Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronowych, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów komórkowych znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ilościowe oznaczanie synaps: test oparty na immunocytochemii do ilościowego oznaczania liczby synaps
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Jednym z najważniejszych celów w neuronauce jest zrozumienie sygnałów molekularnych, które sterują wczesnymi etapami formowania się synaps. W związku z tym konieczne stało się opracowanie obiektywnych metod ilościowego określania zmian w łączności synaptycznej. Niniejszy protokół, rozpoczynając od utrwalania próbek, szczegółowo opisuje sposób ilościowego oznaczania liczby synaps zarówno w dysocjowanych kulturach neuronów, jak i w przekrojach mózgu z wykorzystaniem immunocytochemii. Przy użyciu przeciwciał specyficznych dla poszczególnych przedziałów znakujemy terminale presynaptyczne oraz miejsca specjalizacji postsynaptycznej. Synapsy definiujemy jako punkty kolokalizacji sygnałów generowanych przez te markery. Liczbę tych kolokalizacji określa się ilościowo za pomocą wtyczki Puncta Analyzer (autorstwa Bary'ego Warka, dostępna na zapytanie, c.eroglu@cellbio.duke.edu) w ramach oprogramowania analitycznego ImageJ. Opisany w tym protokole test synaptyczny może być zastosowany do dowolnej tkanki nerwowej lub preparatu hodowlanego, dla których dysponuje się selektywnymi markerami presynaptycznymi i postsynaptycznymi. Ten test synaptyczny stanowi wartościowe narzędzie, które może być szeroko wykorzystywane w badaniach nad rozwojem synaps.
Protokół
Roztwory do przygotowania:
- Bufor do przeciwciał:
- 150 mM NaCl
- 50 mM Tris-Base (Fisher, Cat. No: BP152-5, 50 mM) - 1.21 g
- 1% BSA (Sigma, Cat. No: A2153, 1%) - 2.0 g
- 100 mM L-lizyna (Sigma, Cat. No: L-1137, 100 mM) - 3.65 g
- Dostosować pH do 7.4
- 0.04% azotek
- Uzupełnić objętość do 200 ml destylowaną H2O.
- Przefiltrować przez filtr 0.22μm (Millipore, Cat. No: SCGPU02RE).
- Rozcieńczalnik PFA:
- 168 ml 0.5 M Na2HPO4 (zasadowy)
- 72 ml 0.5M Na2HPO4 (jednobazowy)
- 660 ml destylowanej H2O
- Fiksator 4% PFA dla hodowlanych neuronów (roztwór nr 2):
- 10 ml 16% roztworu PFA (Electron Microscopy Sciences, Cat. No: 15711)
- 30 ml 4% rozcieńczalnika PFA (roztwór nr 2)
- 4% PFA w PBS:
- 4 g PFA (Electron Microscropy Sciences, Cat. No: 19210)
- 100 ml PBS (Invitrogen, Cat. No: 20012-027)
- Podgrzać do 40°C, mieszać przez noc.
- Przefiltrować przez filtr 0.22μm (Millipore, Cat. No: SCGPU02RE)
- Bufor blokujący (Objętość całkowita (dla płytki 24-dołkowej) = (#szkiełek pokrywkowych+1) x 200μl)
- 50% buforu do przeciwciał (roztwór nr 1)
- 50% normalnej surowicy koziej (Gibco, Cat. No: 16210)
- 0.2% Triton X-100 (Roche Diagnostics Gmbh, Cat. No: 9002-93-1)
- 30% sacharoza w PBS
- 30 g sacharozy (MP Biomedicals, Inc., Cat. No: 821713)
- 70 ml PBS (Invitrogen, Cat. No: 20012-027)
- Mieszać magnesem do całkowitego rozpuszczenia sacharozy.
- Uzupełnić objętość do 100ml za pomocą PBS
- Przefiltrować przez filtr 0.22 μm (Millipore, Cat. No: SCGPU02RE)
Przygotowanie kultur neuronalnych:
Opisany tutaj protokół ma zastosowanie do dowolnych pierwotnych kultur neuronalnych hodowanych na szklanych szkiełkach podstawkowych o średnicy 12 mm (Karl Hecht, nr O, nr kat.: 99010) w płytkach 24-dołkowych (Falcon, 35-3047). Przykładowo, w naszym laboratorium hodujemy komórki zwojowe siatkówki (RGCs) szczura, oczyszczone z siatkówki pobranej od zwierząt w dniach P5-71,2. Komórki są hodowane na szklanych szkiełkach pokrytych poli-d-lizyną (Sigma, nr kat.: P6407) i lamininą mysią (Cultrex, nr kat.: 3400-010-01). Przygotowanie tej kultury wykorzystujemy na kilka różnych sposobów w naszym teście synaps. Jedna z przeprowadzanych przez nas manipulacji polega na hodowaniu RGCs w obecności lub w przypadku braku czynników synaptogennych wydzielanych przez astrocyty. Alternatywnie, stosujemy te różne warunki traktowania w eksperymentach, w których komórki RGCs zostały przetransfekowane w celu nadekspresji białka zainteresowania. W tym drugim przypadku kotransfekujemy komórki markerem komórkowym (np. GFP lub tdTomato). Te różne podejścia eksperymentalne wpływają na sposób wykonywania niektórych etapów testu synaps, co wyjaśniamy poniżej.
