Mikrokosmosy bloku agarowego do kontrolowanego rozkładu tkanek roślinnych przez grzyby tlenowe

Podsumowanie

Ten film demonstruje podejście kontrolowanego środowiska do badania degradacji tkanek roślinnych lignocelulozy przez grzyby tlenowe. Zdolność do kontrolowania źródeł składników odżywczych i wilgotności jest kluczową zaletą mikrokosmosów z blokami agarowymi, ale podejście to często przynosi mieszane sukcesy. Zajmujemy się krytycznymi pułapkami, aby uzyskać powtarzalne wyniki o niskiej zmienności.

Streszczenie

Dwie główne metody badania biodegradacji roślinnych tkanek lignocelulozowych przez grzyby zostały opracowane do testowania środków do konserwacji drewna (blok gleby; blok agarowy). Powszechnie przyjmuje się, że mikrokosmosy bloków glebowych dają wyższe tempo rozkładu, mniej problemów z wilgocią, mniejszą zmienność między badaniami i wyższe progi toksyczności konserwantów. Badanie bloków glebowych jest zatem częściej stosowaną techniką i zostało ustandaryzowane przez Amerykańskie Towarzystwo Badań i Materiałów (ASTM) (metoda D 1413-07). Konstrukcja blokowa gleby ma jednak wady, polegające na wykorzystaniu lokalnie zmiennych źródeł gleby i ograniczeniu kontroli składników odżywczych zewnętrznych (egzogennych) w stosunku do rozkładających się tkanek. Wady te pojawiły się jako problem w zastosowaniu tej metody do innych, coraz bardziej popularnych celów badawczych. Te nowoczesne cele obejmują degradację lignoceluloz do badań nad bioenergią, testowanie bioremediacji współmetabolizowanych toksyn, ocenę mechanizmów oksydacyjnych i śledzenie translokowanych elementów wzdłuż sieci strzępek. Bloki glebowe nie zapewniają wystarczającej kontroli w tych zastosowaniach. Konieczne jest wyrafinowane podejście oparte na blokach agarowych.

Tutaj używamy brązowego grzyba rozkładającego drewno Serpula lacrymans do degradacji drewna w mikrokosmosach bloku agarowego, używając głębokich szalek Petriego z agarem o niskiej zawartości wapnia. Badamy rolę gipsu egzogennego w rozpadzie w szeregu czasowym, aby wykazać użyteczność i oczekiwaną zmienność. Bloki z pojedynczego cięcia deski (cięcie wzdłużne) są kondycjonowane, ważone, sterylizowane w autoklawie i wprowadzane aseptycznie na siatkę z tworzywa sztucznego. Inokulacje grzybów znajdują się na każdej powierzchni bloku, z dodatkiem egzogennego gipsu na granicy faz. Zbiory są aseptyczne aż do ostatecznych destrukcyjnych zbiorów. Te mikrokosmosy są zaprojektowane tak, aby uniknąć kontaktu bloku ze ściankami agaru lub szalki Petriego. Kondensacja jest zminimalizowana podczas nalewania płytek i podczas inkubacji. Wreszcie, odstępy między inokulum/gipsem/drewnem są zminimalizowane, ale bez dopuszczania do kontaktu. Te mniej techniczne aspekty projektowania bloków agarowych są również najczęstszymi przyczynami niepowodzeń i kluczowym źródłem zmienności wśród badań. Publikacja wideo jest zatem przydatna w tym przypadku, a my pokazujemy wyniki o niskiej zmienności i wysokiej jakości.

Protokół

Ten protokół dotyczy podłoży drzewnych i niedrzewnych, jak to opisano, a także materiałów suszonych w piecu lub na powietrzu. Przeczytaj jednak protokół przed konfiguracją. Jest kilka poruszonych kwestii, które mogą mieć zastosowanie do Pańskiego/Pani badania, a te punkty (podkreślone) wymagają planowania. Należy również zauważyć, że istnieją dwie opublikowane metody bloków agarowych, które są sporadycznie stosowane, jedna z nich to Brytyjska Norma 838, a druga po artykule Międzynarodowej Grupy Badawczej ds. Ochrony Drewna (IRG-WP) przedłożonym przez Bravery (1978). Nasza metoda przypomina metodę 838, z modyfikacjami głównie w projekcie mikrokosmosu i kontroli podłoża agarowego, ale znowu, oba podejścia są często unikane ze względu na historyczne problemy z kontrolą wilgotności w blokach drewnianych, powodując anoksję i zmienność. Dobry przegląd tych metod testowych, który obejmuje dyskusję na temat konstrukcji bloków agarowych, w tym normy 838, można znaleźć w Nicholas (1973).

