot pod ciśnieniem.
- Otwórz zawór zbiornika, aby napełnić przewody roztworem ze zbiornika. W razie potrzeby stuknij w zawór zbiornika, aby usunąć pęcherzyki powietrza z roztworu. Zamknij zawór po napełnieniu przewodów roztworem.
- Napełnić końcówkę perfuzyjną wodą i przykręcić ją do ołówka perfuzyjnego. Należy uważać, aby podczas podłączania końcówki nie uwięznąć żadnych pęcherzyków powietrza.
- Przymocuj ołówek perfuzyjny do platformy kąpieli za pomocą modeliny. Upewnij się, że końcówka perfuzyjna znajduje się w przestrzeni kąpieli. System perfuzyjny został teraz skonfigurowany.
- Napełnić kąpiel wodą dejonizowaną (DI). Należy upewnić się, że końcówka perfuzyjna jest zanurzona w wodzie.
- Sprawdź, czy każdy roztwór perfuzyjny wypływa prawidłowo z końcówki perfuzyjnej. Zamknij zawór elektroniczny podłączony do rurki kolektora odpadów i otwieraj zawory dla każdego roztworu perfuzyjnego po kolei (140 mM wodorotlenek potasu (KOH, Mr 56,1 g/mol), 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES, Mr 238,31 g/mol), 2 mM chlorku potasu (KCl, Mr 74,56 g/mol), 1 mM glikolu etylenowego-bis(2-aminoetylotere)-N,N,N′,N′-tetraoctowego (EGTA, Mr 380,35 g/mol), pH jest dostrajane do wartości 7,1–7,2 za pomocą kwasu metanosulfonowego (MeSO3, Mr 96,1 g/mol), Ca2+ (lub w razie potrzeby dodaje się Mg2+ do pożądanej koncentracji). Pod mikroskopem należy zaobserwować strumień płynu perfuzyjnego wypływający z końcówki perfuzyjnej. Należy zamknąć zawór roztworu perfuzyjnego i otworzyć zawór zbiornika na odpady. Strumień perfuzyjny powinien niemal całkowicie zaniknąć. Powtórzyć ten sam test dla wszystkich roztworów perfuzyjnych.
- Po upewnieniu się, że wszystkie roztwory perfuzyjne przepływają prawidłowo, należy zastąpić wodę dejonizowaną (DI) w kąpieli roztworem do kąpieli (140 mM wodorotlenku potasu (KOH, Mr 56,1 g/mol), 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES, Mr 238,31 g/mol), 2 mM chlorku potasu (KCl, Mr 74,56 g/mol), pH reguluje się do wartości 7,1-7,2 za pomocą kwasu metanosulfonowego (MeSO3, Mr 96,1 g/mol)).
3. Metoda Patch Clamp
- Przed każdą sesją patch-clampu należy ponownie pokryć elektrodę rejestrującą Ag warstwą AgCl. Najpierw należy wyjąć drut elektrody z uchwytu pipety i zanurzyć połowę drutu w fiolce zawierającej świeży wybielacz na co najmniej 15 minut. Pozwala to na osadzenie warstwy AgCl na drucie.
- Drut elektrody należy przepłukać wodą dejonizowaną i osuszyć. Następnie należy ponownie zamontować elektrodę Ag/AgCl w uchwycie pipety.
- Elektrodę kąpielową (referencyjną) należy podłączyć do przedwzmacniacza i umieścić w kąpieli. Przygotowuje to elektrody do rejestracji.
- Następnie należy przygotować system do akwizycji danych. Włącz komputer i podłącz klucz sprzętowy do portu drukarki w komputerze. Klucz sprzętowy musi być podłączony, aby móc korzystać z oprogramowania do akwizycji danych, którym jest HEKA pulse.
- Włącz wzmacniacz (Axon Instruments, AXOPATCH 20B) i uruchom program HEKA Pulse. Wczytaj plik protokołu i dostosuj ustawienia konfiguracji, takie jak skala bodźca (Stimulus Scale). Celem dostosowania ustawień konfiguracji jest zapewnienie, aby potencjał testowy był dokładnie równy potencjałowi sterującemu. Przygotowuje to sprzęt do akwizycji danych.
- Przygotuj oocyty. Zanurz oocyt w roztworze do usuwania błony (20 mM N-metyl-D-glukaminy (NMG, Mr 195.2 g/mol), 20 mM aspartanianu (bez K+) (Mr 13.1 g/mol), 2 mM chlorku potasu (KCl, Mr 74.56 g/mol), 10 mM kwasu etylenoglikol-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N′,N′-tetraoctowego (EGTA, Mr 380.35 g/mol), 1 mM chlorku magnezu (MgCl2•6H2O, Mr 203.31 g/mol), 10 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynowy etanosulfonowego (HEPES, Mr 238.31 g/mol), pH dostosowane do 7,4 za pomocą wodorotlenku sodu (NaOH, Mr 40.0 g/mol)) na 5–10 min. Roztwór do usuwania błony oddziela błonę witelinową od błony plazmatycznej, co umożliwia usunięcie błony witelinowej.