1. Fixacja rozdzielonych oczyszczonych RGC
- Usunąć pożywkę z dołków zawierających RGC i dodać do każdego dołka 500 μl (dla płytki 24-dołkowej) 4% paraformaldehydu (PFA) uprzednio ogrzanego do 37°C. Pozostawić komórki do utrwalenia na 7 minut w temperaturze pokojowej.
- Po utrwaleniu wypłukać komórki 3 razy solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) (Invitrogen, Cat. No: 20012-027). WAŻNE: Komórki nie powinny pozostawać bez cieczy w dołkach; po usunięciu buforu z dołka należy go niezwłocznie zastąpić kolejnym buforem. Na tym etapie komórki są gotowe do immunobarwienia.
2. Blokowanie nieswoistych miejsc wiązania na RGC
- Przygotować bufor blokujący zawierający 50% normalnego surowicy koziej (NGS, Gibco, Cat. No: 16210) i 0,2% Triton X-100 (Roche Diagnostics Gmbh, Cat. No: 9002-93-1). Po usunięciu PBS z każdego dołka, dodać 200 μl buforu blokującego do każdego dołka i inkubować w celu blokowania przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć bufor blokujący i wypłukać 3 razy PBS.
3. Nakładanie roztworu przeciwciała pierwszorzędowego
- WAŻNE: Należy upewnić się, że przeciwciała pierwszorzędowe dla markerów presynaptycznych i postsynaptycznych pochodzą z różnych gatunków.
- Przygotować rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych w roztworze składającym się z 90% buforu do przeciwciał i 10% NGS, zawierającym wybraną parę przeciwciał presynaptycznych i postsynaptycznych. Na przykład króliki przeciwko synapsynie (marker presynaptyczny) (1:750, domena cytozolowa, Synaptic Systems) i myszy przeciwko Homerowi (marker postsynaptyczny) (1:500, mysz, Synaptic Systems). WAŻNE: Rozcieńczenie przeciwciał pierwszorzędowych należy wirować przez 5 minut z maksymalną prędkością w wirówce laboratoryjnej w celu usunięcia wszelkich wytrąceń przeciwciał.
- Do każdego dołka dodać 200 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych.
- Inkubować przez noc w temperaturze 4°C. Płytkę należy umieścić w większym, nawilżonym pojemniku, aby zapobiec wysychaniu roztworu przeciwciał pierwszorzędowych. PUNKT PRZERWANIA: Komórki mogą pozostawać w mieszaninie przeciwciał pierwszorzędowych do 3 dni przed kontynuacją protokołu.
- Następnego dnia usunąć przeciwciała pierwszorzędowe z każdego dołka i przepłukać dołki 3 razy roztworem PBS.
4. Nakładanie roztworu przeciwciała wtórnego
- Przygotuj roztwór przeciwciała wtórnego, rozcieńczając przeciwciała wtórne w stosunku 1:1000 w buforze do przeciwciał zawierającym 10% NGS. WAŻNE: Rozcieńczenie przeciwciał wtórnych należy odwirować przez 5 minut z maksymalną prędkością w wirówce laboratoryjnej w celu usunięcia wytrąconych przeciwciał. Pominięcie tego kroku prowadzi do wysokiego tła przeciwciał wtórnych.
Komórki nietransfekowane: W przypadku braku markera komórkowego, do znakowania markerów presynaptycznych i postsynaptycznych należy odpowiednio użyć przeciwciał wtórnych sprzężonych z Alexa-594 i Alexa-488. Przykładowo, do znakowania przeciwciała przeciwko synapsynie stosujemy przeciwciało wtórne kozie anty-królicze sprzężone z Alexa-594, a do znakowania przeciwciała przeciwko hamerowi – przeciwciało wtórne kozie anty-mysie sprzężone z Alexa-488. WAŻNE: W przypadku przeciwciał pierwotnych dających słabszy sygnał należy stosować przeciwciała wtórne sprzężone z Alexa-488.
Komórki przetransfekowane: Należy dobrać przeciwciała wtórne odpowiednie dla widma wzbudzenia i emisji zastosowanego fluorescencyjnego znacznika komórkowego. Na przykład w przypadku znakowania komórek przetransfekowanych białkiem tdTomato stosujemy sprzężone z Alexa-647 przeciwciała kozie anty-królicze do rozpoznawania przeciwciał anty-synapsynowych oraz sprzężone z Alexa-488 przeciwciała kozie anty-mysie do rozpoznawania przeciwciał anty-homerowych. Ponadto zastosowanie NGS w tym protokole wynika z wyboru przeciwciał wtórnych produkowanych w kozach. - Dodaj 200 μl roztwór przeciwciał wtórnych do każdego dołka.