1) Przygotowanie Mikrokosmosów

Mikrokosmosy dla tych prób są o 1 cm wyższe (głębsze) niż typowe szalki Petriego, co zwiększa przestrzeń nad klockami drewna. Są one wypełnione niewielką i dokładną ilością agaru, aby kontrolować bezwzględne ilości składników odżywczych, oprócz ich stężenia, i trzymać drewniane klocki z dala (>3 mm) od pokrywy. Agar używany w tym przypadku do badania gipsu to agar typu A o niskiej zawartości wapnia; jednak pokazujemy reprezentatywne wyniki przy użyciu pożywki Blakeslee, pożywki zalecanej przez ATCC do utrzymania testowego izolatu Serpula lacrymans (Wulfen: Fries) szczep Schroeter EMPA 65 (ATCC 32750).

Ten projekt utrzymuje tkanki roślinne z dala od kontaktu z agarem oraz pokrywy naczynia i ścian. Zmienne zwilżanie substratów lignocelulozowych jest kluczowym źródłem zmienności w testach bloków agarowych. Zwilżanie w celu zwiększenia zawartości wilgoci powoduje anoksję i hamuje, a nawet zatrzymuje biodegradację tlenową. Stwarza to również problem dla każdego, kto bada mechanizmy oksydacyjne grzybów brunatnej i białej zgnilizny odpowiedzialnych za rozkład drewna. Kondensacja pary wodnej na pokrywkach płyt jest problemem, jeśli tworzą się wolne kropelki wody i zwilżają podłoże. Podobnie, drewno i inne tkanki szybko "odprowadzają" wodę z agaru w kontakcie, co prowadzi do zawartości wilgoci przekraczającej 80% (sucha masa) i zatrzymania degradacji tlenowej. Tkanki muszą być oddalone od tych źródeł wody, umożliwiając grzybowi nitkowatemu znalezienie, połączenie i kontrolowanie wilgoci w podłożu.

1. Przygotuj wystarczającą ilość podłoża agarowego, aby wypełnić żądaną liczbę płytek Petriego po 20 ml agaru każda. Używamy pięciu powtórzeń (n = 5) na zabieg, określonych za pomocą analizy mocy na podstawie wyników z przeszłości.
2. W przypadku agaru typu A bez wapnia i żelaza dodajemy 15 g agaru do kolby miarowej o pojemności 500 ml zawierającej około 400 ml wody dejonizowanej wzbogaconej o 1,0 g NH₄NO₃, 1,0 g jednozasadowego KH₂PO₄, 0,25 g MgSO₄ x 7H₂O i 1,0 g glukozy. Do mieszanki używamy roztworów podstawowych do dodawania mikroelementów. Dodajemy po 50 μl H₃BO₄ (0,057 g / 100 ml) i ZnSO₄ (0,031 g / 100 ml). Dodajemy po 50 μl MnCl₂ (0,036 g / 100 ml), CuSO₄ (0,039 g / 100 ml) i (NH₄)₆Mo₇O₂₄ (0,018 g / 100 ml). Po dodaniu składników odżywczych napełnić kolbę miarową do objętości 500 ml.
3. Typowy dodatek wapnia w tym przypadku to 0,05 g CaCl₂ x 2H₂O / 500 ml. W naszym przypadku jako zabieg stosujemy wapń agarowy o końcowym stężeniu 5 mM. Wzrostowi siły jonowej i dodawaniu chlorków przeciwdziałamy poprzez dodanie 5 mM NaCl do innych mikrokosmosów. Podobnie, do tej demonstracji używamy pożywek bez żelaza, ale w przypadkach, gdy zawiera się żelazo, mieszamy 0,112 g FeSO₄ z 2 ml wody dejonizowanej i dodajemy 50 μl tego świeżego roztworu (nie bulionu) natychmiast po wirowaniu. W każdym pożywce, w której kontrolujesz dodawanie składników odżywczych, dobrze jest sprawdzić pH przed autoklawowaniem. Dodatki kwasowe lub zasadowe (np. FeCl₃) wpłynie na krzepnięcie.
4. Przenieść pożywkę do kolby i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121°C i ciśnieniu 16 psi przez 20 minut. Nie przekraczamy objętości 500 ml (na kolbę 1000 ml), aby uniknąć zestalenia się agaru, zanim będziemy mogli podać go w całości na płytki testowe.
   
