Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps

Podsumowanie

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.

Streszczenie

Jednym z najważniejszych celów w neuronauce jest zrozumienie sygnałów molekularnych, które sterują wczesnymi etapami formowania się synaps. W związku z tym konieczne stało się opracowanie obiektywnych metod ilościowego określania zmian w łączności synaptycznej. Niniejszy protokół, rozpoczynając od utrwalania próbek, szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronów, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery. Liczbę tych kolokalizacji określa się ilościowo za pomocą wtyczki Puncta Analyzer (autorstwa Bary'ego Warka, dostępna na zapytanie, c.eroglu@cellbio.duke.edu) w ramach oprogramowania analitycznego ImageJ. Opisany w tym protokole test synaptyczny może być zastosowany do dowolnej tkanki nerwowej lub preparatu hodowlanego, dla których dysponuje się selektywnymi markerami presynaptycznymi i postsynaptycznymi. Ten test synaptyczny stanowi wartościowe narzędzie, które może być szeroko wykorzystywane w badaniach nad rozwojem synaps.

Protokół

Roztwory do przygotowania:

1. Bufor do przeciwciał:
   • 150 mM NaCl
   • 50 mM Tris-Base (Fisher, nr kat.: BP152-5, 50 mM) – 1,21 g
   • 1% BSA (Sigma, nr kat.: A2153, 1%) – 2,0 g
   • 100 mM _L-lizyna (Sigma, nr kat.: L-1137, 100 mM) – 3,65 g
   • Dostosować pH do 7,4
   • 0,04% azotek
   • Dopełnić objętość do 200 ml destylowaną H₂O.
   • Przefiltrować przez filtr 0,22μm (Millipore, nr kat.: SCGPU02RE).
2. Rozcieńczalnik PFA:
   • 168 ml 0,5 M Na₂HPO₄ (zasadowy)
   • 72 ml 0,5M Na₂HPO₄ (jednopodstawny)
   • 660 ml destylowanej H₂O
3. Fiksator 4% PFA do hodowlanych neuronów (roztwór nr 2):
   • 10 ml 16% roztworu PFA (Electron Microscopy Sciences, nr kat.: 15711)
   • 30 ml rozcieńczalnika 4% PFA (roztwór nr 2)
4. 4% PFA w PBS:
   • 4 g PFA (Electron Microscropy Sciences, nr kat.: 19210)
   • 100 ml PBS (Invitrogen, nr kat.: 20012-027)
   • Podgrzać do 40°C, mieszać przez noc.
   • Przefiltrować przez filtr 0,22μm (Millipore, nr kat.: SCGPU02RE)
5. Bufor blokujący (Objętość całkowita (dla płytki 24-dołkowej) = (#szkiełek osłonowych+1) x 200μl)
   • 50% buforu do przeciwciał (roztwór nr 1)
   • 50% normalnego surowicy koziej (Gibco, nr kat.: 16210)
   • 0,2% Triton X-100 (Roche Diagnostics Gmbh, nr kat.: 9002-93-1)
6. 30% sacharozy w PBS
   • 30 g sacharozy (MP Biomedicals, Inc., nr kat.: 821713)
   • 70 ml PBS (Invitrogen, nr kat.: 20012-027)
   • Mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego do całkowitego rozpuszczenia sacharozy.
   • Dopełnić objętość do 100ml za pomocą PBS
   • Przefiltrować przez filtr 0,22 μm (Millipore, nr kat.: SCGPU02RE)

Przygotowanie kultur neuronalnych:

Opisany tutaj protokół ma zastosowanie do dowolnych pierwotnych kultur neuronów hodowanych na szklanych szkiełkach przedmiotowych o średnicy 12 mm (Karl Hecht, No. O, nr kat.: 99010) w płytkach 24-dołkowych (Falcon, 35-3047). Na przykład w naszym laboratorium hodujemy komórki zwoju siatkówki (RGCs) szczura, oczyszczone z siatkówki pobranej od zwierząt w dniach P5-7^1,2. Komórki są hodowane na szklanych szkiełkach pokrytych poli-d-lizyną (Sigma, nr kat.: P6407) i lamininą mysią (Cultrex, nr kat.: 3400-010-01). Przygotowaną w ten sposób kulturę wykorzystujemy na kilka różnych sposobów w naszym teście synaptycznym. Jedna z przeprowadzanych przez nas manipulacji polega na hodowaniu RGCs w obecności lub w absence czynników synaptogennych wydzielanych przez astrocyty. Alternatywnie stosujemy te różne warunki traktowania w eksperymentach, w których RGCs zostały poddane transfekcji w celu nadekspresji białka zainteresowania. W tym drugim przypadku współtransfekujemy komórki markerem komórkowym (np. GFP lub tdTomato). Te różne podejścia eksperymentalne wpływają na sposób wykonywania niektórych etapów testu synaptycznego, co wyjaśniamy poniżej.

