Mikrokosmy z bloków agarowych do kontrolowanego rozkładu tkanek roślinnych przez grzyby tlenowe

Podsumowanie

W niniejszym filmie zaprezentowano podejście z wykorzystaniem kontrolowanego środowiska do badania degradacji lignocelulozowych tkanek roślinnych przez grzyby tlenowe. Możliwość kontrolowania źródeł składników odżywczych oraz wilgotności jest kluczową zaletą mikrokosmosów w blokach agarowych, jednak podejście to często przynosi niejednoznaczne rezultaty. Omówiliśmy krytyczne pułapki, aby umożliwić uzyskanie powtarzalnych wyników o niskiej zmienności.

Streszczenie

Dwie główne metody badania biodegradacji tkanek roślinnych lignocelulozowych przez grzyby zostały opracowane na potrzeby testowania impregnatów do drewna (metoda blokowa z glebą – soil-block; metoda blokowa z agarem – agar-block). Powszechnie przyjmuje się, że mikrokosmosy w metodzie soil-block zapewniają wyższe tempo rozkładu, mniejszą liczbę problemów związanych z wilgotnością, niższą zmienność między badaniami oraz wyższe progi toksyczności impregnatów. W związku z tym metoda soil-block jest techniką częściej wykorzystywaną i została znormalizowana przez American Society for Testing and Materials (ASTM) (metoda D 1413-07). Projekt soil-block ma jednak pewne wady, wynikające z wykorzystania lokalnie zróżnicowanych źródeł gleby oraz ograniczonej kontroli nad składnikami odżywczymi zewnętrznymi (egzogennymi) względem rozkładanych tkanek. Wady te stały się problematyczne przy zastosowaniu tej metody do innych, coraz popularniejszych celów badawczych. Współczesne cele te obejmują degradację materiałów lignocelulozowych na potrzeby badań nad bioenergetyką, testowanie bioremediacji toksyn współmetabolizowanych, ocenę mechanizmów utleniania oraz śledzenie translokacji pierwiastków wzdłuż sieci strzępek. Metoda soil-block nie zapewnia wystarczającej kontroli w tych zastosowaniach. Niezbędne jest zatem dopracowanie podejścia w metodzie agar-block.

W niniejszej pracy wykorzystujemy grzyba brunatnej zgnilizny drewna Serpula lacrymans do degradacji drewna w mikrokosmosach z bloków agaru, używając głębokich szalek Petri z agarem o niskiej zawartości wapnia. Badamy rolę egzogennego gipsu w procesie rozkładu w serii czasowej, aby wykazać użyteczność tej metody oraz oczekiwaną zmienność wyników. Bloki wycięte z jednej deski (cięcie wzdłużne) są kondycjonowane, ważone, autoklawowane i wprowadzane aseptycznie na siatkę plastikową. Inokulacja grzybową następuje na każdej ścianie bloku, a egzogenny gips jest dodawany na stykach. Pobieranie próbek odbywa się w warunkach aseptycznych aż do końcowego, destrukcyjnego zbioru. Mikrokosmosy te są zaprojektowane tak, aby uniknąć kontaktu bloków z agarem lub ściankami szalek Petri. Kondensacja jest minimalizowana podczas wlewania płyt oraz podczas inkubacji. Na koniec, odstępy między inokulum, gipsem a drewnem są minimalizowane, ale bez dopuszczania do kontaktu. Te mniej techniczne aspekty konstrukcji bloków agarowych są jednocześnie najczęstszymi przyczynami niepowodzeń i kluczowym źródłem zmienności pomiędzy badaniami. Publikacja wideo jest zatem w tym przypadku użyteczna, a my prezentujemy wyniki wysokiej jakości o niskiej zmienności.

Protokół

Niniejszy protokół ma zastosowanie do podłoży zdrewniałych i niezdrewniałych, zgodnie z opisem, a także do materiałów suszonych w piekarniku lub powietrzem. Przed przystąpieniem do przygotowań należy jednak zapoznać się z całym protokołem. Poruszono w nim kilka kwestii, które mogą mieć zastosowanie w przypadku Państwa badania; punkty te (podkreślone) wymagają wcześniejszego zaplanowania. Należy również zauważyć, że istnieją dwie opublikowane metody z wykorzystaniem bloków agarowych, które są sporadycznie stosowane: jedna to norma brytyjska British Standard 838, a druga opiera się na pracy International Research Group on Wood Protection (IRG-WP) przedłożonej przez Bravery’ego (1978). Nasza metoda przypomina normę 838, z modyfikacjami dotyczącymi przede wszystkim konstrukcji mikrokosmosu oraz kontroli podłoża agarowego, jednak oba podejścia są często pomijane ze względu na historyczne problemy z kontrolą wilgotności w blokach drewna, co prowadziło do anoksji i zmienności wyników. Dobry przegląd tych metod testowych, zawierający omówienie konstrukcji bloków agarowych, w tym normy 838, można znaleźć w pracy Nicholasa (1973).