   (Uwaga: Mądrze jest używać alternatywnych pożywek, zwłaszcza agaru o minimalnej ilości składników odżywczych z dodatkiem soli podstawowych, aby najpierw sprawdzić, czy będzie na nim rósł badany grzyb. Wysokie siły jonowe mogą hamować wzrost, a nawet zabijać izolat testowy.)
5. Za pomocą przenośnego pipet i sterylnych pipet polistyrenowych o pojemności 10 ml należy przenieść agar w sposób aseptyczny do komory bezpieczeństwa biologicznego, po ostygnięciu kolb. Ważne jest, aby media ostygły w dotyku, aby zminimalizować kondensację. Talerze należy również układać wysoko podczas nalewania, aby zminimalizować ilość wolnej wody na pokrywkach. Podczas gdy kondensacja jest uciążliwa w normalnej hodowli, tutaj stanowi poważny problem, jeśli tworzą się kropelki i zwilżają drewno. Zawartość wilgoci (MC) powyżej 80% (w przeliczeniu na suchą masę) spowoduje niedotlenienie tkanek, ograniczy rozkład przez grzyby tlenowe i zwiększy zmienność. Oblicz MC w następujący sposób:
   
   MC* = [(Świeża masa x sucha masa) / sucha masa] x 100
   
   *(MC może przekroczyć 100% - może się to wydawać dziwnym sposobem obliczania MC, ale jest standardowe)
   1. Alternatywne mikrokosmosy: Jeśli badane są tkanki roślinne, które muszą być wstępnie zmielone i przesiane (np. łodygi i liście słomy kukurydzianej razem), istnieją dwie opcje potraw, których używamy. Podzielone płytki Petriego są dostępne z 2 lub 4 sekcjami, a agar można wykluczyć z przegródek z proszkiem. Zestalony agar można również pokroić i usunąć część, aby pozostawić miejsce na proszek, ale należy zachować ostrożność, aby zachować równe objętości agaru, jeśli dostępność składników odżywczych ma być kontrolowana.
6. Dodaj obficie przycięte siatki z tworzywa sztucznego do powierzchni płyty, używając dokładnie umytych i autoklawowanych siatek dodawanych aseptycznie. Do naszej siatki używamy produktu Gutter Guard (35 x 50 mm, grubość 2 mm) i użyliśmy skaningowej mikroskopii elektronowej, aby pokazać czystą powierzchnię po umyciu mydłem i wodą oraz wykazać brak penetracji grzybów. Odnieśliśmy mieszane sukcesy z filtrami z włókna szklanego i z układaniem bloków bezpośrednio na rozwiniętej grzybni, oba z powodu problemów z odprowadzaniem wilgoci. Wystąpi zanik, ale współczynnik zmienności (CV) będzie wysoki, co sprawi, że porównania leczenia będą statystycznie słabe. Wcześniej używaliśmy prętów szklanych, ale bloki są podatne na zsuwanie się z prętów po potrąceniu, pozostawiając bloki w kontakcie z agarem. Dobrą alternatywą jest wycięcie pełnych okręgów, aby pasowały do płytek, odcinając jedną krawędź, aby pomieścić inokulum. Ogólnie rzecz biorąc, przycinaj siatki, aby pasowały do własnej konfiguracji, ale upewnij się, że leżą całkowicie płasko na szalkach Petriego.

2) Przygotowanie substratów 'blokowych'

Te protokoły zostały opracowane dla litego drewna, ale można je dostosować do innych tkanek roślinnych. Ubytek masy jest standardową miarą postępu gnicia w drewnie zdegradowanym przez grzyby strzępkowe. W związku z tym nasze podejście wykorzystuje suche masy w piecu przed i po rozpadzie w celu określenia ubytku masy. Jednak w przypadku wszelkich badań bioenergetycznych, w których nacisk kładziony jest na chemię tkanek roślinnych, wiele osób uważa, że preferowane jest suszenie tkanek powietrzem. Pokazujemy tutaj protokoły przygotowania kultur agarowych do użycia materiału wyjściowego suszonego w piecu, ale podajemy alternatywne informacje dotyczące suszenia na powietrzu, a także przetwarzania proszku zamiast stałych substratów.