1. Fixowanie dysocjowanych, oczyszczonych komórek zwojowych siatkówki (RGCs)

1. Usunąć pożywkę hodowlaną z dołków zawierających RGC i do każdego z nich dodać 500 μl (dla płytki 24-dołkowej) 4% paraformaldehydu (PFA) podgrzanego wstępnie do 37°C. Pozostawić komórki do utrwalenia na 7 minut w temperaturze pokojowej.
2. Po utrwaleniu przepłukać komórki 3 razy roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) (Invitrogen, nr kat.: 20012-027). WAŻNE: Komórki w dołkach nigdy nie powinny pozostawać bez cieczy; po usunięciu buforu z dołka należy go niezwłocznie zastąpić kolejnym buforem. Na tym etapie komórki są gotowe do barwienia immunocytochemicznego.

2. Blokowanie niespecyficznych miejsc wiązania w RGC

1. Przygotować bufor blokujący zawierający 50% normalnego surowicy koziej (NGS, Gibco, nr kat.: 16210) oraz 0,2% Triton X-100 (Roche Diagnostics Gmbh, nr kat.: 9002-93-1). Po usunięciu PBS z każdego dołka, dodać 200 μl buforu blokującego do każdego dołka i inkubować w celu blokowania przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
2. Usunąć bufor blokujący i wypłukać 3 razy za pomocą PBS.

3. Nakładanie roztworu przeciwciała pierwszorzędowego

1. WAŻNE: Należy upewnić się, że przeciwciała pierwszorzędowe do markerów presynaptycznych i postsynaptycznych pochodzą z różnych gatunków.
2. Przygotować rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych w roztworze zawierającym 90% buforu do przeciwciał i 10% NGS, zawierającym wybraną parę przeciwciał presynaptycznych i postsynaptycznych. Na przykład królicze przeciwciało anty-synapsyna (marker presynaptyczny) (1:750, domena cytozolowa, Synaptic Systems) oraz mysie przeciwciało anty-Homer (marker postsynaptyczny) (1:500, mysie, Synaptic Systems). WAŻNE: Rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych należy wirować przez 5 minut z maksymalną prędkością w wirówce laboratoryjnej w celu usunięcia wszelkich wytrąconych przeciwciał.
3. Do każdego dołka dodać 200 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych.
4. Inkubować przez noc w temperaturze 4°C. Płytkę należy umieścić w większym pojemniku z nawilżaczem, aby zapobiec wysychaniu roztworu przeciwciał pierwszorzędowych. PUNKT PRZERWANIA: Komórki mogą pozostawać w mieszaninie przeciwciał pierwszorzędowych do 3 dni przed kontynuacją protokołu.
5. Następnego dnia usunąć przeciwciała pierwszorzędowe z każdego dołka i przepłukać dołki 3 razy roztworem PBS.

4. Nakładanie roztworu przeciwciała wtórnego

1. Przygotować roztwór przeciwciał wtórnych, rozcieńczając przeciwciała wtórne w stosunku 1:1000 w buforze do przeciwciał zawierającym 10% NGS. WAŻNE: Rozcieńczenie przeciwciał wtórnych należy wirować przez 5 minut z maksymalną prędkością w wirówce stołowej w celu usunięcia wytrąconych przeciwciał. Pominięcie tego kroku skutkuje wysokim tłem przeciwciał wtórnych.
   
   Komórki nietransfekowane: W przypadku braku markera komórkowego należy użyć przeciwciał wtórnych sprzężonych z Alexa-594 i Alexa-488 odpowiednio do znakowania markerów presynaptycznych i postsynaptycznych. Na przykład stosujemy przeciwciało kozie anty-królicze Alexa-594 do znakowania przeciwciała anty-synapsyna oraz przeciwciało kozie anty-mysie sprzężone z Alexa-488 do znakowania przeciwciała anty-homer. WAŻNE: Do przeciwciał pierwszorzędowych o słabszym sygnale należy stosować przeciwciała wtórne sprzężone z Alexa-488.
   