- Delikatnie usuń błonę witelinową z oocytu za pomocą dwóch par pęset. Oocyt po dewitelinizacji jest niezwykle kruchy, dlatego należy go przemieszczać w jak najmniejszym zakresie.
- Aby uniknąć wystawienia dewitelinizowanego oocytu na działanie powietrza lub pęcherzyków, użyj szklanej pipety wypełnionej odpowiednią ilością roztworu, aby przenieść oocyt do kąpieli. Przygotowuje to oocyt do rejestracji.
- Przygotuj pipety do patch-clampu. Wytnij szklane pipety, wkładając szklaną rurkę kapilarną (VWR International, Kat # 53432-921) do wyciągacza mikroelektrod Sutter P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller. Obserwuj pipety pod mikroskopem, aby określić kształt końcówki i średnicę otworu. Średnica otworu powinna wynosić 2–4 µm.
- Aby zmniejszyć prąd pojemnościowy podczas rejestracji i zapewnić gładkość końcówki, pokryj końcówkę woskiem, a następnie wypal ją w płomieniu.
- Wypełnij końcówkę pipety, umieszczając ją w roztworze do pipet (140 mM wodorotlenku potasu (KOH, Mr 56.1 g/mol), 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynowy etanosulfonowego (HEPES, Mr 238.31 g/mol), 2 mM chlorku potasu (KCl, Mr 74.56 g/mol), 2 mM chlorku magnezu (MgCl2•6H2O, Mr 203.31 g/mol), pH dostosowane do 7,1–7,2 za pomocą kwasu metanosulfonowego (MeSO3, Mr 96.1 g/mol)) i odciągając tłok. Pozwala to na zwilżenie końcówki.
- Wypełnij 1/3 pipety roztworem do pipet za pomocą strzykawki i umieść pipetę w uchwycie z elektrodą Ag/AgCl wewnątrz, tak aby stykowała się z roztworem do pipet. Przygotowuje to pipetę do patch-clampu.
- Aby wyciąć patch typu inside-out z przygotowanego oocytu, znajdź pod mikroskopem wyraźną krawędź oocytu. Przesuń pipetę do patch-clampu blisko oocytu za pomocą manipulatora. Zmierz rezystancję szeregową pipety. Idealna rezystancja szeregowa pipety do patch-clampu wynosi od 1 do 1,5 MΩ, gdy jest ona wypełniona roztworem do pipet i zanurzona w roztworze kąpielowym.
- Powoli dociśnij pipetę do oocytu, aż rezystancja wzrośnie mniej więcej dwukrotnie.
- Zastosuj delikatne ssanie błony ustami poprzez rurkę ssącą połączoną z uchwytem pipety, aż do uzyskania uszczelnienia gigaomowego (giga-ohm seal). Stabilizuj patch, utrzymując napięcie -30 mV przez kilka minut.
- Aby uzyskać patch typu inside-out, wytnij go, szybko wsuwając pipetę głębiej w oocyt, a następnie delikatnie ją wyciągając.
- Patch typu inside-out jest teraz gotowy do clampowania. Przesuń pipetę z patchem na odległość około 10 µm od otworu końcówki perfuzyjnej.
- Zamknij elektroniczny zawór odpływu i otwórz zawór zbiornika z wybranym roztworem perfuzyjnym.
- Rozpocznij rejestrację prądów przez patch. Zmieniaj napięcie i roztwory perfuzyjne według potrzeb.
- Po zakończeniu rejestracji oczyść przewody perfuzyjne, igłę i końcówkę, przepychając przez nie wodę dejonizowaną, aby uniknąć zatorów.
4. Reprezentatywne wyniki
Podczas przygotowywania oocytów do metody patch clamp, 5-10 minowe traktowanie roztworem do usuwania błony witeliny powoduje oddzielenie błony witeliny od błony plazmatycznej, co umożliwia usunięcie błony witeliny.
Idealna rezystancja szeregowa pipety patch wynosi od 1-1.5 MΩ, gdy jest ona wypełniona roztworem do pipety i zanurzona w roztworze kąpielowym.