- Po inkubacji przez dwie godziny w temperaturze pokojowej w ciemnym miejscu, przemyć 3 do 4 razy buforem PBS.
5. Montowanie szkiełek nakrywkowych
- Przymocuj szkiełka nakrywkowe za pomocą medium montażowego Vectashield z DAPI (Vector Laboratories Inc., nr kat.: H-1200) do szkiełek przedmiotowych (VWR scientific, nr kat.: 48311-703).
- Ostrożnie nałóż bezbarwny lakier do paznokci wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego i pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 30 minut w suchym, ciemnym miejscu. WAŻNE: Należy unikać przesuwania lub poruszania szkiełkami nakrywkowymi podczas nakładania lakieru, ponieważ mogłoby to doprowadzić do uszkodzenia komórek przez siły ścinające.
6. Obrazowanie
Do obrazowania niezbędny jest mikroskop fluorescencyjny wyposażony w kamerę zdolną do wykonywania zdjęć w 4 różnych kanałach, aby móc obrazować zarówno markery synaptyczne, wypełnienie komórek, jak i jądra (DAPI/opcjonalnie). Obrazowanie komórek należy przeprowadzić przy użyciu obiektywu immersyjnego olejowego 63x. Obrazowanie wykonujemy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss AxioImager z obiektywem Zeiss Plan-APOCHROMAT 63x/1.4 Oil DIC ∞/0.17.
- Wybierz komórki, które znajdują się w odległości co najmniej dwóch średnic komórki od najbliższych sąsiadów. Aby uniknąć błędu systematycznego i zapewnić losowość wyboru komórek podczas wizualizacji komórek nieprzetransfekowanych, wybierz komórki w kanale DAPI, a następnie wykonaj zdjęcia we wszystkich kanałach. W przypadku wizualizacji komórek przetransfekowanych wybierz komórki w kanale odpowiadającym znacznikowi fluorescencyjnemu w celu zidentyfikowania komórek przetransfekowanych (np. tdTomato).
- Wykonaj zdjęcia:
Komórki nieprzetransfekowane: Dla każdej wybranej komórki uzyskaj obrazy 8-bitowe w kanałach GFP i Texas Red. Na nałożonym obrazie w pseudokolorach markery presynaptyczne i postsynaptyczne powinny być odpowiednio w kolorze czerwonym i zielonym.
Komórki przetransfekowane: Dla każdej wybranej komórki uzyskaj obrazy 8-bitowe w kanałach GFP, Texas Red i Cy5 (lub Cy5.5). Na nałożonym obrazie w pseudokolorach markery presynaptyczne i postsynaptyczne powinny być odpowiednio w kolorze czerwonym i zielonym. Wypełnienie komórki nadaj w pseudokolorze niebieskim.
7. Analiza obrazu i ilościowe oznaczanie kolokalizujących punktów
- Do ilościowego oznaczenia kolokalizujących się punktów synaptycznych wykorzystujemy program Puncta Analyzer. Wtyczka Puncta Analyzer została napisana przez Bary’ego Warka i jest dostępna na zapytanie (c.eroglu@cellbio.duke.edu). Puncta Analyzer działa w programie ImageJ 1.26 (http://rsbweb.nih.gov/ij/; nowsze wersje ImageJ nie obsługują tej aplikacji). Aby zainstalować Puncta Analyzer, wystarczy umieścić pobrany folder aplikacji w folderze „Plugins” w katalogu ImageJ 1.26.
- Otwórz jeden z obrazów za pomocą programu ImageJ. Użyj jednego z narzędzi zaznaczania w menu ImageJ, aby określić obszar zainteresowania (ROI). Regularnie stosujemy okrągłe narzędzie zaznaczania, aby wybrać obszar o promieniu odpowiadającym w przybliżeniu średnicy jednej komórki wokół analizowanego somy.
- Po zaznaczeniu obszaru zainteresowania (ROI) przejdź do menu wtyczek i wybierz „Puncta Analyzer”.
- W wyświetlonym oknie „Analysis Options” wybierz „Red Channel”, „Green Channel”, pierwszą opcję „Subtract Background” oraz „Set results file....”. Kliknij „OK”. Zostaniesz poproszony o wskazanie lokalizacji zapisu wyników. Wyniki te można wyeksportować do programu Excel w celu dalszej analizy.
- W kolejnym oknie upewnij się, że wybrany jest promień toczącej się kuli (rolling ball radius) wynoszący 50 i odznacz opcję „White Background” (modyfikacja ta nie jest wymagana, ale jest często preferowana przez użytkowników aplikacji dla łatwiejszej wizualizacji). Kliknij „OK”.