   Komórki transfekowane: Należy dobrać przeciwciała wtórne dopasowane do widma wzbudzenia i emisji zastosowanego fluorescencyjnego markera komórkowego. Na przykład, gdy znakujemy transfekowane komórki białkiem tdTomato, stosujemy przeciwciało kozie anty-królicze sprzężone z Alexa-647 do rozpoznawania przeciwciała anty-synapsyna oraz przeciwciało kozie anty-mysie sprzężone z Alexa-488 do rozpoznawania przeciwciała anty-homer. Ponadto zastosowanie NGS w tym protokole wynika z wyboru przeciwciał wtórnych produkowanych w kozie.
2. Do każdego dołka dodać 200 μl roztworu przeciwciał wtórnych.
3. Po dwóchgodzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej w ciemności, wypłukać 3 do 4 razy roztworem PBS.

5. Montowanie szkiełek nakrywkowych

1. Przymocuj szkiełka nakrywkowe za pomocą medium montażowego Vectashield z DAPI (Vector Laboratories Inc., nr kat.: H-1200) do szkiełek przedmiotowych (VWR scientific, nr kat.: 48311-703).
2. Ostrożnie nanieś bezbarwny lakier do paznokci wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego i pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 30 minut w suchym, ciemnym miejscu. WAŻNE: Należy unikać przesuwania lub poruszania szkiełkami nakrywkowymi podczas nakładania lakieru, ponieważ mogłoby to doprowadzić do odrywania komórek.

6. Obrazowanie

Do obrazowania niezbędny jest mikroskop fluorescencyjny wyposażony w kamerę zdolną do wykonywania zdjęć w 4 różnych kanałach, aby umożliwić obrazowanie zarówno markerów synaptycznych, wypełnienia komórki, jak i jąder (DAPI/opcjonalnie). Obrazowanie komórek należy przeprowadzić przy użyciu obiektywu immersyjnego olejowego 63x. W naszych badaniach wykorzystujemy mikroskop fluorescencyjny Zeiss AxioImager z obiektywem Zeiss Plan-APOCHROMAT 63x/1.4 Oil DIC ∞/0.17.

1. Wybierz komórki, które znajdują się w odległości co najmniej dwóch średnic komórki od swoich najbliższych sąsiadów. Aby uniknąć błędu systematycznego i zapewnić losowość wyboru komórek podczas wizualizacji komórek nietransfekowanych, wybierz komórki w kanale DAPI, a następnie wykonaj zdjęcia we wszystkich kanałach. W przypadku wizualizacji komórek transfekowanych, wybierz komórki w kanale odpowiadającym znacznikowi fluorescencyjnemu, aby zidentyfikować komórki transfekowane (np. tdTomato).
2. Wykonaj zdjęcia:
   
   Komórki nietransfekowane: Dla każdej wybranej komórki uzyskaj obrazy 8-bitowe w kanałach GFP i Texas Red. Na nałożonym obrazie w pseudokolorach markery presynaptyczne i postsynaptyczne powinny być odpowiednio w kolorze czerwonym i zielonym.
   
   Komórki transfekowane: Dla każdej wybranej komórki uzyskaj obrazy 8-bitowe w kanałach GFP, Texas Red i Cy5 (lub Cy5.5). Na nałożonym obrazie w pseudokolorach markery presynaptyczne i postsynaptyczne powinny być odpowiednio w kolorze czerwonym i zielonym. Wypełnienie komórki nadaj w pseudokolorze niebieskim.