1. Do tej demonstracji używamy południowej sosny żółtej (SYP). SYP to dostępna na rynku tarcica stanowiąca zdecydowaną większość tarcicy używanej w budownictwie mieszkaniowym w USA. Może to być dowolny z czterech gatunków Pinus. Stosuje się nieobrobioną tarcicę, a bloki bez sęków są cięte z jednego rozdarcia (cięcie wzdłużne) wzdłuż słojów (19 x 19 mm). Minimalizuje to zmienność chemiczną w drewnie. Ta długość jest cięta na 19 mm³ bloki. Używamy tego rozmiaru do prób z blokami glebowymi i tniemy wiele bloków w jednej sesji na pilarce stołowej.
2. Bloki^o średnicy 19 mm 3, które mają być używane w mikrokosmosach bloków agarowych, są dalej dzielone na pół wzdłuż włókien za pomocą dłuta i młotka, a nie piły. To sprawia, że jedna szorstka krawędź bloku jest skierowana w dół na plastikowej siatce, a gładka górna krawędź jest etykietowana. Oznacz bloki ołówkiem. Jeśli nie możesz oznaczyć swoich podłoży, pamiętaj, aby opracować system, który nadąża za próbkami. Wytnij wystarczającą liczbę bloków, aby zaspokoić swoje zabiegi (ponownie, używamy n = 5 na zabieg), a także niezaszczepione kontrole, które będą służyć zarówno jako monitory zanieczyszczeń, jak i jako próbki danych wyjściowych, kondycjonowane równolegle.
3. W przypadku materiału suszonego w piecu należy umieścić próbki w piecu konwekcyjnym w temperaturze 100°C na 48 godzin. Jeśli wymagany jest materiał suszony powietrzem, próbki należy kondycjonować w komorze lub pomieszczeniu o stałej wilgotności i temperaturze. Używamy 65% wilgotności względnej i 20°C i zwykle liczymy na 10-14 dni kondycjonowania, w zależności od materiału.
4. Wstępnie zważ próbki, aby określić początkową masę suchą lub świeżą w piecu. W przypadku próbek z pieca wystarczy przenieść próbki do eksykatora w celu ich schłodzenia i zważenia.
   1. Alternatywne suszenie powietrzem: W przypadku materiału suszonego na powietrzu należy pobrać pięć próbek (n=5; protektorowe, które nie będą używane w mikrokosmosach), zważyć je na świeżo, wysuszyć w piekarniku jak powyżej i ponownie zważyć po wysuszeniu. Obliczyć współczynnik korygujący wilgotność dla każdego z dwóch bloków w następujący sposób:
      
      MC współczynnik korygujący = sucha masa / świeża masa
      
      Przykład: 2,46 g (sucha) / 2,68 g (świeża) = 0,918; tak więc świeży blok o wadze 3,0 g to 2,75 g suszonego w piecu
      
      Uśrednij pięć próbek, aby uzyskać średni współczynnik korekcyjny. Następnie zważ wszystkie wysuszone na powietrzu bloki. Pomnóż każdą masę przez średni współczynnik korygujący MC, aby określić początkową masę suchej w piecu.
5. Próbki znakowane w autoklawie w temperaturze 121°C i ciśnieniu 16 psi przez 1 godzinę lub dłużej w przypadku większych próbek. Szczelnie foliuj, aby zminimalizować zwilżenie.
   1. Alternatywna sterylizacja: Promieniowanie gamma może być użyte do sterylizacji, jeśli jest dostępne. Wcześniej testowaliśmy drewno świerkowe i bukowe pod kątem wpływu temperatury na utratę hemicelulozy i nie znaleźliśmy żadnego, a także żadnej utraty wytrzymałości lub zmiany koloru. Może się to jednak różnić w zależności od podłoża i Twoich preferencji/potrzeb, a promieniowanie gamma jest sprawdzoną alternatywą.
6. W ramach tej demonstracji testujemy rolę stałego gipsu (czystego w porównaniu z 1%_FeSO4) w degradacji naszych próbek sosny (SYP). Są one wykonane jako krążki z dokładnymi powierzchniami i objętościami, również w celu kontrolowania ich dostępności, a także stężenia. Są one sterylizowane w autoklawie oddzielnie i dodawane na etapie inokulacji. Potrzebujemy jednego krążka na każdy blok i dodajemy dwa bloki na szalkę Petriego, aby umożliwić dwa zbiory.