- Pojawi się nowe okno wraz z maską odpowiadającą obrazowi z kanału czerwonego. Dostosuj próg (threshold) tak, aby czerwona maska jak najlepiej odpowiadała jak największej liczbie dyskretnych, pojedynczych punktów, nie wprowadzając przy tym zbyt dużego szumu. Jest to jeden z najbardziej subiektywnych etapów tego protokołu, dlatego należy zadbać o wypracowanie spójnego podejścia. Kliknij „Done”. Ustaw minimalny rozmiar punktu na 4 piksele i nie zmieniaj niczego innego. Kliknij „OK”.
- Powtórz poprzedni krok, tym razem dla kanału zielonego.
- Po zakończeniu poprzedniego kroku wtyczka dostarczy wyniki ilościowe odpowiadające punktom w każdym kanale osobno oraz punktom kolokalizującym się między oboma kanałami.
PRZEKROJE MÓZGU:
Analizę synaps można zastosować do krioprzekrojów mózgu oraz do każdej innej tkanki układu nerwowego (takiej jak rdzeń kręgowy lub siatkówka), pod warunkiem dostępności odpowiedniej pary markerów presynaptycznego i postsynaptycznego (z przeciwciałami, które dobrze działają w przekrojach), które mogą zostać wykorzystane do identyfikacji synaps podlegających kwantyfikacji. Analiza synaps pozwala na ujawnienie czasowej regulacji tworzenia synaps w danej części mózgu oraz na ilościowe określenie wpływu na łączność synaptyczną u zwierząt transgenicznych lub w próbkach poddanych innym formom manipulacji.
1. Pobieranie tkanki mózgowej u myszy
Wszystkie procedury z udziałem zwierząt powinny być wykonywane zgodnie z protokołami IACUC dotyczącymi zwierząt.
- Uśmierć myszy poprzez upuszczenie krwi i perfuzję roztworem PBS. Perfuzja PBS jest kluczowa dla usunięcia krwi i pozwoli zredukować sygnał tła podczas procedur barwienia. WAŻNE: Nie należy przeprowadzać perfuzji utrwalaczami, takimi jak 4% PFA. Negatywnie wpłynie to na wyniki barwienia.
2. Fixacja
- Utrwal cały mózg w 4% PFA w PBS w temperaturze 4°C przez noc. Następnego dnia wypłucz mózgi 3 razy w PBS.
- Krioprotekcję mózgów przeprowadź, umieszczając je w 30% sacharozie w PBS. Tkanka początkowo będzie pływać. Przechowuj w 4°C, aż tkanka opadnie na dno. W tym momencie krioprotekcja jest zakończona.
3. Zatapianie/Kriosekcjonowanie
- Zatopić mózgi w odpowiedniej orientacji do sekcjonowania (np. strzałkowej lub czołowej) w roztworze 30% sacharozy i OCT (Tissue-Tek, nr kat.: 4583) w PBS w stosunku 2:1. Zamrozić zatopione mózgi na płaskiej powierzchni suchego lodu. Zamrożone preparaty można umieścić w workach do zamrażarki i przechowywać w temperaturze -80°C do roku przed sekcjonowaniem.
- Wyciąć krioprzekroje tkanki o grubości 12-16μm i nanieść je na szkiełka przedmiotowe (Sigma, nr kat.: S4651). Szkiełka można przechowywać do tygodnia w temperaturze -80°C przed barwieniem.
- Szkiełka przeznaczone do barwienia należy wysuszyć w temperaturze 37°C przez 30 minut i wypłukać 1x w PBS, aby usunąć pozostałości OCT.
4. Blokowanie skrawków
- Blokuj skrawki w 20% normalnym surowicy koziej (NGS) w PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. WAŻNE: Na tym etapie nie dodawaj Triton X-100. Przed dodaniem roztworu blokującego można utworzyć barierę hydrofobową wokół skrawków na szkiełku za pomocą Elite PAP Pen (DBS, Cat. No: K039)
5. Nakładanie przeciwciał pierwszorzędowych
- Rozcieńczyć przeciwciała pierwotne w buforze PBS z dodatkiem 0,3% Triton i 10% NGS.
- W przekrojach mózgu stosujemy PSD-95 (Zymed, Rabbit, 1:500) do znakowania glutaminergicznych przedziałów postsynaptycznych oraz VGlut1 lub VGlut2 (Chemicon, guinea pig, 1:2500) do znakowania glutaminergicznych zakończeń presynaptycznych. Odwirówkę rozcieńczenia przeciwciał pierwotnych przeprowadzić przez 5 minut z maksymalną prędkością w wirówce stołowej, aby usunąć ewentualne wytrącone przeciwciała.
- Inkubować przekroje w roztworze przeciwciał pierwotnych przez 36-60 godzin w temperaturze 4°C.