7. Analiza obrazów i kwantyfikacja kolokalizacji punktów

1. Do kwantyfikacji kolokalizujących punktów synaptycznych wykorzystujemy program Puncta Analyzer. Wtyczka Puncta Analyzer została napisana przez Bary’ego Warka i jest dostępna na życzenie (c.eroglu@cellbio.duke.edu). Puncta Analyzer działa w programie ImageJ 1.26 (http://rsbweb.nih.gov/ij/, nowsze wersje ImageJ nie obsługują tej aplikacji). Aby zainstalować Puncta Analyzer, należy umieścić pobrany folder aplikacji w folderze „Plugins” w katalogu ImageJ 1.26.
2. Otwórz jeden z obrazów za pomocą programu ImageJ. Użyj jednego z narzędzi zaznaczania w menu ImageJ, aby wyznaczyć obszar zainteresowania (ROI). Regularnie stosujemy okrągłe narzędzie zaznaczania, aby wybrać obszar o promieniu odpowiadającym w przybliżeniu średnicy jednej komórki wokół analizowanego somy.
3. Po zaznaczeniu obszaru zainteresowania (ROI) przejdź do menu wtyczek i wybierz „Puncta Analyzer”.
4. W pojawiającym się oknie „Analysis Options” zaznacz „Red Channel”, „Green Channel”, pierwsze „Subtract Background” oraz „Set results file....”. Kliknij „OK”. Zostaniesz poproszony o określenie lokalizacji zapisu wyników. Wyniki te można wyeksportować do programu Excel w celu dalszej analizy.
5. W oknie, które pojawi się następnie, upewnij się, że wybrany jest promień toczącej się kuli (rolling ball radius) wynoszący 50 i odznacz opcję „White Background” (modyfikacja ta nie jest wymagana, ale jest często preferowana przez użytkowników aplikacji dla łatwiejszej wizualizacji). Kliknij „OK”.
6. Pojawi się nowe okno wraz z maską odpowiadającą obrazowi z kanału czerwonego. Dostosuj próg (threshold) tak, aby czerwona maska jak najlepiej odpowiadała jak największej liczbie dyskretnych, pojedynczych punktów, nie wprowadzając przy tym zbyt dużego szumu. Jest to jeden z najbardziej subiektywnych etapów tego protokołu, dlatego należy zadbać o opracowanie spójnego podejścia. Kliknij „Done”. Ustaw minimalny rozmiar punktu na 4 piksele i nie zmieniaj niczego innego. Kliknij „OK”.
7. Powtórz poprzedni krok, tym razem dla kanału zielonego.
8. Po zakończeniu poprzedniego kroku wtyczka przedstawi kwantyfikację odpowiadającą punktom w każdym kanale osobno oraz punktom kolokalizującym się w obu kanałach.

PRZEKROJE MÓZGU:

Analizę synaps można zastosować do krioprzecięć mózgu oraz do każdej innej tkanki układu nerwowego (np. rdzenia kręgowego lub siatkówki), pod warunkiem dostępności odpowiedniej pary markerów presynaptycznych i postsynaptycznych (z przeciwciałami, które dobrze działają w preparatach tkankowych), które można wykorzystać do identyfikacji synaps przeznaczonych do kwantyfikacji. Analiza synaps pozwala na ukazanie regulacji czasowej tworzenia się synaps w danej okolicy mózgu oraz na kwantyfikację wpływu na łączność synaptyczną u zwierząt transgenicznych lub w próbkach poddanych innym modyfikacjom.

1. Pobieranie tkanki mózgowej myszy

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt powinny być wykonywane zgodnie z protokołami IACUC dotyczącymi zwierząt.

1. Uśmierć myszy poprzez upuszczenie krwi i perfuzję roztworem PBS. Perfuzja PBS jest kluczowa dla usunięcia krwi i pozwoli zredukować sygnał tła podczas procedur barwienia. WAŻNE: Nie należy przeprowadzać perfuzji utrwalaczami, takimi jak 4% PFA, ponieważ wpłynie to negatywnie na wyniki barwienia.

2. Fiksacja

1. Utrwal cały mózg w 4% PFA w PBS w temperaturze 4°C przez noc. Następnego dnia przepłucz mózgi 3 razy PBS.
2. Krioprotekcjonuj mózgi, umieszczając je w 30% sacharozy w PBS. Tkanka początkowo będzie wypływać na powierzchnię. Przechowuj w 4°C, aż tkanka opadnie na dno. Na tym etapie krioprotekcja jest zakończona.

3. Osadzanie w medium/Kriosekcjonowanie

1. Osadź mózgi w odpowiedniej orientacji do cięcia (np. strzałkowej lub czołowej) w roztworze 30% sacharozy:OCT (Tissue-Tek, kat. nr: 4583) w PBS w stosunku 2:1. Zamroź osadzone mózgi na płaskiej powierzchni suchego lodu. Zamrożone, osadzone mózgi można umieścić w workach do zamrażarki i przechowywać w temperaturze -80°C do roku przed wykonaniem skrawków.
2. Wykonaj kriosekcje tkanki w celu uzyskania skrawków o grubości 12-16μm i przenieś je na szkiełka przedmiotowe (Sigma, kat. nr: S4651). Szkiełka można przechowywać do tygodnia w temperaturze -80°C przed barwieniem.
3. Szkiełka przeznaczone do barwienia należy wysuszyć w temperaturze 37°C przez 30 minut i wypłukać 1x w PBS, aby usunąć pozostałości OCT.

