Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Jednym z najważniejszych celów w neuronauce jest zrozumienie sygnałów molekularnych, które sterują wczesnymi etapami formowania się synaps. W związku z tym konieczne stało się opracowanie obiektywnych metod ilościowego określania zmian w łączności synaptycznej. Niniejszy protokół, rozpoczynając od utrwalania próbek, szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronów, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery. Liczbę tych kolokalizacji określa się ilościowo za pomocą wtyczki Puncta Analyzer (autorstwa Bary'ego Warka, dostępna na zapytanie, c.eroglu@cellbio.duke.edu) w ramach oprogramowania analitycznego ImageJ. Opisany w tym protokole test synaptyczny może być zastosowany do dowolnej tkanki nerwowej lub preparatu hodowlanego, dla których dysponuje się selektywnymi markerami presynaptycznymi i postsynaptycznymi. Ten test synaptyczny stanowi wartościowe narzędzie, które może być szeroko wykorzystywane w badaniach nad rozwojem synaps.
Protokół
Roztwory do przygotowania:
- Bufor do przeciwciał:
- 150 mM NaCl
- 50 mM Tris-Base (Fisher, Cat. No: BP152-5, 50 mM) - 1.21 g
- 1% BSA (Sigma, Cat. No: A2153, 1%) - 2.0 g
- 100 mM L-lizyna (Sigma, Cat. No: L-1137, 100 mM) - 3.65 g
- Dostosować pH do 7.4
- 0.04% azotek
- Uzupełnić objętość do 200 ml destylowaną H2O.
- Przefiltrować przez filtr 0.22μm (Millipore, Cat. No: SCGPU02RE).
- Rozcieńczalnik....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany powyżej test synaptyczny został opracowany w kontekście naszych celów eksperymentalnych, w których koncentrujemy się głównie na projekcjach pobudzających RGC, zarówno w oczyszczonej hodowli, jak i w przekrojach mózgu. Przedstawiliśmy tabelę referencyjną zawierającą przeciwciała, które sprawdzają się w znakowaniu synaps pobudzających (Tabela 1).
Niniejszy test synaptyczny można dostosować w celu ilościowego oznaczenia liczby synaps w dowolnej populacji neuronów lub w przypadku innego p.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Wtyczka Puncta Analyzer do programu Image J została napisana przez Barry’ego Warka (obecny adres: Physion Consulting) w laboratorium Bena A. Barresa (Stanford University).
Finansowanie;
- Fundacja Alfreda P. Sloana
- The Esther A. and Joseph Klingenstein Fund, Inc.
- Broad Biomedical Research Foundation
- Inicjatywa Cure for Huntington s Disease
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Presynaptyczne | Synapsin | Królik | Poliklonalne |
| Synapsin | Mysz | Monoklonalne | Synaptic Systems |
| Bassoon | Mysz | Monoklonalne | Assay Designs |
| Bassoon | Świnka morska | Poliklonalne | Synaptic Systems |
| Synaptotagmin 1 | Królik | Poliklonalne | Synaptic Systems |
| Synaptobrevin 2 (C1.69.1) | Mysz | Monoklonalne | Synaptic Systems |
| Synaptophysin (C1.7.2) | Mysz | Monoklonalne | Synaptic Systems |
| VGlut1 | Mysz | Monoklonalne | Millipore |
| VGlut1 | Świnka morska | Poliklonalne | Millipore |
| VGlut2 | Świnka morska | Poliklonalne | Millipore |
| Postsynaptyczne | PSD-95 (klon 6G6-1C9) | Mysz | Monoklonalne |
| PSD-95 | Królik | Poliklonalne | Zymed |
| Homer | Mysz | Monoklonalne | Synaptic Systems |
| Homer | Szczur | Poliklonalne | Millipore |
| Gephyrin | Królik | Poliklonalne | Synaptic Systems |
| Gephyrin | Mysz | Monoklonalne | Synaptic Systems |
| Tabela 1: Przedstawia przykłady sprawdzonych markerów pre- i postsynaptycznych, które z powodzeniem wykorzystaliśmy w naszym teście synaptycznym. Należy pamiętać, że nie jest to wyczerpująca lista wszystkich dostępnych markerów. Y = Tak, N = Nie, N.D. = Nie określono. | |||
| PBS | Invitrogen | 20012-027 | |
| poly-d-lizyna | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Laminina | Cultrex | 3400-010-01 | |
| Triton X-100 | Roche Diagnostics Gmbh | 9002-93-1 | |
| Normalne surowica kozia | GIBCO, by Life Technologies | 16210 | |
| VectaShield z DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Tris-Base (50 mM) | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Seryjna albumina wołowa | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| l-lizyna | Sigma-Aldrich | L-1137 | |
| 16% roztwór PFA | Electron Microscopy Sciences | 15711 | |
| Granulowany PFA | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| 24-dołkowa płytka hodowlana | Falcon BD | 35-3047 | |
| Kozie przeciwciała anty-mysie sprzężone z Alexa | Invitrogen | --- | |
| Szklane laminki 12 mm, nr 0 | Karl Hecht Gmbh | 1105209 | |
| Szklana laminka nr 1,5 (do skrawków) | VWR international | 48393241 | |
| Szkiełka szklane | VWR international | 48311-703 |
Bibliografia
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
- Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