3) Szczepienie i etykietowanie

Zaszczepianie mikrokosmosów z bloków agarowych jest bardziej czasochłonne niż szczepienie słoików z blokami gleby. Dla nas liczymy na to, że każda inokulacja trwa 3 min. Do szalek Petriego zawierających agar jest to punkt dodawania siatki, drewna, wszelkich egzogennych źródeł składników odżywczych (w tym przypadku granulek gipsu) i grzyba. Istnieje zwiększone prawdopodobieństwo zanieczyszczenia ze względu na czas, przez jaki pokrywa jest otwarta i liczbę wizyt w środku. Istnieje również kilka kluczowych błędów, które są często popełniane na tym etapie, a najlepiej je pokryć, łącząc wideo z tekstem. Obejrzyj wideo.

1. W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego złóż puste naczynia z agarem, płytkę źródłową dla inokulum grzybów (używamy kultur 2 wk), siatkę, podłoże roślinne (drewno), materiały egzogenne, sharpie, paski parafilmu i narzędzia do przenoszenia. Sterylizujemy płomieniowo przy użyciu 70% etanolu i używamy narzędzia do przenoszenia inokulum oraz kleszczy do bloków i siatki. Parafilm należy ciąć brzytwą, aby uniknąć zadrapań na krawędziach. Nacięcia w parafilmie prowadzą do pęknięć podczas uszczelniania, co spowoduje wstrząsy próbek i będzie wymagało ponownego wprowadzenia.
2. Narzędzia do przenoszenia płomienia lub kleszcze przed dodaniem następujących (w tej kolejności):
   1. Siatka z tworzywa sztucznego.
   2. Podłoże drewniane. Na potrzeby naszej demonstracji dodamy dwa drewniane klocki wzdłuż siatki, oba z tego samego początkowego bloku, który został podzielony, abyśmy mogli sparować dane z wczesnych i późnych zbiorów. Bloki te są dodawane obok siebie, przy czym koniec słojów (przekrój drewna) jest skierowany w stronę punktu źródła inokulum grzybów.
   3. Materiały egzogeniczne. Tutaj testujemy rolę gipsu w gniciu przez grzyb nitkowaty. Dlatego chcemy, aby grzyb napotkał te krążki gipsowe przed dotarciem do drewna, a zatem dodaj jeden krążek gipsowy między każdym punktem inokulum i blokiem na wierzchu siatki. Oznacza to dodanie 2 krążków na mikrokosmos. Nie dopuszczaj do kontaktu krążków z drewnem, ale trzymaj je blisko.
   4. Inokulum grzybów. Używamy świdra korkowego #4 o średnicy 7 mm do wytwarzania zatyczek z 2-tygodniowych kultur hodowanych w 20 ml agarze . Pomaga to kontrolować objętość inokulum. W przypadku niezaszczepionych kontroli najlepiej jest dodać zatyczkę ze sterylnej płytki. Zazwyczaj dodajemy te zatyczki do agaru, a nie na siatkę. Nie dopuszczaj do kontaktu inokulum ani z podłożami egzogennymi, ani z drewnem, ale ponownie, umieść je blisko siebie. W każdym bloku znajduje się jedna zatyczka inokulum.
      
      Uwaga: Rozsądnie jest zebrać tę zawartość w naczyniu agarowym przed rozpoczęciem, aby upewnić się, że będzie co najmniej 3 mm przestrzeni nad głową, że odległość między drewnianymi klockami a ściankami pokrywy będzie co najmniej 3 mm i że wymiary siatki z tworzywa sztucznego z łatwością pomieszczą twoje podłoża.
3. Naczynia parafilmowe do ich uszczelnienia, utrzymując palący się płomień alkoholowy i z gotowymi kleszkami. Trzymaj talerze poziomo i owijaj parafilm płynnym, ciągłym ruchem. Jeśli parafilm pęknie lub jego zawartość zacznie się przepychać, usuń parafilm, ponownie wprowadź i złóż zawartość, a następnie spróbuj ponownie.
4. Oznacz pokrywki naczyń za pomocą markera odpornego na działanie alkoholu, oznaczając numery bloków bezpośrednio nad odpowiednimi podłożami. Rysujemy również kółka nad płytami gipsowymi. W miarę rozkładu drewna prawdopodobnie stracisz zdolność odczytywania etykiet na podłożach. Ważne jest, aby nadążać za pozycją naczynia. Nie należy również lekceważyć zdolności grzyba do degradacji lub kolonizacji niezliczonych innych rodzajów materiałów, w tym metali.
5. Jeśli masz delikatny zestaw na siatce, przenieś płytki OSTROŻNIE do inkubatora. Tylko raz zdarzyło nam się uderzyć koszem z talerzami o zacięcie drzwi i musieliśmy ponownie złożyć płyty. Nie spiesz się i wyznacz trasę. Jest to jednorazowy problem, więc zadbaj o ten jeden raz.