4. Blokowanie skrawków

1. Blokuj skrawki w 20% normalnym surowicy koziej (NGS) w PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. WAŻNE: Na tym etapie nie dodawaj Triton X-100. Przed dodaniem roztworu blokującego można utworzyć barierę hydrofobową wokół skrawków na szkiełku za pomocą pisaka Elite PAP Pen (DBS, nr kat.: K039)

5. Nakładanie przeciwciał pierwszorzędowych

1. Rozcień przeciwciała pierwszorzędowe w buforze PBS z dodatkiem 0,3% Tritonu i 10% NGS.
2. W przekrojach mózgu stosujemy PSD-95 (Zymed, królik, 1:500) do znakowania glutaminergicznych przedziałów postsynaptycznych oraz VGlut1 lub VGlut2 (Chemicon, świnka morska, 1:2500) do znakowania glutaminergicznych zakończeń presynaptycznych. Odwiruj roztwór przeciwciał pierwszorzędowych przez 5 minut z maksymalną prędkością w wirówce laboratoryjnej, aby usunąć ewentualne wytrącone przeciwciała.
3. Inkubuj przekroje w roztworze przeciwciał pierwszorzędowych przez 36-60 godzin w temperaturze 4°C.

6. Nakładanie przeciwciał wtórnych

1. Usuń przeciwciało pierwszorzędowe, zanurzając preparaty 3x w PBS po 15 minut za każdym razem. Po tym kroku należy zabezpieczyć preparaty przed bezpośrednim światłem.
2. Rozcieńcz przeciwciała wtórne w stosunku 1:200 w tym samym buforze, który opisano dla przeciwciał pierwszorzędowych. Na przykład do barwienia VGlut/PSD95 stosujemy przeciwciała kozie anty-świnka morska Alexa 488 (Vglut) oraz kozie anty-królik Alexa 594 (PSD-95) (Invitrogen).
3. Inkubuj przekroje w roztworze przeciwciał wtórnych przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, w ciemności.
4. Usuń niezwiązane przeciwciała wtórne z preparatów, zanurzając je 4x w PBS po 15 minut za każdym razem.

7. Montowanie preparatu

1. Nanieść małe krople medium montażowego Vectashield z DAPI (Vector Laboratories Inc.) na szkiełka przedmiotowe (VWR scientific), a następnie przykryć je szkiełkami nakrywkami (VWR Scientific, No. 1.5, 48393 241). Zabezpieczyć brzegi szkiełek nakrywkami za pomocą lakieru do paznokci, aby zapobiec ich przesuwaniu się.

8. Obrazowanie

WAŻNE: Do obrazowania opisanego w niniejszej procedurze wymagany jest mikroskop konfokalny z co najmniej 3 kanałami. Obrazowanie wykonujemy przy użyciu laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Leica SP5 z obiektywem imersyjnym olejowym 63x.

1. Synaptyczne obszary mózgu będące przedmiotem zainteresowania powinny być wybierane do skanowania w sposób spójny pomiędzy kolejnymi przekrojami. Na przykład w naszym teście synaps komórek zwojowych siatkówki na neuronach wzgórza górnego obrazujemy zewnętrzny obszar wzgórza górnego sąsiadujący ze wzgórzem dolnym, który obejmuje warstwę synaptyczną przyjmującą terminale siatkówkowo-wzgórzowe^7,8,9. Obrazujemy i kwantyfikujemy synapsy w górnej 150 μm strefie synaptycznej wzgórza górnego, w której wiadomo, że komórki zwojowe siatkówki tworzą kontakty synaptyczne⁹.
2. Dla każdego przekroju, w obu kanałach (488 i 594), obrazujemy seryjne przekroje optyczne w odstępach 0,33 μm na całkowitej głębokości 5 μm, co daje łącznie 15 przekrojów optycznych. Należy obrazować co najmniej 3 przekroje z każdego zwierzęcia i uwzględnić co najmniej 3 zwierzęta dla danej warunku eksperymentalnego.
3. Z grup 3 kolejnych przekrojów generowane są projekcje maksymalnej intensywności (MIP), co daje 5 obrazów MIP reprezentujących każda głębokość 1 μm. Obrazy MIP te podlegają kwantyfikacji.

9. Kwantyfikacja obrazów

1. Można przeprowadzić dokładnie tak, jak opisano dla RGC, jednak kształt i rozmiar ROI będą się zmieniać w zależności od tego, który region obrazów chcą Państwo poddać kwantyfikacji.