6. Nakładanie przeciwciał wtórnych
- Wypłucz przeciwciała pierwszorzędowe, zanurzając preparaty 3x w buforze PBS przez 15 minut w każdym cyklu. Po tym kroku należy chronić preparaty przed bezpośrednim światłem.
- Rozcieńcz przeciwciała drugorzędowe w stosunku 1:200 w tym samym buforze, który opisano dla przeciwciał pierwszorzędowych. Na przykład w przypadku barwienia VGlut/PSD95 stosujemy przeciwciała kozie anty-świnka morska Alexa 488 (Vglut) oraz kozie anty-królik Alexa 594 (PSD-95) (Invitrogen).
- Inkubuj skrawki w roztworze przeciwciał drugorzędowych przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, w ciemności.
- Wypłucz niezwiązane przeciwciała drugorzędowe z preparatów, zanurzając je 4x w buforze PBS przez 15 minut w każdym cyklu.
7. Montowanie preparatów
- Nanieś małe krople medium montażowego Vectashield z DAPI (Vector Laboratories Inc.) na szkiełka przedmiotowe (VWR scientific), a następnie przykryj je szkiełkami nakrywkowymi (VWR Scientific, No. 1.5, 48393 241). Nałóż lakier do paznokci, aby zapobiec przesuwaniu się szkiełek nakrywkowych.
8. Obrazowanie
WAŻNE: Do obrazowania opisanego w niniejszym protokole wymagany jest mikroskop konfokalny z co najmniej 3 kanałami. Obrazowanie przeprowadzamy przy użyciu laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Leica SP5 z obiektywem imersyjnym olejowym 63x.
- Obszary synaptyczne mózgu przeznaczone do skanowania należy wybierać w sposób spójny pomiędzy poszczególnymi skrawkami. Na przykład w naszym teście synaps komórek zwojowych siatkówki na neuronach wzgórza górnego obrazujemy zewnętrzny obszar wzgórza górnego sąsiadujący ze wzgórzem dolnym, który obejmuje warstwę synaptyczną przyjmującą terminale siatkówkowo-wzgórzowe7,8,9. Obrazujemy i kwantyfikujemy synapsy w górnej 150 μm strefie synaptycznej wzgórza górnego, gdzie wiadomo, że komórki zwojowe siatkówki tworzą kontakty synaptyczne9.
- Dla każdego skrawka, w obu kanałach (488 i 594), obrazujemy seryjne przekroje optyczne w odstępach 0,33 μm na całkowitej głębokości 5 μm, co daje łącznie 15 przekrojów optycznych. Należy obrazować co najmniej 3 skrawki z każdego zwierzęcia i uwzględnić co najmniej 3 zwierzęta dla danej grupy eksperymentalnej.
- Z grup 3 kolejnych przekrojów generowane są projekcje maksymalnej intensywności (MIP), co daje 5 obrazów MIP reprezentujących każda 1 μm głębokości. Te obrazy MIP podlegają kwantyfikacji.
9. Kwantyfikacja obrazów
- Można przeprowadzić dokładnie tak, jak opisano w przypadku RGC, jednak kształt i rozmiar ROI będą zmieniać się w zależności od tego, który region obrazów chcemy poddać kwantyfikacji.
Klucze do sukcesu:
Oczyszczone RGC:
- Przed utrwaleniem oczyszczonych RGC (lub innych kultur dysocjowanych) należy podgrzać 4% PFA w kąpieli wodnej ustawionej na 37°C przez ok. 20-25 minut (w pozostałym czasie przechowywać w 4°C, nie używać rozcieńczeń PFA starszych niż 7 dni).
- Szczególnie w przypadku hodowli neuronów zaleca się, aby podczas wszystkich etapów płukania nie używać aspiratora próżniowego. Łagodniejsze metody, takie jak użycie pipety Pasteura z gruszką, zauważalnie poprawiają jakość barwienia.
- Należy zadbać o to, aby komórki nie wyschły podczas etapów płukania.
- Należy unikać przesuwania lub poruszania szkiełkami podstawowymi podczas nakładania laku do paznokci, ponieważ może to doprowadzić do oderwania komórek od szkiełka.
- Wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe należy odwirować, aby usunąć wszelkie wytrącone przeciwciała, które negatywnie wpłynęłyby na barwienie.
- Należy upewnić się, że przeciwciała pierwszorzędowe dla markerów presynaptycznych i postsynaptycznych zostały wytworzone w różnych gatunkach. W przeciwnym razie nie będzie można odróżnić tych dwóch sygnałów po zastosowaniu przeciwciał drugorzędowych.
Przekroje mózgu:
- Nie należy perfundować myszy utrwalaczami, takimi jak PFA.
- Nie należy dodawać Triton-X 100 do roztworu blokującego dla przekrojów mózgu. Powoduje to pogorszenie jakości barwienia markerów presynaptycznych, w szczególności tych związanych z pęcherzykami synaptycznymi.