4) Inkubacja i zbiór

Płytki mogą być inkubowane zgodnie z twoim grzybem, ale powinny być trzymane w inkubatorze biologicznym, jeśli to możliwe, aby uniknąć kondensacji spowodowanej wahaniami temperatury. Zbiory szeregów czasowych odbywają się aseptycznie, z wyjątkiem ostatniego zbioru. Jeśli te pośrednie zbiory są wykonywane po tym, jak wzrost na podłożach jest znaczący, obsługa płytek jest łatwiejsza, ponieważ strzępki sieciują podłoża.

1. Na potrzeby naszej demonstracji inkubujemy płytki w temperaturze 20°C i w ciemności. W 5 tygodniu w punkcie zbiorów usuwamy całą partię zabiegową, spryskujemy każde dno i górę 70% etanolem i używamy palonych kleszczy do usuwania materiału z szafy bezpieczeństwa biologicznego.
2. Zrób zdjęcia przed zniszczeniem płytek agarowych, skupiając się na morfologii lub melanizacji.
3. Usuń bloki, które mają być traktowane zgodnie z Twoimi potrzebami. Użyj palca, aby odtoczyć nadmiar strzępek (w rękawiczkach nitrylowych), ale uważaj, aby nie stracić zepsutego materiału. Zwykle suszymy bloki w piekarniku w aluminiowych szalkach wagowych, aby określić ubytek masy, używając świeżych i suchych mas kontrolnych do monitorowania nadmiernego odprowadzania wilgoci. Oznaczamy również i śledzimy wszelkie ciemnobrązowe bloki, które są wyraźnie podmokłe, chociaż zgodnie z tym podejściem powinno to być minimalne. Dane dotyczące utraty masy pomagają ocenić postęp rozpadu i są ważnymi danymi, jeśli stężenia pierwiastków mają być później obliczane na podstawie grama masy. Pamiętaj również, że dane procentowe muszą być znormalizowane dla statystyk. Obliczamy w następujący sposób:
   
   % Ubytek masy = [(masa początkowa, masa końcowa) / masa początkowa] x 100
   1. Alternatywne suszenie powietrzem: Jeśli potrzebujesz suszenia powietrzem, a Twoim celem jest dalsza biologiczna obróbka materiału, powinieneś zastosować reżim kondycjonowania z sekcji 2.3 w celu regeneracji. Jeśli musisz określić ubytek masy, będzie to wymagało pomiaru zawartości wilgoci, Jednym z rozwiązań jest podzielenie bloków (lub proszków) na dużą i małą porcję. Zważ oba, ale tylko wysusz w piekarniku małą porcję. Obliczyć współczynnik konwersji zawartości wilgoci, jak powyżej, a następnie zastosować go do całkowitej świeżej masy małych + dużych porcji (całkowita masa świeżego bloku). Zwłaszcza w przypadku wstępnej obróbki materiału grzybem przed scukrzaniem lub innymi procesami, utrata masy pomoże w późniejszym określeniu bilansu masy i uwzględni węglowodany spożywane przez grzyba.
4. Zniszcz kultury w torbach nadających się do sterylizacji w autoklawie, ale zachowaj plastikową siatkę nośną i wszelkie inne komponenty, które można poddać recyklingowi do wykorzystania w przyszłych eksperymentach.

5) Interpretacja wyników

Tkanki lignocelulozowe zazwyczaj rozkładają się wolniej w projektach z blokami agarowymi, ale w tym momencie powinieneś mieć stosunkowo niską zmienność, nawet przy umiarkowanym poziomie rozpadu. Powinieneś również mieć umiarkowaną (20-50%), nie wysoką wilgotność w tkankach kontrolnych.

