Kwantyfikacja synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego określania liczby synaps

Summary

Ten protokół szczegółowo opisuje, jak określić ilościowo liczbę synaps zarówno w zdysocjowanej hodowli neuronalnej, jak i w sekcjach mózgu za pomocą immunocytochemii. Za pomocą przeciwciał specyficznych dla przedziałów oznaczamy zakończenia presynaptyczne, a także miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Definiujemy synapsy jako punkty kolokalizacji między sygnałami generowanymi przez te markery.

Abstract

Jednym z najważniejszych celów w neuronauce jest zrozumienie molekularnych wskazówek, które instruują wczesne etapy powstawania synaps. W związku z tym konieczne stało się opracowanie obiektywnych podejść do ilościowego określania zmian w połączeniach synaptycznych. Zaczynając od fiksacji próbki, protokół ten szczegółowo opisuje, jak określić ilościowo liczbę synaps zarówno w zdysocjowanej hodowli neuronalnej, jak i w sekcjach mózgu za pomocą immunocytochemii. Za pomocą przeciwciał specyficznych dla przedziałów oznaczamy zakończenia presynaptyczne, a także miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Definiujemy synapsy jako punkty kolokalizacji między sygnałami generowanymi przez te markery. Liczba tych kolokalizacji jest określana ilościowo za pomocą wtyczki do Puncta Analyzer (napisanej przez Bary'ego Warka, dostępnej na żądanie, c.eroglu@cellbio.duke.edu) w ramach platformy oprogramowania analitycznego ImageJ. Test synaps opisany w tym protokole może być zastosowany do dowolnej tkanki nerwowej lub preparatu hodowlanego, dla którego masz selektywne markery pre- i postsynaptyczne. Ten test synaps jest cennym narzędziem, które może być szeroko wykorzystane w badaniu rozwoju synaptycznego.

Protocol

Rozwiązania do przygotowania:

1. Bufor przeciwciał:
   • 150 mM NaCl
   • 50 mM Tris-Base (Fisher, Kat. Nr BP152-5, 50 mM) - 1,21 g
   • 1% BSA (Sigma, Kat. Nr: A2153, 1%) - 2,0 g
   • 100 mM L-lizyna (Sigma, Kat. Nr L-1137, 100 mM) - 3,65 g
   • Dostosuj pH do 7,4
   • 0,04% azydek
   • Dostosować objętość do 200 ml za pomocą destylowanego_H2O.
   • Przefiltruj przez filtr 0,22 μm (Millipore, Kat. Nie: SCGPU02RE).
2. Rozcieńczalnik PFA:
   • 168 ml 0,5 M Na₂HPO₄ (dwuzasadowy)
   • 72 ml 0,5M Na₂HPO₄ (monobasic)
   • 660 ml destylowanego_H2O
3. 4% utrwalacz PFA dla hodowanych neuronów (roztwór #2):
   • 10 ml 16% roztwór PFA (Electron Microscopy Sciences, Kat. Nr artykułu: 15711)
   • 30 ml 4% rozcieńczalnika PFA (roztwór #2)
4. 4% PFA w PBS:
   • 4 g PFA (Nauki o Mikrostropii Elektronowej, Kat. Nr: 19210)
   • 100 ml PBS (Invitrogen, Kat. Nr artykułu: 20012-027)
   • Podgrzać do 40°C, mieszać przez noc.
   • Przefiltruj przez filtr 0,22 μm (Millipore, Kat. Nie: SCGPU02RE)
5. Bufor blokujący (całkowita objętość (dla płytki 24-dołkowej) = (#coverslips+1) x 200 μl)
   • 50% bufor przeciwciał (roztwór #1)
   • 50% Normalna surowica kozia (Gibco, Kat. Nr artykułu: 16210)
   • 0,2% Triton X-100 (Roche Diagnostics Gmbh, Kat. Nr artykułu: 9002-93-1)
6. 30% sacharozy w PBS
   • 30 g sacharozy (MP Biomedicals, Inc., Kat. Nie: 821713)
   • 70 ml PBS (Invitrogen, Kat. Nr artykułu: 20012-027)
   • Mieszaj z mieszadłem, aż sacharoza znajdzie się w roztworze.
   • Zwiększ objętość do 100 ml za pomocą PBS
   • Przefiltruj przez filtr 0,22 μm (Millipore, Kat. Nie: SCGPU02RE)

Przygotowanie kultur neuronalnych:

Opisany tutaj protokół ma zastosowanie do wszystkich pierwotnych kultur neuronalnych hodowanych na 12 mm szklanych szkiełkach nakrywkowych (Karl Hecht, No. O, Cat. Nr: 99010) w płytkach 24-dołkowych (Falcon, 35-3047). Na przykład w naszym laboratorium hodujemy komórki zwojowe siatkówki szczura (RGC) oczyszczone z siatkówki szczura pobranej od zwierząt P5-7^1,2. Komórki hoduje się na szklanych szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-d-lizyną (Sigma, Kat. Nr p: P6407) i mysia laminina (Cultrex, Kat. Nr telefonu: 3400-010-01). Wykorzystujemy to przygotowanie hodowli na kilka różnych sposobów do naszego testu synaps. Jedna z manipulacji, którą wykonujemy, polega na hodowli RGC w obecności lub braku czynników synaptogennych wydzielanych przez astrocyty. Alternatywnie, stosujemy również te różne warunki leczenia w eksperymentach, w których RGC zostały transfekowane w celu nadekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania. W tym drugim przypadku dokonujemy kotransfekcji komórek za pomocą znacznika komórkowego (np. GFP lub tdTomato). Te różne podejścia eksperymentalne wpływają na sposób wykonywania określonych etapów testu synaps, które wyjaśniamy poniżej.

1. Naprawianie zdysocjowanych oczyszczonych RGC

1. Usunąć pożywkę hodowlaną z dołków zawierających RGC i dodać 500 μl (na płytkę 24-dołkową) 4% paraformaldehydu (PFA) podgrzanego do 37°C do każdego dołka. Pozwól komórkom utrwalić się przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
2. Po utrwaleniu przepłukać komórki 3 razy solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) (Invitrogen, Cat. Nr artykułu: 20012-027). WAŻNE: Komórki nigdy nie powinny być pozostawione bez płynu w studzienkach, po usunięciu buforu ze studzienki należy go natychmiast zastąpić następnym buforem. W tym momencie komórki są gotowe do barwienia immunologicznego.

2. Blokowanie nieokreślonych miejsc wiązania na RGC

1. Przygotować bufor blokujący zawierający 50% normalnej surowicy koziej (NGS, Gibco, Kat. Nr: 16210) i 0,2% Triton X-100 (Roche Diagnostics Gmbh, Kat. Nr katalogowy: 9002-93-1). Po usunięciu PBS z każdej studzienki dodać 200 μl buforu blokującego do każdej studzienki i blokować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
2. Usunąć bufor blokujący i przepłukać 3 razy PBS.

3. Stosowanie roztworu przeciwciał pierwotnych

1. WAŻNE: Pamiętaj, aby wybrać przeciwciała pierwszorzędowe dla markerów pre i postsynaptycznych, które są uzyskiwane z różnych gatunków.
2. Przygotuj pierwszorzędowe rozcieńczenie przeciwciał w 90% buforze przeciwciał, 10% roztworze NGS zawierającym wybraną parę przeciwciał pre i postsynaptycznych. Na przykład antysynapsyna królika (marker presynaptyczny) (1:750, domena cytozolowa, systemy synaptyczne) i mysia anty-Homer (marker postsynaptyczny) (1:500, mysz, systemy synaptyczne). WAŻNE: Odwirować rozcieńczenie przeciwciał pierwotnych przez 5 minut z maksymalną prędkością w wirówce stołowej, aby usunąć wszelkie wytrącone przeciwciała.
3. Dodać 200 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do każdej studzienki.
4. Inkubować przez noc w temperaturze 4°C. Płytkę należy umieścić w większym pojemniku, który jest nawilżany, aby zapobiec wysychaniu roztworu pierwotnego. PUNKT PRZERWANIA: Komórki mogą pozostać w pierwotnej mieszaninie przeciwciał przez okres do 3 dni przed kontynuowaniem protokołu.
5. Następnego dnia usuń przeciwciało pierwszorzędowe z każdej studzienki i przepłucz studzienki 3 razy PBS.

4. Stosowanie roztworu przeciwciał wtórnych

1. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego zawierający przeciwciała drugorzędowe rozcieńczone w stosunku 1:1000 w buforze przeciwciał zawierającym 10% NGS. WAŻNE: Odwirować rozcieńczenie przeciwciał wtórnych przez 5 minut z maksymalną prędkością w wirówce stołowej w celu usunięcia wytrąconych przeciwciał. Pominięcie tego kroku skutkuje wysokim tłem przeciwciał drugorzędowych.
   