- Do pozyskiwania obrazów o jakości wystarczającej do przeprowadzenia analizy synaps wymagane jest użycie mikroskopu konfokalnego.
Reprezentatywne wyniki:
Opisany powyżej test synaps został opracowany w celu uchwycenia zmian w łączności synaptycznej in vitro oraz in vivo. W naszym laboratorium wykorzystujemy ten test synaps do określania wpływu pojedynczych lub wielu cząsteczek wydzielanych przez astrocyty na tworzenie synaps. Zazwyczaj przeprowadzamy ten test synaps na oczyszczonych komórkach RGC, które hodujemy in vitro.
Dobrze opisanym efektem przewlekłego stosowania pożywki warunkowanej astrocytami (ACM) w oczyszczonych kulturach RGC jest wielokrotny wzrost liczby synaps tworzonych między RGC3,4,5,6. Rycina 1A i 1B przedstawiają reprezentatywne obrazy nietransfekowanych, oczyszczonych RGC traktowanych podstawową pożywką wzrostową lub ACM. Po barwieniu na ekscytatoryczne markery presynaptyczne i postsynaptyczne, indukowany przez ACM wzrost tworzenia synaps jest wyraźny jakościowo (Rycina 1A, 1B). Rzeczywiście, odkrycie to zostało potwierdzone w kilku badaniach, w których wykorzystano elektrofizjologię, aby wykazać, że synapsy indukowane przez ACM są funkcjonalne, oraz mikroskopię elektronową, aby wykazać, że synapsy te są prawidłowe pod względem ultrastrukturalnym3,4,6. Inne prace w naszym laboratorium zidentyfikowały podjednostkę kanału wapniowego α2δ-1 jako receptor neuronalny dla silnie synaptogennej cząsteczki wydzielanej przez astrocyty – trombospondyny3. Tutaj przedstawiamy wyniki eksperymentu przeprowadzonego na oczyszczonych RGC w celu ustalenia, czy zwiększone poziomy α2δ-1 dodatkowo nasilają indukowane przez ACM tworzenie synaps (Rycina 3).
Komórki RGC współtransfekowano albo pustym wektorem, albo konstruktem kodującym α2δ-1 wraz z osobnym konstruktem kodującym tdTomato po 5 dniach in vitro (DIV5). Po przewlekłej inkubacji z ACM lub GM, komórki RGC utrwalono i zabarwiono w dniu DIV 11. Po immunoznakowaniu markerów presynaptycznych i postsynaptycznych synaps pobudzających obserwujemy jakościowo wyraźny wzrost liczby synaps w oczyszczonych komórkach RGC wykazujących ekspresję pustego wektora (pcDNA3.1) lub α2δ-1 (Ryc. 1C, 1D). Efekt synaptogenny ACM ilościowo oceniliśmy za pomocą programu Puncta analyzer, licząc liczbę synaps (Ryc. 2) w co najmniej 15 neuronach dla każdego z warunków. Próba o takiej wielkości pozwoliła nam obliczyć średnią liczbę synaps na neuron i stwierdzić statystycznie istotny, około 10-krotny wzrost liczby synaps utworzonych przez neurony traktowane ACM, które wykazują ekspresję pustego wektora (Ryc. 3, szare słupki). Ponadto wykazaliśmy, że nadekspresja α2δ-1 prowadzi do znaczącej potencjacji indukowanego przez ACM tworzenia synaps (około 20-krotny wzrost; Ryc. 3, czarne słupki).
Oprócz hodowli neuronów, za pomocą tej techniki możemy określić gęstość synaptyczną w różnych obszarach mózgu. Wzgórze górne jest strukturą mózgu, która otrzymuje projekcje siatkówkowo-wzgórzowe, wywodzące się z komórek RGC w siatkówce7,8,9. W trakcie rozwoju postnatalnego liczba synaps pobudzających tworzonych przez RGC w ich obszarach docelowych we wzgórzu górnym gwałtownie wzrasta od dnia P7 do P217,8,9.
Stosując naszą technikę ilościową, wykazujemy, że liczba synaps siatkówkowo-wzgórzowych tworzonych w górnym wzgórzu zwiększa się od P7 do P14. W tym celu określiliśmy ilościowo gęstość synaps w dniu P7, a następnie ponownie w P14. Barwimy górne wzgórze pod kątem obecności PSD-95 (marker postsynaptyczny) oraz VGlut2 (marker presynaptyczny specyficzny dla synaps RGC w górnym wzgórzu). Wykonano obrazowanie zewnętrznego obszaru synaptycznego górnego wzgórza (Rys. 4A) i określono ilościowo kolokalizowane synapsy VGlut2/PSD-95 (Rys. 4B, 4C) z co najmniej 3 przekrojów na zwierzę i z co najmniej 3 zwierząt dla każdego punktu czasowego. Analiza ilościowa uzyskanych danych wyraźnie wykazuje ponad trzykrotny, istotny wzrost liczby synaps między P7 a P14. Wyniki te są zgodne z wcześniej opublikowanymi ustaleniami uzyskanymi przy użyciu mikroskopii elektronowej (Rys. 4D)9.