Klucze do sukcesu:

Oczyszczone RGC:

1. Przed utrwaleniem oczyszczonych RGC (lub innych kultur dysocjowanych) należy podgrzać 4% PFA w kąpieli wodnej ustawionej na 37°C przez ok. 20-25 minut (w pozostałym czasie przechowywać w 4°C, nie używać rozcieńczeń PFA starszych niż 7 dni).
2. Szczególnie w przypadku hodowli neuronów zaleca się, aby podczas wszystkich etapów płukania nie używać aspiratora próżniowego. Łagodniejsze metody, takie jak użycie pipety Pasteura i gruszki ssącej, znacząco poprawiają jakość barwienia.
3. Należy zadbać o to, aby komórki nie wyschły podczas etapów płukania.
4. Należy unikać przesuwania lub poruszania szkiełkami nakrywkowymi podczas nakładania lakieru do paznokci, ponieważ może to doprowadzić do oderwania komórek od szkiełka.
5. Wszystkie przeciwciała pierwotne i wtórne należy odwirować, aby usunąć wszelkie wytrącone przeciwciała, które negatywnie wpłynęłyby na barwienie.
6. Należy upewnić się, że przeciwciała pierwotne dla markerów presynaptycznych i postsynaptycznych zostały wytworzone w różnych gatunkach. W przeciwnym razie nie będzie możliwe rozróżnienie dwóch sygnałów po zastosowaniu przeciwciał wtórnych.

Przekroje mózgu:

1. Nie należy perfundować myszy utrwalaczami, takimi jak PFA.
2. Nie należy dodawać Triton-X 100 do roztworu blokującego dla przekrojów mózgu. Powoduje to pogorszenie jakości barwienia markerów presynaptycznych, w szczególności tych związanych z pęcherzykami synaptycznymi.
3. Do pozyskania obrazów o jakości wystarczającej do przeprowadzenia analizy synaps niezbędne jest użycie mikroskopu konfokalnego.

Reprezentatywne wyniki:

Opisany powyżej test synaptyczny został zaprojektowany w celu uchwycenia zmian w łączności synaptycznej in vitro oraz in vivo. W naszym laboratorium wykorzystujemy ten test do określenia wpływu pojedynczych lub wielu cząsteczek wydzielanych przez astrocyty na tworzenie synaps. Zazwyczaj przeprowadzamy ten test synaptyczny na oczyszczonych RGCs, które hodujemy in vitro.

Dobrze opisanym efektem przewlekłego stosowania mediów warunkowanych astrocytami (ACM) w oczyszczonych kulturach RGC jest wielokrotny wzrost liczby synaps tworzonych pomiędzy RGC^3,4,5,6. Rycina 1A i 1B przedstawia reprezentatywne obrazy nieprzetransfekowanych, oczyszczonych RGC traktowanych albo podstawową pożywką wzrostową, albo ACM. Po barwieniu na ekscytatoryczne markery presynaptyczne i postsynaptyczne, indukowany przez ACM wzrost tworzenia synaps jest jakościowo widoczny (Rycina 1A, 1B). Rzeczywiście, znalezisko to zostało potwierdzone w kilku badaniach, w których wykorzystano elektrofizjologię, aby wykazać, że synapsy indukowane przez ACM są funkcjonalne, oraz mikroskopię elektronową, aby wykazać, że synapsy te są prawidłowe pod względem ultrastrukturalnym^3,4,6. Inne prace w naszym laboratorium zidentyfikowały podjednostkę kanału wapniowego α2δ-1 jako receptor neuronalny dla silnie synaptogennej cząsteczki wydzielanej przez astrocyty – trombospoidyny³. Przedstawiamy tutaj wyniki eksperymentu przeprowadzonego na oczyszczonych RGC w celu ustalenia, czy zwiększone poziomy α2δ-1 dodatkowo nasilają indukowane przez ACM tworzenie synaps (Rycina 3).

Komórki RGC zostały kotransfekowane pustym wektorem lub konstruktem kodującym α2δ-1 wraz z oddzielnym konstruktem kodującym tdTomato po 5 dniach in vitro (DIV5). Po przewlekłej inkubacji z ACM lub GM, komórki RGC utrwalono i zabarwiono w dniu DIV 11. Po immunoznakowaniu markerów presynaptycznych i postsynaptycznych synaps pobudzających zaobserwowano jakościowo wyraźny wzrost liczby synaps w oczyszczonych komórkach RGC wykazujących ekspresję pustego wektora (pcDNA3.1) lub α2δ-1 (Rys 1C, 1D). Efekt synaptogenny ACM ilościowo określono za pomocą analizatora Puncta w celu zliczenia liczby synaps (Rys 2) dla co najmniej 15 neuronów z każdego wariantu. Próbka o takiej wielkości pozwoliła na obliczenie średniej liczby synaps na neuron i wykazała statystycznie istotny, około 10-krotny wzrost liczby synaps utworzonych przez neurony traktowane ACM, które eksponowały pusty wektor (Rys 3, szare słupki). Ponadto wykazano, że nadekspresja α2δ-1 prowadzi do znaczącego wzmocnienia indukowanego przez ACM tworzenia synaps (około 20-krotnego; Rys 3, czarne słupki).