   Komórki nietransfekowane: W przypadku braku znacznika komórkowego użyj sprzężonych wtórnych Alexa-594 i Alexa-488 do znakowania odpowiednio markerów wstępnych i postsynaptycznych. Na przykład używamy koziego anty-królika Alexa594 do znakowania przeciwciała anty-synapsyny i kozy anty-myszy Alexa-488 sprzężonego wtórnego do oznaczania przeciwciała anty-homerowego. WAŻNE: Użyj sprzężonych drugorzędów Alexa-488 dla przeciwciał pierwszorzędowych o słabszym sygnale.
   
   Komórki transfekowane: Wybierz przeciwciała drugorzędowe, które dostosowują się do widma wzbudzenia-emisji etykiety komórki fluorescencyjnej. Na przykład, kiedy oznaczamy transfekowane komórki tdTomato, używamy Alexa-647 sprzężonego koziego anty-królika do rozpoznania przeciwciała anty-synapsyna i Alexa-488 sprzężonego kozy anty-myszy do rozpoznania przeciwciała anty-homer. Również zastosowanie NGS w tym protokole jest wynikiem naszego wyboru przeciwciał drugorzędowych wytwarzanych u kóz.
2. Dodać 200 μl roztworu przeciwciał wtórnych do każdej studzienki.
3. Po inkubacji przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w ciemnym miejscu, spłucz 3 do 4 razy PBS.

5. Montaż szkiełek nakrywkowych

1. Zamontuj szkiełka nakrywkowe w podłożu montażowym Vectashield za pomocą DAPI (Vector Laboratories Inc., Cat. Nr: H-1200) na szkiełka podstawowe (VWR scientific, Kat. Nr telefonu: 48311-703).
2. Delikatnie nałóż bezbarwny lakier do paznokci wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego i pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 30 minut w suchym, ciemnym miejscu. WAŻNE: Unikaj szturchania lub przesuwania szkiełek nakrywkowych podczas nakładania lakieru do paznokci, ponieważ spowodowałoby to przetarcie komórek.

6. Obrazowanie

Do obrazowania niezbędny jest mikroskop fluorescencyjny wyposażony w kamerę zdolną do robienia zdjęć na 4 różnych kanałach, aby móc obrazować zarówno markery synaptyczne, wypełnienie komórki, jak i jądra (DAPI/opcjonalnie). Komórki powinny być obrazowane za pomocą obiektywu immersyjnego z olejkiem 63x. Obrazowanie wykonujemy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss AxioImager z obiektywem Zeiss Plan-APOCHROMAT 63x/1.4 Oil DIC ∞/0.17.

1. Zaznacz komórki, które są oddalone od swoich najbliższych sąsiadów o co najmniej dwie średnice. Aby uniknąć stronniczości i zapewnić losowość wyboru komórek podczas wizualizacji komórek nietransfekowanych, wybierz komórki w kanale DAPI, a następnie zrób zdjęcia we wszystkich kanałach. Jeśli wizualizujesz transfekowane komórki, wybierz komórki w kanale odpowiadającym znacznikowi fluorescencyjnemu, aby zidentyfikować transfekowane komórki (np. tdTomato).
2. Zdobądź swoje obrazy:
   
   Komórki nietransfekowane: Dla każdej wybranej komórki uzyskaj 8-bitowe obrazy w kanałach GFP i Texas Red. Nałożony pseudokolorowy obraz powinien mieć markery pre- i postsynaptyczne odpowiednio w kolorze czerwonym i zielonym.
   
   Komórki transfekowane: Dla każdej wybranej komórki uzyskuje się 8-bitowe obrazy w kanałach GFP, Texas Red i Cy5 (lub Cy5.5). Nałożony pseudokolorowy obraz powinien mieć markery pre- i postsynaptyczne odpowiednio w kolorze czerwonym i zielonym. Pseudo pokoloruj wypełnienie komórki na niebiesko.