Podsumowując, opisana tutaj metoda kwantyfikacji liczby synaps jest użytecznym narzędziem do określania liczby i gęstości synaps w kulturach oraz w tkankach neuronalnych, co pozwala na badanie efektów manipulacji tworzeniem synaps in vitro lub in vivo.
Rycina 1: Reprezentatywne barwienie synaptyczne w oczyszczonych komórkach RGC. (A i B) Komórki RGC w 3. dniu hodowli in vitro (DIV) hodowano przez kolejne 6 dni albo w (A) podstawowej pożywce wzrostowej (GM), albo w (B) pro-synaptogennej pożywce warunkowanej astrocytami mysimi (ACM). Następnie komórki znakowano w celu wykrycia białka bassoon (presynaptyczne, czerwone) oraz homer (postsynaptyczne, zielone). Mysie ACM silnie stymuluje tworzenie synaps między komórkami RGC, co potwierdzono poprzez wzrost liczby ko-lokalizujących się punktów bassoon i homer. (C i D) Komórki RGC w 5. dniu DIV przetransfekowano plazmidem w celu nadekspresji podjednostki kanału wapniowego α2δ-1. Przetransfekowane komórki zidentyfikowano za pomocą wypełnienia cytoplazmy tdTomato (niebieskie) i zabarwiono na presynaptyczny marker synapsynę oraz postsynaptyczny marker homer. Strzałki wskazują synapsy. Pasek skali reprezentuje 20 μm.
Rysunek 2: Kwantyfikacja liczby synaps przy użyciu programu Puncta Analyzer. Przedstawiono tutaj przykład (a) oryginalnego obrazu oczyszczonej komórki zwojowej siatkówki nadekspresjonującej receptor trombospondyny α2δ-1 i zabarwionej na marker presynaptyczny synapsynę oraz marker postsynaptyczny homer. (b) Obrazy odpowiadające maskom utworzonym w każdym kanale podczas analizy punktów (puncta) w programie Puncta Analyzer. (c) Puncta Analyzer utworzy obraz taki jak ten pokazany tutaj, w którym punkty są zaznaczone małymi czarnymi kropkami (powiększenie). Przedstawiono również (d) wynik liczbowy aplikacji, w którym liczba punktów wraz z kilkoma innymi parametrami jest podana w formie tekstowej/liczbowej (tekst pogrubiony dodany dla podkreślenia).
Rycina 3: Reprezentatywny wynik testu synaptogenezy. Przedstawiono tutaj efekt synaptogenny przewlekłej inkubacji RGC w pożywce warunkowanej astrocytami (ACM) w przypadku RGC przetransfekowanych pustym wektorem (pcDNA3.1, słupki szare) lub receptorem trombospondiny α2δ-1. Słupki błędów reprezentują SEM. GM = pożywka wzrostowa. ACM = pożywka warunkowana astrocytami (szczurzymi).
Rysunek 4: Ilościowe oznaczenie gęstości synaptycznej w wzgórzu górnym myszy. (a) Aby określić zmiany rozwojowe w liczbie synaps glutaminergicznych tworzonych przez RGC w obszarach docelowych wzgórza górnego w mózgu gryzoni, barwiono krioprzekroje mózgu myszy przeciwciałami przeciwko markerowi presynaptycznemu VGlut2 (zielony) oraz markerowi postsynaptycznemu PSD-95 (czerwony). Za pomocą konfokalnego mikroskopu skaningowego obrazowano zewnętrzny obszar 150 x 150 μm wzgórza górnego (SC) myszy, odpowiadający obszarowi docelowemu dla synaps RGC. Dla każdego przekroju SC zebrano stos obrazów z (z-stack) o całkowitej głębokości 5 μm (15 x 0,33 μm sekcji optycznych). Wygenerowano maksymalne projekcje obrazu (MIP) dla grup 3 kolejnych sekcji optycznych, co dało 5 MIP/przekrój, z których każda reprezentowała 1 μm głębokości. Poniżej przedstawiono reprezentatywny MIP pobrany ze wzgórza górnego myszy WT w dniu P14. Marker presynaptyczny VGlut2 pokazano na zielono, a marker postsynaptyczny PSD-95 na czerwono. (c) Wyniki liczbowe wygenerowane przez program Puncta Analyzer. (d) Ilościowa analiza liczby synaps dla co najmniej 3 przekrojów na zwierzę, przy 3 zwierzętach na punkt czasowy (słupki błędu reprezentują SEM). Pasek skali oznacza 50 μm.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany powyżej test synaptyczny został opracowany w kontekście naszych celów eksperymentalnych, w których koncentrujemy się głównie na projekcjach pobudzających RGC, zarówno w oczyszczonej hodowli, jak i w przekrojach mózgu. Przedstawiliśmy tabelę referencyjną zawierającą przeciwciała, które sprawdzają się w znakowaniu synaps pobudzających (Tabela 1).