Oprócz hodowli neuronów, za pomocą tej techniki możemy określić gęstość synaptyczną w różnych obszarach mózgu. Wzgórze górne jest strukturą mózgu, która otrzymuje projekcje siatkówkowo-wzgórkowe pochodzące z RGC w siatkówce^7,8,9. W trakcie rozwoju ponatalnego liczba synaps pobudzających tworzonych przez RGC w ich obszarach docelowych we wzgórzu górnym gwałtownie wzrasta od P7 do P21^7,8,9.

Wykorzystując naszą technikę kwantyfikacji, wykazujemy, że liczba synaps siatkówkowo-wzgórzowych powstających w wzgórzu górnym wzrasta od P7 do P14. W tym celu oznaczyliśmy gęstość synaptyczną w dniu P7, a następnie ponownie w P14. Wzgórze górne barwimy na obecność PSD-95 (marker postsynaptyczny) oraz VGlut2 (marker presynaptyczny specyficzny dla synaps RGC we wzgórzu górnym). Wykonano obrazowanie zewnętrznego regionu synaptycznego wzgórza górnego (Rys. 4A), a następnie dokonano kwantyfikacji kolokalizujących się synaps VGlut2/PSD-95 (Rys. 4B, 4C) z co najmniej 3 przekrojów na zwierzę i co najmniej 3 zwierząt dla każdego punktu czasowego. Kwantyfikacja uzyskanych danych wyraźnie wykazuje znaczący, ponad trzykrotny wzrost liczby synaps między dniem P7 a P14. Wyniki te są zgodne z wcześniej opublikowanymi ustaleniami uzyskanymi przy użyciu mikroskopii elektronowej (Rys. 4D)⁹.

Podsumowując, opisana tutaj metoda kwantyfikacji liczby synaps jest użytecznym narzędziem do określania liczby i gęstości synaps w kulturach oraz w tkankach neuronalnych, co pozwala nam badać efekty manipulowania procesem tworzenia synaps in vitro lub in vivo.

Rycina 1: Reprezentatywne barwienie synaptyczne w oczyszczonych RGC. (A i B) RGC w 3 dniu hodowli in vitro (DIV) hodowano albo w (A) podstawowej pożywce wzrostowej (GM), albo w (B) pro-synaptogennej pożywce warunkowanej astrocytami mysimi (ACM) przez kolejne 6 dni. Następnie komórki oznakowano markerami bassoon (presynaptycznym, czerwonym) i homer (postsynaptycznym, zielonym). Mysia ACM silnie stymuluje tworzenie synaps między RGC, co potwierdza wzrost liczby współlokalizujących się punktów bassoon i homer. (C i D) RGC w 5 DIV przetransfekowano plazmidem w celu nadekspresji podjednostki kanału wapniowego α2δ-1. Przetransfekowane komórki zidentyfikowano za pomocą wypełnienia cytoplazmy białkiem tdTomato (niebieskim) i zabarwiono markerem presynaptycznym synapsin oraz markerem postsynaptycznym homer. Strzałki wskazują synapsy. Pasek skali odpowiada 20 μm.

Rysunek 2: Ilościowe oznaczenie liczby synaps przy użyciu Puncta Analyzer. Przedstawiono tutaj przykład (a) oryginalnego obrazu oczyszczonej komórki zwoju siatkówki z nadekspresją receptora trombospondyny α2δ-1, barwionej na marker presynaptyczny synapsynę oraz marker postsynaptyczny homer. (b) Obrazy odpowiadające maskom utworzonym w każdym kanale podczas analizy punktów w Puncta Analyzer. (c) Puncta Analyzer utworzy obraz taki jak ten przedstawiony tutaj, w którym punkty są zaznaczone małymi czarnymi kropkami (wstawka). Przedstawiono również (d) wynik numeryczny aplikacji, w którym liczba punktów wraz z kilkoma innymi parametrami jest podana w formie tekstowej/numerycznej (pogrubienie dodane dla podkreślenia).

Rysunek 3: Reprezentatywny wynik analizy synaps. Przedstawiono tutaj efekt synaptogenny przewlekłego traktowania RGC pożywką warunkowaną astrocytami (ACM) w RGC przetransfekowanych pustym wektorem (pcDNA3.1, słupki szare) lub receptorem trombospondyny α2δ-1. Słupki błędów reprezentują SEM. GM = Growth Media. ACM = (Rat) Astrocyte Contitioned Media.