7. Analiza obrazu i kwantyfikacja Puncta w kolokalizacji

1. Używamy programu Puncta Analyzer do kwantyfikacji kolokalizowanych punkcji synaptycznych. Wtyczka Puncta Analyzer została napisana przez Bary'ego Warka i jest dostępna na żądanie (c.eroglu@cellbio.duke.edu). Puncta Analyzer działa w ImageJ 1.26 (http://rsbweb.nih.gov/ij/, nowsze wersje ImageJ nie mogą uruchomić aplikacji). Aby zainstalować Puncta Analyzer, po prostu umieść folder pobranej aplikacji w folderze "Plugins" w katalogu ImageJ 1.26.
2. Otwórz jeden ze swoich obrazów za pomocą ImageJ. Użyj jednego z narzędzi do zaznaczania w menu ImageJ, aby określić obszar zainteresowania (ROI). Regularnie używamy narzędzia do zaznaczania kołowego, aby wybrać obszar o średnicy około jednej komórki promieniście wokół interesującej nas somy.
3. Po wybraniu regionu zainteresowania (ROI) przejdź do menu wtyczek i wybierz "Puncta Analyzer".
4. W wyświetlonym oknie "Opcje analizy" wybierz "Kanał czerwony", "Kanał zielony", pierwszy "Odejmij tło" i "Ustaw plik wyników..." Kliknij "OK". Zostaniesz poproszony o zdefiniowanie lokalizacji, w której chcesz zapisać swoje wyniki. Wyniki te można wyeksportować do programu Excel w celu dalszej analizy.
5. W oknie, które pojawi się obok, upewnij się, że wybrany jest promień toczącej się kuli wynoszący 50 i odznacz opcję "Białe tło" (ta modyfikacja nie jest wymagana, ale często jest preferowana przez użytkowników aplikacji ze względu na łatwość wizualizacji). Kliknij "OK".
6. Pojawi się nowe okno wraz z maską odpowiadającą czerwonemu obrazowi kanału. Dostosuj próg, aż poczujesz, że czerwona maska odpowiada jak najlepiej jak największej liczbie dyskretnych pojedynczych punktów bez wprowadzania zbyt dużego hałasu. Jest to jeden z najbardziej subiektywnych kroków tego protokołu, dlatego należy zadbać o wypracowanie spójnego podejścia. Kliknij "Gotowe". Ustaw minimalny rozmiar puncta na 4 piksele i nie modyfikuj niczego więcej. Kliknij "OK".
7. Powtórz poprzedni krok, tym razem dla kanału zielonego.
8. Po wykonaniu poprzedniego kroku wtyczka zapewni kwantyfikację odpowiadającą puncta w każdym kanale osobno i kolokalizowanej puncta między dwoma kanałami.

SEKCJE MÓZGU:

Test synaps może być zastosowany do kriosekcji z mózgu i do każdej innej tkanki układu nerwowego (takiej jak rdzeń kręgowy lub siatkówka), pod warunkiem, że istnieje odpowiednia para markerów pre- i postsynaptycznych (z przeciwciałami, które dobrze działają w sekcjach), które można wykorzystać do identyfikacji synaps, które chcesz określić ilościowo. Test synaps może ujawnić czasową regulację tworzenia synaps w danym regionie mózgu i może określić ilościowo wpływ na łączność synaptyczną u zwierząt transgenicznych lub w próbce, która została zmanipulowana w inny sposób.

1. Pobieranie tkanki mózgowej od myszy

Wszystkie procedury na zwierzętach powinny być wykonywane zgodnie z protokołami IACUC na zwierzętach.

1. Eutanazja myszy przez wykrwawienie i perfuzję z PBS. Perfuzja z PBS ma kluczowe znaczenie dla usunięcia krwi i zmniejszy sygnał tła dla procedur barwienia. WAŻNE: Nie stosować utrwalaczy takich jak 4% PFA. Wpłynie to negatywnie na wyniki barwienia.

2. Fiksacja

1. Utrwal cały mózg w 4% PFA w PBS w temperaturze 4°C przez noc. Następnego dnia przepłucz mózgi 3 razy PBS.
2. Krioprotekcja mózgów, umieszczając je w 30% sacharozy w PBS. Tkanka początkowo będzie unosić się na wodzie. Przechowywać w temperaturze 4°C, aż chusteczka opadnie na dno. Na tym etapie krioochrona jest zakończona.

3. Osadzanie/kriosekcja

1. Osadź mózgi w pożądanej orientacji do cięcia (np. strzałkowej lub czołowej) w roztworze 2:1 30% sacharozy:OCT (Tissue-Tek, Cat. Nr telefonu: 4583) w PBS. Zamroź osadzone mózgi na płaskiej powierzchni suchego lodu. Zamrożone osadzone mózgi można umieścić w torebkach do zamrażania i przechowywać w temperaturze -80 do roku przed sekcją.
2. Kriosekcja tkanki na odcinki 12-16 μm i montaż na szkiełkach podstawowych (Sigma, Kat. Nr katalogowy: S4651). Szkiełka można przechowywać do tygodnia w temperaturze -80°C przed barwieniem.
3. Szkiełka przeznaczone do barwienia należy suszyć w temperaturze 37°C przez 30 minut i płukać 1x PBS w celu usunięcia resztek OCT.