Niniejszy test synaptyczny można dostosować w celu ilościowego oznaczenia liczby synaps w dowolnej populacji neuronów lub w przypadku innego p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.
Podziękowania
Wtyczka Puncta Analyzer do programu Image J została napisana przez Barry’ego Warka (obecny adres: Physion Consulting) w laboratorium Bena A. Barresa (Stanford University).
Finansowanie;
- Fundacja Alfreda P. Sloana
- The Esther A. and Joseph Klingenstein Fund, Inc.
- Broad Biomedical Research Foundation
- Inicjatywa Cure for Huntington s Disease
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Presynaptyczne | Synapsin | Królik | Poliklonalne |
| Synapsin | Mysz | Monoklonalne | Synaptic Systems |
| Bassoon | Mysz | Monoklonalne | Assay Designs |
| Bassoon | Świnka morska | Poliklonalne | Synaptic Systems |
| Synaptotagmin 1 | Królik | Poliklonalne | Synaptic Systems |
| Synaptobrevin 2 (C1.69.1) | Mysz | Monoklonalne | Synaptic Systems |
| Synaptophysin (C1.7.2) | Mysz | Monoklonalne | Synaptic Systems |
| VGlut1 | Mysz | Monoklonalne | Millipore |
| VGlut1 | Świnka morska | Poliklonalne | Millipore |
| VGlut2 | Świnka morska | Poliklonalne | Millipore |
| Postsynaptyczne | PSD-95 (klon 6G6-1C9) | Mysz | Monoklonalne |
| PSD-95 | Królik | Poliklonalne | Zymed |
| Homer | Mysz | Monoklonalne | Synaptic Systems |
| Homer | Szczur | Poliklonalne | Millipore |
| Gephyrin | Królik | Poliklonalne | Synaptic Systems |
| Gephyrin | Mysz | Monoklonalne | Synaptic Systems |
| Tabela 1: Przedstawia przykłady sprawdzonych markerów pre- i postsynaptycznych, które z powodzeniem wykorzystaliśmy w naszym teście synaptycznym. Należy pamiętać, że nie jest to wyczerpująca lista wszystkich dostępnych markerów. Y = Tak, N = Nie, N.D. = Nie określono. | |||
| PBS | Invitrogen | 20012-027 | |
| poly-d-lizyna | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Laminina | Cultrex | 3400-010-01 | |
| Triton X-100 | Roche Diagnostics Gmbh | 9002-93-1 | |
| Normalne surowica kozia | GIBCO, by Life Technologies | 16210 | |
| VectaShield z DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Tris-Base (50 mM) | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Seryjna albumina wołowa | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| l-lizyna | Sigma-Aldrich | L-1137 | |
| 16% roztwór PFA | Electron Microscopy Sciences | 15711 | |
| Granulowany PFA | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| 24-dołkowa płytka hodowlana | Falcon BD | 35-3047 | |
| Kozie przeciwciała anty-mysie sprzężone z Alexa | Invitrogen | --- | |
| Szklane laminki 12 mm, nr 0 | Karl Hecht Gmbh | 1105209 | |
| Szklana laminka nr 1,5 (do skrawków) | VWR international | 48393241 | |
| Szkiełka szklane | VWR international | 48311-703 |
Bibliografia
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Y. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
- Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
- Eroglu, C. Gabapentin receptor alpha2delta-1 is a neuronal thrombospondin receptor responsible for excitatory CNS synaptogenesis. Cell. 139, 380-392 (2009).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277, 1684-1687 Forthcoming.
- Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of synapse number by glia. Science. 291, 657-661 (2001).
- Christopherson, K. S. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinocollicular projections in the mouse. J. Comp. Neurol. 230, 552-575 (1985).
- Schmidt, J. T. Formation of retinotopic connections: selective stabilization by an activity-dependent mechanism. Cell. Mol. Neurobiol. 5, 65-84 (1985).
- Sachs, G. M., Jacobson, M., Caviness, V. S. Postnatal changes in arborization patterns of murine retinocollicular axons. J. Comp. Neurol. 246, 395-408 (1986).
- Elmariah, S. B., Oh, E. J., Hughes, E. G., Balice-Gordon, R. J. Astrocytes regulate inhibitory synapse formation via Trk-mediated modulation of postsynaptic GABAA receptors. J. Neurosci. 25, 3638-3650 (2005).
- Hughes, E. G., Elmariah, S. B., Balice-Gordon, R. J. Astrocyte secreted proteins selectively increase hippocampal GABAergic length, branching and synaptogenesis. Moll. Cell. Neurosci. 43, 136-145 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