Poniżej znajduje się reprezentatywny zapis kanałów BK typu dzikiego w płacie błony oocytu. W lewym górnym rogu przebiegi prostokątne wskazują napięcie przyłożone do płata – drugi stopień napięcia wzrasta od 50 mV do 20 mV z przyrostem 50 mV. Poniżej znajdują się odpowiadające im zapisy prądowe dla roztworu perfuzyjnego o nominalnym stężeniu 0 Ca.2+ (wolne [Ca²⁺])2+] wynosi około 0,5 nM). Wzrost amplitudy prądu wskazuje, że prawdopodobieństwo otwarcia kanałów BK zwiększa się wraz z napięciem. Po prawej stronie ten sam fragment błony jest perfundowany za pomocą 1.0 μM Wapń2+ przy zastosowaniu tego samego protokołu napięciowego. Amplituda prądu wzrasta w większym stopniu przy tym samym napięciu, co wskazuje na wzrost prawdopodobieństwa otwarcia wraz z [Ca2+].
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
System ekspresyjny w oocytach jest idealny do charakterystyki elektrofizjologicznej napięciowo zależnych kanałów jonowych ze względu na stosunkowo niskie tło endogennych kanałów. Ponadto, jako że jest to system ekspresji przejściowej, stanowi on wydajną metodę prowadzenia badań nad mutogenezą tych kanałów. Należy jednak zauważyć, że system ekspresyjny w oocytach różni się od systemu w komórkach ssaków, w związku z czym mogą występować różnice w modyfikacjach potranslacyjnych oraz w asocjacji z różnymi podjednostkami. Co ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez granty Narodowych Instytutów Zdrowia (National Institutes of Health) R01-HL70393 i R01-NS060706 przyznane J.C. J.C. jest profesorem inżynierii biomedycznej w ramach funduszu Spencer T. Olin Endowment.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Automatyczny wstrzykiwacz nanolitrowy Nanoject II | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Wytwornica mikropipet P-97 (metoda wypalania/Browna) | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| System perfuzji i sterownik elektroniczny | AutoMate Scientific, Inc. | ValveLink 16 | Średnica wewnętrzna końcówki perfuzyjnej: 100 mikronów |
| Mikroskop odwrócony | Olympus Corporation | CKX31 | |
| Pipety szklane | VWR international | 53432-921 | |
| Wytwornica mikropipet (metoda wypalania/Browna) | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Wzmacniacz | Axon Instruments | AXOPATCH 200B | |
| Interfejs komputerowy | INSTRUTECH Corporation | ITC-18 | |
| Głowica wzmacniacza (Headstage) | Axon Instruments | CV 203BU |
Bibliografia
- Methfessel, C. Patch clamp measurements on Xenopus laevis oocytes: currents through endogenous channels and implanted acetylcholine receptor and sodium channels. Pflügers Arch. 407, 577-588 (1986).
- Toro, L., Wallner, M., Meera, P., Tanaka, Y. Maxi-K (Ca), Unique Member of the Voltage-Gated K Channel Superfamily. News Physiol. Sci. 13, 112-117 (1998).
- Fettiplace, R., Fuchs, P. A. Mechanisms of hair cell tuning. Annu. Rev. Physiol. 61, 809-834 (1999).
- Du, W. Calcium-sensitive potassium channelopathy in human epilepsy and paroxysmal movement disorder. Nat. Genet. 37, 733-738 (2005).
- Ledoux, J., Werner, M. E., Brayden, J. E., Nelson, M. T., T, M. Calcium-activated potassium channels and the regulation of vascular tone. Physiology (Bethesda). 21, 69-78 (2006).
- Salkoff, L. High-conductance potassium channels of the SLO family. Nat. Rev. Neurosci. 7, 921-931 (2006).
- Shi, J., Cui, J. Intracellular Mg2+ enhances the function of BK-type Ca2+-activated K+ channels. J. Gen. Physiol. 118, 589-606 (2001).
- Magleby, K. L. Gating mechanism of BK (Slo1) channels: so near, yet so far. J. Gen. Physiol. 121, 81-96 (2003).
- Latorre, R., Brauchi, S. Large conductance Ca2+-activated K+ (BK) channel: activation by Ca2+ and voltage. Biol. Res. 39, 385-401 (2006).
- Cox, D. H., Cui, J., Aldrich, R. W., W, R. Allosteric gating of a large conductance Ca-activated K+ channel. J. Gen. Physiol. 110, 257-281 (1997).
- Cui, J., Aldrich, R. W. Allosteric linkage between voltage and Ca2+-dependent activation of BK-type mslo1. K+ channels. Biochemistry. 39, 15612-15619 (2000).
- Yang, H. Activation of Slo1 BK channels by Mg2+ coordinated between the voltage sensor and RCK1. 15, 1152-1159 (2008).
- Lee, U. S., Cui, J. {beta} subunit-specific modulations of BK channel function by a mutation associated with epilepsy and dyskinesia. J. Physiol. , 587-1481 (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