4. Sekcje blokujące

1. Blokuj skrawki w 20% normalnej surowicy koziej (NGS) w PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. WAŻNE: Na tym etapie nie dołączaj Triton X-100. Przed dodaniem roztworu blokującego można stworzyć hydrofobową barierę wokół sekcji na zjeżdżalni za pomocą Elite PAP Pen (DBS, Cat. Nr: K039)

5. Stosowanie przeciwciał pierwotnych

1. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w PBS 0,3% trytonem i 10% NGS.
2. W skrawkach mózgu używamy PSD-95 (Zymed, Rabbit, 1:500) do oznaczania glutaminergicznego postsynaptycznego przedziałów i VGlut1 lub VGlut2 (Chemicon, świnka morska, 1:2500) do oznaczania glutaminergicznego zakończenia presynaptycznego. Odwirować rozcieńczenie przeciwciał pierwotnych przez 5 minut z maksymalną prędkością w wirówce stołowej w celu usunięcia wytrąconego przeciwciała, jeśli jest obecne.
3. Inkubować skrawki w roztworze przeciwciała pierwotnego przez 36-60 godzin w temperaturze 4°C.

6. Stosowanie przeciwciał drugorzędowych

1. Zmyj przeciwciało pierwotne, zanurzając szkiełka 3x w PBS na 15 minut każda. Po wykonaniu tego kroku upewnij się, że chronisz prowadnice przed bezpośrednim światłem.
2. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w rozcieńczeniu 1:200 w tym samym buforze, jak opisano dla przeciwciał pierwszorzędowych. Na przykład do barwienia VGlut/PSD95 używamy koziego anty świnki morskiej Alexa 488 (Vglut) i kozy anty królika Alexa 594 (PSD-95) (Invitrogen).
3. Inkubować skrawki w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.
4. Zmyj niezwiązane przeciwciała drugorzędowe ze szkiełek, zanurzając szkiełka 4x w PBS na 15 minut każda.

7. Montaż

1. Nanieś małe krople podłoża montażowego Vectashield z DAPI (Vector Laboratories Inc.) na szkiełka podstawowe (VWR scientific), a następnie przykryj szkiełka nakrywkowe szkiełkami nakrywkowymi (VWR Scientific, nr 1.5, 48393 241). Nałóż lakier do paznokci, aby zahamować ruch szkiełek nakrywkowych.

8. Obrazowanie

WAŻNE: Do opisanego tutaj obrazowania wymagany jest mikroskop konfokalny z co najmniej 3 kanałami. Obrazujemy za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Leica SP5 przy użyciu obiektywu zanurzeniowego z olejkiem o powiększeniu 63x.

1. Synaptyczne obszary mózgu będące przedmiotem zainteresowania powinny być wybierane do skanowania w sposób spójny między sekcjami. Na przykład w naszym teście synaps synaps komórek zwojowych siatkówki na górnych neuronach kolkularnych, obrazujemy zewnętrzny górny obszar kolikularny przylegający do dolnego wzgórka, który obejmuje warstwę synaptyczną, która odbiera zakończenia siatkówkowo-kolnikowe^7,8,9. Obrazujemy i określamy ilościowo synapsy w górnej strefie synaptycznej 150 μm górnego wzgórka, o której wiadomo, że RGC nawiązują kontakty synaptyczne⁹.
2. Dla każdej sekcji, zarówno w kanałach 488, jak i 594, obrazujemy szeregowe sekcje optyczne w odstępach 0,33 μm na łącznej głębokości 5 μm, co daje łącznie 15 sekcji optycznych. Muszą być zobrazowane co najmniej 3 skrawki z każdego zwierzęcia i co najmniej 3 zwierzęta z danego warunku doświadczalnego.
3. Projekcje maksymalnej intensywności (MIP) są generowane z grup 3 kolejnych sekcji, z których każda daje 5 MIP reprezentujących 1 μm głębokości. Minimalne wymogi dotyczące zakłóceń równowagi makroekonomicznej są określane ilościowo.

9. Kwantyfikacja obrazu

1. Można je wykonać dokładnie tak, jak opisano dla RGC, jednak kształt i rozmiar ROI zmieni się w zależności od regionu obrazów, który chcesz określić ilościowo.