1. Zawartość wilgoci (w przeliczeniu na suchą masę) w drewnie nienarażonym na działanie grzybów jest zazwyczaj umiarkowana, około 40% w tym demonstracji. Jest to powyżej punktu nasycenia włókien (FSP) sosny (zwykle około 24%), co oznacza, że w drugiej ścianie komórkowej lignocelulozy znajduje się trochę wolnej wody. Oznacza to również, że prawdopodobnie wystąpi pewne odprowadzanie wilgoci. Wilgotność względna wynosząca 100% nadal nie powinna pozwalać na przekroczenie FSP przez MC drewna. Twój projekt może osiągać różne wyniki w zależności od wybranego podłoża i siatki. Kluczem jest utrzymanie wilgotności poniżej około 85% w przeliczeniu na suchą masę.
2. Procentowy ubytek masy w drewnie zdegradowanym w tych mikrokosmosach agarowych wynosi zwykle około 30% po 16 tygodniach dla większości grzybów. W przypadku wybranych grzybów, w tym przypadku Serpula lacrymans, grzyby osiągną w tym czasie pełną degradację, >60% utratę masy. S. lacrymans jest grzybem brunatnej zgnilizny, usuwającym niewielką ilość ligniny, więc 62% utrata masy w tym badaniu oznacza, że rozkład jest bliski lub już zakończony. Grzyby białej zgnilizny usuną ligninę, a utrata masy zależy zarówno od gatunku, jak i podłoża.
3. Zadbaj o to, aby zapisać morfologię strzępek. W tej demonstracji morfologia strzępek z natury nie wykazywała sukcesu lub porażki w żadnym pojedynczym leczeniu, ale kolory melanizacji były ważne. Pozwoliło nam to powiązać rolę żelaza jako zanieczyszczenia w gipsie ze starszymi badaniami, takimi jak Low i in. (2000), w których testowano materiały rodzime i gdzie zaobserwowano to "rdzawe" zabarwienie. Rola wapnia i żelaza była dyskutowana w Low et al. (2000) i tutaj widzimy zwiększony rozkład żelaza, a nie wapnia, i tych samych rdzawych strzępek.
4. Jeśli chcesz zmierzyć stężenie czegokolwiek w tym zdegradowanym drewnie, najlepiej znormalizować go pod kątem utraty masy. Jeśli, na przykład, wapń nie jest ani importowany, ani eksportowany z drewna rozkładającego się w 50%, jego stężenie w przeliczeniu na masę będzie się wydawać podwojone od czasu zerowego do końcowego zbioru. Dzieje się tak dlatego, że 1 g proszku stanowi teraz dwa razy większą objętość drewna niż w czasie zero. Grzyb pochłonął 50% matrycy, zmniejszając gęstość. Znormalizuj dowolne stężenie (na przykład mmol/g), aby skompensować utratę masy w następujący sposób:
   
   Znormalizowane stężenie = mmol/g x [1 - (% ubytek masy / 100)]
   
   Przykład: 10 mmol/g Ca w drewnie zdegradowanym 20%, w porównaniu z 7 mmol/g w czasie zero.
   
   Pytanie: Czy zawartość Ca wzrosła podczas rozkładu?
   
   10 mmol/g to pozorny wzrost o 3 mmol/g, Wzrost o 43%, ale jeden gram proszku ze zdegradowanego drewna o mniejszej gęstości reprezentuje teraz większą objętość. Normalizacja jest wymagana do porównania początkowej i końcowej zawartości Ca w równych objętościach drewna.
   
   10 x [1 x (20% / 100)] = 8 mmol/g znormalizowany
   
   Odpowiedź: Tak, Ca wzrosło, ale o 14%, a nie o 43%.
   
   (Dane można również wyrazić na objętość drewna, mmol/cm³, mnożąc przez gęstość.

Rysunek 1. Mikrokosmos bloku agarowego, jak ustalono w tej demonstracji, przed inkubacją.

Rysunek 2. Serpula lacrymans kolonizuje klocki drewna sosnowego spoczywające na plastikowej siatce, aby podnieść bloki powyżej kontaktu z agarem. Grzybnia ta stanowi ważne połączenie między drewnem a egzogennymi źródłami składników odżywczych / pierwiastków, a kontrolowanie tych egzogennych źródeł materiału w agarze lub jako materiały stałe jest kluczową zaletą konstrukcji blokowej w porównaniu z konstrukcją blokową gleby.