Rysunek 4: Ilościowe oznaczenie gęstości synaptycznej w wzgórzu górnym myszy. (a) Aby określić zmiany rozwojowe w liczbie synaps glutaminergicznych tworzonych przez RGC w ich obszarach docelowych we wzgórzu górnym mózgu gryzonia, skryosekcje mózgu myszy barwiono przeciwciałami przeciwko markerowi presynaptycznemu VGlut2 (zielony) i markerowi postsynaptycznemu PSD-95 (czerwony). Za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego obrazowano zewnętrzny obszar 150 x 150 μm wzgórza górnego (SC) myszy, odpowiadający regionowi docelowemu dla synaps RGC. Dla każdej sekcji SC zebrano stos obrazów z (z-stack) dla całkowitej głębokości 5 μm (15 x 0,33 μm sekcji optycznych). Wygenerowano maksymalne projekcje obrazu (MIP) dla grup 3 kolejnych sekcji optycznych, co dało 5 MIP/sekcję, z których każda reprezentowała 1 μm głębokości. Poniżej przedstawiono reprezentatywny obraz MIP pobrany ze wzgórza górnego myszy WT w dniu P14. Marker presynaptyczny VGlut2 pokazano na zielono, a marker postsynaptyczny PSD-95 na czerwono. (c) Wyniki numeryczne wygenerowane przez program Puncta Analyzer. (d) Ilościowa analiza liczby synaps dla co najmniej 3 sekcji na zwierzę, przy 3 zwierzętach na punkt czasowy (słupki błędu reprezentują SEM). Pasek skali oznacza 50 μm.

Dyskusja

Opisany powyżej test synaptyczny został opracowany w kontekście naszych celów eksperymentalnych, w których koncentrujemy się głównie na projekcjach pobudzających RGC, zarówno w oczyszczonej hodowli, jak i w przekrojach mózgu. Przedstawiliśmy tabelę referencyjną zawierającą przeciwciała, które sprawdzają się w znakowaniu synaps pobudzających (Tabela 1).

Niniejszy test synaptyczny można dostosować w celu ilościowego oznaczenia liczby synaps w dowolnej populacji neuronów lub w przypadku innego p...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Presynaptyczne	Synapsin	Królik	Poliklonalne
Synapsin	Mysz	Monoklonalne	Synaptic Systems
Bassoon	Mysz	Monoklonalne	Assay Designs
Bassoon	Świnka morska	Poliklonalne	Synaptic Systems
Synaptotagmin 1	Królik	Poliklonalne	Synaptic Systems
Synaptobrevin 2 (C1.69.1)	Mysz	Monoklonalne	Synaptic Systems
Synaptophysin (C1.7.2)	Mysz	Monoklonalne	Synaptic Systems
VGlut1	Mysz	Monoklonalne	Millipore
VGlut1	Świnka morska	Poliklonalne	Millipore
VGlut2	Świnka morska	Poliklonalne	Millipore
Postsynaptyczne	PSD-95 (klon 6G6-1C9)	Mysz	Monoklonalne
PSD-95	Królik	Poliklonalne	Zymed
Homer	Mysz	Monoklonalne	Synaptic Systems
Homer	Szczur	Poliklonalne	Millipore
Gephyrin	Królik	Poliklonalne	Synaptic Systems
Gephyrin	Mysz	Monoklonalne	Synaptic Systems
Tabela 1: Przedstawia przykłady sprawdzonych markerów pre- i postsynaptycznych, które z powodzeniem wykorzystaliśmy w naszym teście synaptycznym. Należy pamiętać, że nie jest to wyczerpująca lista wszystkich dostępnych markerów. Y = Tak, N = Nie, N.D. = Nie określono.
PBS	Invitrogen	20012-027
poly-d-lizyna	Sigma-Aldrich	P6407
Laminina	Cultrex	3400-010-01
Triton X-100	Roche Diagnostics Gmbh	9002-93-1
Normalne surowica kozia	GIBCO, by Life Technologies	16210
VectaShield z DAPI	Vector Laboratories	H-1200
OCT	Tissue-Tek	4583
Tris-Base (50 mM)	Fisher Scientific	BP152-5
Seryjna albumina wołowa	Sigma-Aldrich	A2153
l-lizyna	Sigma-Aldrich	L-1137
16% roztwór PFA	Electron Microscopy Sciences	15711
Granulowany PFA	Electron Microscopy Sciences	19210
24-dołkowa płytka hodowlana	Falcon BD	35-3047
Kozie przeciwciała anty-mysie sprzężone z Alexa	Invitrogen	---
Szklane laminki 12 mm, nr 0	Karl Hecht Gmbh	1105209
Szklana laminka nr 1,5 (do skrawków)	VWR international	48393241
Szkiełka szklane	VWR international	48311-703