Klucze do sukcesu:

Oczyszczone RGC:

1. Przed utrwaleniem oczyszczonych RGC (lub innych zdysocjowanych kultur) należy wstępnie podgrzać 4% PFA w łaźni wodnej ustawionej na 37°C przez ~20-25 minut (w pozostałych przypadkach przechowywać w temperaturze 4°C, nie używać rozcieńczeń PFA starszych niż 7 dni).
2. Szczególnie w przypadku hodowanych neuronów zaleca się, aby nie używać aspiratora próżniowego podczas mycia na wszystkich etapach płukania. Łagodniejsze metody, takie jak użycie pipety Pasteura i gruszki ssącej, zauważalnie poprawiają jakość barwienia.
3. Uważaj, aby komórki nie wyschły podczas etapów płukania.
4. Unikaj szturchania lub przesuwania szkiełek nakrywkowych podczas nakładania lakieru do paznokci, ponieważ może to spowodować ścinanie komórek na szkiełku nakrywkowym.
5. Odkręć wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe, aby wyeliminować wszelkie wytrącone przeciwciała, które negatywnie wpłyną na barwienie.
6. Pamiętaj, aby wybrać przeciwciała pierwszorzędowe dla markerów pre- i postsynaptycznych podniesionych u różnych gatunków. Niezastosowanie się do tego wyeliminuje twoją zdolność do rozróżniania dwóch sygnałów po zastosowaniu przeciwciał drugorzędowych.

Sekcje mózgu:

1. Nie należy perfować myszy utrwalaczami, takimi jak PFA.
2. Nie należy włączać Triton-X 100 do roztworu blokującego sekcje mózgu. Pogarsza to jakość barwienia markerów presynaptycznych, w szczególności markerów presynaptycznych, które są związane z pęcherzykami synaptycznymi.
3. Użycie mikroskopu konfokalnego do obrazowania jest wymagane do uzyskania obrazu, który jest wystarczająco dobrej jakości, aby przeprowadzić analizę synaps.

Reprezentatywne wyniki:

Opisany powyżej test synaps jest przeznaczony do wychwytywania zmian w połączeniach synaptycznych in vitro i in vivo. W naszym laboratorium wykorzystujemy test synaps do określenia wpływu pojedynczych lub wielu cząsteczek wydzielanych przez astrocyty na tworzenie synaps. Zwykle wykonujemy ten test synaps na oczyszczonych RGC, które hodujemy in vitro.

Dobrze opisanym efektem przewlekłego stosowania pożywek kondycjonowanych przez astrocyty (ACM) w oczyszczonych kulturach RGC jest wielokrotny wzrost liczby synaps, które powstają między RGC^3,4,5,6. Ryciny 1A i 1B pokazują reprezentatywne obrazy nietransfekowanych, oczyszczonych RGC traktowanych albo podstawowymi pożywkami wzrostowymi, albo ACM. Po barwieniu pod kątem pobudzających markerów pre- i postsynaptycznych, indukowany przez ACM wzrost tworzenia synaps jest jakościowo widoczny (ryc. 1A, 1B). Rzeczywiście, odkrycie to zostało potwierdzone przez kilka badań, w których wykorzystano elektrofizjologię, aby wykazać, że synapsy indukowane przez ACM są funkcjonalne, oraz mikroskopię elektronową, aby pokazać, że synapsy są ultrastrukturalnie normalne^3,4,6. Inne prace w naszym laboratorium zidentyfikowały podjednostkę kanału wapniowego α2δ-1 jako receptor neuronalny dla silnie synaptogennej cząsteczki wydzielanej przez astrocyty, trombospondyny³. W tym miejscu zamieszczamy wyniki eksperymentu na oczyszczonych RGC, który został przeprowadzony w celu ustalenia, czy podwyższony poziom α2δ-1 dodatkowo zwiększa tworzenie synaps indukowanych przez ACM (ryc. 3).

RGC były kotransfekowane albo pustym wektorem, albo konstruktem kodującym α2δ-1 z oddzielnym konstruktem kodującym tdTomato po 5 dniach in vitro (DIV5). Po przewlekłym leczeniu ACM lub GM, RGC zostały utrwalone i wybarwione na DIV 11. Po znakowaniu immunologicznym markerów pre- i postsynaptycznych synaps pobudzających obserwujemy jakościowo oczywisty wzrost liczby synaps w oczyszczonych RGC wyrażających albo pusty wektor (pcDNA3.1), albo α2δ-1 (ryc. 1C, 1D). Określamy ilościowo efekt synaptogenny ACM za pomocą analizatora Puncta do policzenia liczby synaps (ryc. 2) dla co najmniej 15 neuronów z każdego stanu. Próbka tej wielkości pozwala nam obliczyć średnią liczbę synaps na neuron i znaleźć statystycznie istotny, ~10-krotny wzrost synaps tworzonych przez neurony traktowane ACM, które wyrażają pusty wektor (ryc. 3, szare paski). Ponadto wykazujemy, że nadekspresja α2δ-1 prowadzi do znacznego nasilenia tworzenia synaps indukowanych przez ACM (~20-krotnie. Rys. 3, czarne paski).