Rysunek 3. Średni % ubytek masy jako miara stopnia rozkładu drewna przez Serpula lacrymans po 5 i 15 tygodniach inkubacji z sosną w mikrokosmosach bloków agarowych. Leczenie nie obejmowało (bez Ca), 5 mM CaCl₂ dodano do agaru (CaCl₂), >99% czystego gipsu (CaSO₄) lub 1% gipsu wzbogaconego żelazem. Chroniona ANOVA oznacza, że porównania odbywały się przy użyciu testów Tukeya, przy α=0,05. Dla każdego zbioru słupki pod tą samą literą nie różnią się znacząco. Słupki błędów = odchylenie standardowe. Opublikowano w Schilling (2010).

Rysunek 4. Zdjęcie z góry (A) wszystkich pięciu powtórzeń w 15 tygodniu rozkładu przez tego samego grzyba testowego brunatnej zgnilizny, Serpula lacrymans, jak również bloki (B) usunięte i wysuszone w piecu. Zwróć uwagę na brak melanizacji w leczeniu wolnym od Ca, żółknięcie w leczeniu czystym wapniem i pojawienie się rdzy w leczeniu wzbogaconym żelazem. Zabiegi są oznaczone jak na rysunku 3, przy czym kontrola w (B) to dla porównania niezaszczepione bloki.

Rysunek 5. Zdjęcie z góry z innej próby z użyciem pożywki o wyższym stężeniu żelaza, agaru słodowego Blakeslee. Zwróć uwagę na utratę obserwowanej melanizacji w porównaniu z ryciną 4. Usunięte i zważone bloki nie wykazały wpływu leczenia na utratę wagi. Jest to przedstawione jako demonstracja wpływu egzogennych składników tych prób blokowych. Efekty te nie byłyby możliwe do przetestowania w przypadku słoików z blokami glebowymi, gdzie te egzogeniczne dane wejściowe są zbyt trudne do kontrolowania.

Dyskusja

Korzystając z naszego zestawu bloków agarowych (ryc. 1), serpula lacrymans rosła w bezpośrednim kontakcie z powierzchniami gipsu i przekształcała się w klocki drewniane (ryc. 2), prowadząc do ponad 60% utraty masy w kontrolnych brązowo-zgniłych klockach sosnowych (ryc. 3). To z łatwością spełnia standardowy cel ASTM wynoszący >50% rozpadu, a średni współczynnik zmienności (C_V) w rozpadzie wynosił 0,055 w 16 tygodniu. Dane te są publikowane w Schilling⁷. Ponownie, inne grzyby będą wymagały ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalki Petriego	Nalge Nunc international	4014	25 x 150 mm
Agar, Typ A	Sigma-Aldrich	A4550
Azotan amonu, NH4NO3	Millinckrodt	3436-12
Fosforan potasu, KH2PO4	JT Baker	3246-01
7-hydrat siarczanu magnezu, MgSO4• 7H2O	Sigma-Aldrich	230391
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Dekstroza
Kwas borowy, H3BO4	Mallinckrodt Baker Inc.	2549-04
7-hydrat siarczanu, ZnSO4• 7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	8880-12
4-hydrat chlorku manganu, MnCl2• 4H2O	JT Baker	2540-04
5-hydrat siarczanu miedzi(II), CuSO4• 5H2O	Sigma-Aldrich	209198
4-hydrat heptamolibdenianu amonu, (NH4)6Mo7O24• 4H2O	Sigma-Aldrich	431346
Dwuwodny chlorek wapnia, CaCl2• 2H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	4160-12
Chlorek sodu, NaCl	Mallinckrodt Baker Inc.	7581-12
7-hydrat siarczanu żelazawego, FeSO4• 7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	5056-12
Pipet-aid	Drummond Scientific	4-000-110	Cordless EtOH powierzchnia
10 ml sterylna pipeta polistyrenowa	BD Biosciences	357551
Gutter Guard	Thermwell Products Co.	VX620	Wstępnie wyszorowany mydłem Sklep z narzędziami
Półwodny siarczan wapnia, CaSO4• 0,5H2O	Acros Organics	385355000
#4 świdr korkowy	Boekel Scientific	1601
Parafilm "M"	Pechiney Opakowanie z tworzywa sztucznego	PM-996