Oprócz hodowanych neuronów, możemy za pomocą tej techniki określić ilościowo gęstość synaps w różnych regionach mózgu. Wzgórek górny to struktura mózgu, która odbiera projekcje siatkówkowo-kolnikowe, pochodzące z RGC w siatkówce^7,8,9. W okresie pourodzeniowym liczba synaps pobudzających tworzonych przez RGC na ich cele w wzgórku górnym dramatycznie wzrasta z P7 do P21^7,8,9.

Korzystając z naszej techniki kwantyfikacji, pokazujemy, że liczba synaps siatkówkowo-kolczastych utworzonych w górnym wzgórku wzrasta z P7 do P14. Aby to zrobić, określiliśmy ilościowo gęstość synaptyczną na poziomie P7 i ponownie na poziomie P14. Barwimy wzgórek górny pod kątem PSD-95 (postsynaptyczny) i VGlut2 (marker presynaptyczny specyficzny dla synaps RGC w wzgórku górnym). Zobrazowano zewnętrzny obszar synaptyczny górnego wzgórka (ryc. 4A), a kolokalizowane synapsy VGlut2 / PSD-95 określono ilościowo (ryc. 4B, 4C) z co najmniej 3 sekcji na zwierzę i z co najmniej 3 zwierząt na punkt czasowy. Kwantyfikacja uzyskanych danych wyraźnie wskazuje na ponad trzykrotny istotny wzrost liczby synaps między P7 i P14. Wyniki te są zgodne z wcześniej opublikowanymi odkryciami wykorzystującymi mikroskopię elektronową (ryc. 4D)⁹.

Podsumowując, opisana tutaj metoda kwantyfikacji liczby synaps jest użytecznym narzędziem do określania liczby i gęstości synaps w kulturze i w tkankach nerwowych, umożliwiając nam badanie efektów manipulowania tworzeniem synaps in vitro lub in vivo.

Rysunek 1: Reprezentatywne barwienie synaptyczne w oczyszczonych RGC. (A i B) 3-dniowe RGC in vitro (DIV) hodowano albo w (A) podstawowej pożywce wzrostowej (GM), albo w (B) prosynaptogennej pożywce kondycjonowanej astrocytami myszy (ACM) przez dodatkowe 6 dni. Komórki zostały następnie oznaczone jako fagot (presynaptyczny, czerwony) i Homer (postsynaptyczny, zielony). Mysi ACM silnie stymuluje tworzenie synaps między RGC, co jest determinowane wzrostem liczby kolokalizowanych fagotów i homer puncta. (C i D) 5DIV RGC transfekowano plazmidem w celu nadekspresji podjednostki kanału wapniowego α2δ-1. Transfekowane komórki zidentyfikowano za pomocą wypełnienia komórkami tdTomato (niebieskimi) i wybarwiono je pod kątem synapsyny markerowej synapsyny i markera postsynaptycznego Homera. Strzałki wskazują synapsy. Podziałka liniowa reprezentuje 20 μm.

Rysunek 2: Kwantyfikacja liczby synaps za pomocą Puncta Analyzer. Pokazano tutaj przykład (a) oryginalnego obrazu oczyszczonej komórki zwojowej siatkówki z nadekspresją receptora trombospondyny α2δ-1 i jest barwiony na synapsynę markera presynaptycznego i marker postsynaptyczny Homera. (b) Obrazy odpowiadające maskom utworzonym w każdym kanale podczas analizy puncta w Puncta Analyzer. (c) Puncta Analzyer stworzy obraz taki jak ten pokazany tutaj, na którym puncta są oznaczone małymi czarnymi kropkami (wstawka). Pokazane jest również (d) numeryczne wyjście aplikacji, w którym numer puncta wraz z kilkoma innymi parametrami są podane w formie tekstowej/numerycznej (pogrubiony tekst dodany dla podkreślenia).

Rysunek 3: Reprezentatywny wynik dla testu synaps. Pokazano tutaj synaptogenny efekt przewlekłego leczenia RGC pożywkami kondycjonowanymi przez astrocyty (ACM) w transfekowanych RGC eksprymujących albo pusty wektor (pcDNA3.1, szare paski), albo receptor trombospondyny α2δ-1. Słupki błędów reprezentują SEM. GM = Growth Media. ACM = (szczur) pożywka kondycyjna astrocytów.

Rysunek 4: Kwantyfikacja gęstości synaptycznej u górnego wzgórka myszy (a) Aby określić zmiany rozwojowe w liczbie synaps glutaminergicznym tworzonych przez RGC na ich nadrzędnych celach kolkularnych w mózgu gryzoni, zabarwiliśmy kriosekcje z mózgu myszy przeciwciałami przeciwko markerowi presynaptycznemu VGlut2 (zielony) i markerowi postsynaptycznemu, PSD-95, (czerwony). Zobrazowaliśmy zewnętrzny obszar 150 x 150 μm wzgórka górnego myszy (SC) odpowiadający synaptycznemu regionowi docelowemu dla RGC za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Pobrano stos z dla każdej sekcji SC dla całkowitej głębokości 5 μm (15 x 0,33 μm sekcji optycznych). Maksymalne projekcje obrazu (MIP) zostały wygenerowane dla grup 3 kolejnych sekcji optycznych, co dało 5 MIPs/sekcję, z których każda reprezentowała 1 μm głębokości. Poniżej pokazano reprezentatywny MIP pobrany z górnego wzgórka myszy P14 WT. Marker presynaptyczny, VGlut2, jest pokazany na zielono, a marker postsynaptyczny, PSD-95, jest pokazany na czerwono. (c) Dane liczbowe generowane przez Puncta Analyzer. (d) Kwantyfikacja analizy liczby synaps dla co najmniej 3 odcinków na zwierzę z 3 zwierzętami na punkt czasowy (słupki błędu reprezentują SEM). Podziałka skali reprezentuje 50 μm.

Discussion

Opisany powyżej test synaps opiera się na naszych celach eksperymentalnych, w których skupiamy się głównie na pobudzających projekcjach RGC, zarówno w oczyszczonej kulturze, jak i w części mózgu. Przedstawiliśmy tabelę referencyjną z listą przeciwciał, które dobrze sprawdzają się w znakowaniu synaps pobudzających (Tabela 1).

Ten test synaps można dostosować do ilościowego określenia liczby synaps dowolnej populacji neuronów lub dowolnego innego podtypu synaptycznego, dla którego istnieje sele...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Presynaptyczna	synapsyna	Królik	Poliklonalna
synapsyna	Mysz	Monoklonalne	systemy synaptyczne
Fagot	Mysz	Monoklonalne	testy Projekty
Fagot	Świnka morska	Poliklonalne	systemy synaptyczne
Synaptotagmin 1		Poliklonalne	systemy
synaptyczne królikaSynaptobrevin 2 (C1.69.1)	Mysie	monoklonalne	systemy synaptyczne
Synaptofizyna (C1.7.2)	Mysie	monoklonalne	systemy synaptyczne
VGlut1	Mysz	monoklonalna	miliporowa
VGlut1	Świnka morska	Poliklonalny	milipor
VGlut2	Świnka morska	Poliklonalna	milipora
postsynaptyczna	PSD-95 (klon 6G6-1C9)	Mysz	monoklonalna
PSD-95		Królik Poliklonalny	Zymed
Homer	Mysz	Monoklonalne	systemy synaptyczne
Homer	Szczur	Poliklonalny	milipor
Gefiryna	Królik	Poliklonalne	systemy synaptyczne
Gephyrin		Mysz Monoklonalne	systemy synaptyczne
Tabela 1: Wymienia przykłady dobrych markerów pre- i postsynaptycznych, które z powodzeniem wykorzystaliśmy w naszym teście synaps. Należy pamiętać, że nie jest to wyczerpująca lista wszystkich dostępnych znaczników. Y = tak, N = Nie, N.D. = Nieokreślone.
PBS	Invitrogen	20012-027
poli-d-lizyna	Sigma-Aldrich	P6407
Laminin	Cultrex	3400-010-01
Triton X-100	Roche Diagnostics Gmbh	9002-93-1
Normalna surowica kozia	GIBCO, firmy Life Technologies	16210
VectaShield z DAPI	Vector Laboratories	H-1200
OCT	Tissue-Tek	4583
Tris-Base (50 mM)	Fisher Scientific	BP152-5
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma-Aldrich	A2153
l-lizyna	Sigma-Aldrich	L-1137
16% roztwór PFA	Mikroskopia elektronowa Sciences	15711
Granulowany elektron PFA	Nauki mikroskopowe	19210
24-dołkowa płytka	hodowlana Falcon BD	35-3047
Kozie przeciwciała anty-mysie Alexa	Invitrogen	---
12mm, szkiełka nakrywkowe szklane nr 0	Karl Hecht Gmbh	1105209
Szkiełko nakrywkowe nr 1,5 (na plastry)	VWR International	48393241
Szkiełka	podstawoweVWR międzynarodowy	48311-703