1) Przygotowanie mikrokosmosów

Mikrokosmosy użyte w tych badaniach są o 1 cm wyższe (głębsze) niż typowe szalki Petriego, co zwiększa przestrzeń nad blokami drewna. Są one wypełnione umiarkowaną i precyzyjnie określoną ilością agaru, aby kontrolować bezwzględną ilość składników odżywczych, a nie tylko ich stężenie, oraz aby zachować odpowiedni odstęp (>3 mm) bloków drewna od pokrywki. Agar zastosowany w tym przypadku testowania gipsu to agar typu A o niskiej zawartości wapnia; prezentujemy jednak reprezentatywne wyniki z użyciem pożywki Blakeslee, która jest rekomendowaną przez ATCC pożywką do utrzymania badanego izolatu Serpula lacrymans (Wulfen: Fries) Schroeter szczep EMPA 65 (ATCC 32750).

Ta konstrukcja oddziela tkanki roślinne od kontaktu z agarem, a także od pokrywki i ścianek szalki. Zmienne zwilżenie podłoży lignocelulozowych jest głównym źródłem zmienności w testach z blokami agaru. Zwilżanie w celu zwiększenia zawartości wilgoci powoduje anoksję i hamuje, a nawet całkowicie zatrzymuje tlenową biodegradację. Stanowi to również problem dla osób badających mechanizmy oksydacyjne grzybów brunatnej i białej zgnilizny odpowiedzialnych za rozkład drewna. Kondensacja na pokrywkach szalek jest problematyczna, jeśli tworzą się wolne krople wody, które zwilżają podłoże. Podobnie drewno i inne tkanki będą gwałtownie „zasysać” wodę z agaru w przypadku bezpośredniego kontaktu, co prowadzi do zawartości wilgoci przekraczającej 80% (w przeliczeniu na masę suchą) i zatrzymuje degradację tlenową. Tkanki muszą być oddalone od tych źródeł wody, aby grzyb nitkowaty mógł zlokalizować, połączyć i kontrolować wilgoć wewnątrz podłoża.

1. Przygotować wystarczającą ilość pożywki agarowej, aby wypełnić pożądaną liczbę szalek Petri, wlewając do każdej 20 ml agaru. Stosujemy pięć powtórzeń (n=5) na jedną próbę, co określono na podstawie analizy mocy z wykorzystaniem wcześniejszych wyników.
2. W przypadku agaru typu A pozbawionego wapnia i żelaza, dodajemy 15 g agaru do kolby miarowej o pojemności 500 ml zawierającej około 400 ml wody dejonizowanej z dodatkiem 1,0 g NH₄NO₃, 1,0 g monobazowego KH₂PO₄, 0,25 g MgSO₄ x 7H₂O oraz 1,0 g glukozy. Do mieszaniny dodajemy mikroelementy, korzystając z roztworów zapasowych. Dodajemy po 50 μl H₃BO₄ (0,057 g / 100 ml) i ZnSO₄ (0,031 g / 100 ml). Następnie dodajemy po 50 μl MnCl₂ (0,036 g / 100 ml), CuSO₄ (0,039 g / 100 ml) oraz (NH₄)₆Mo₇O₂₄ (0,018 g / 100 ml). Po dodaniu składników odżywczych dopełniamy kolbę miarową do kreski 500 ml.
3. Typowy dodatek wapnia w tym przypadku to 0,05 g CaCl₂ x 2H₂O / 500 ml. W naszym przypadku stosujemy agar z wapniem jako wariant badawczy, z końcowym stężeniem 5 mM. Aby zrównoważyć wzrost siły jonowej i dodatek chlorków, dodajemy 5 mM NaCl do pozostałych mikrokosmosów. Podobnie, w tej demonstracji stosujemy pożywki bezżelazowe, jednak w przypadkach, gdy żelazo jest uwzględnione, mieszamy 0,112 g FeSO₄ z 2 ml wody dejonizowanej i dodajemy 50 μl tego świeżego roztworu (nie zapasowego) bezpośrednio po wortexowaniu. W przypadku każdej pożywki, w której kontroluje się dodatki składników odżywczych, zaleca się sprawdzenie pH przed autoklawowaniem. Dodatki kwasowe lub zasadowe (np. FeCl₃) wpłyną na proces zestalania.
4. Przenieść pożywkę do kolby i wysterylizować w autoklawie w temperaturze 121°C i pod ciśnieniem 16 psi przez 20 minut. Nie przekraczamy objętości 500 ml (na kolbę 1000 ml), aby uniknąć zestalenia się agaru przed rozdzieleniem go na wszystkie szalki testowe.
   
   (Uwaga: Przy stosowaniu alternatywnych pożywek, szczególnie minimalnych pożywek agarowych z dodatkiem soli bazowych, zaleca się najpierw zweryfikować, czy badany grzyb na nich rośnie. Wysoka siła jonowa może hamować wzrost lub nawet zabić badany izolat.)
5. Po ostygnięciu kolb, użyć przenośnego pipetora i sterylnych pipet polistyrenowych o pojemności 10 ml, aby aseptycznie przenieść agar w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Ważne jest, aby pożywka ostygła do temperatury umożliwiającej dotknięcie jej palcem, co zminimalizuje kondensację. Ponadto, szalki należy układać w wysokich stosach podczas wlewania, aby ograniczyć ilość wolnej wody na pokrywkach. O ile kondensacja jest uciążliwa w rutynowych hodowlach, tutaj stanowi ona poważny problem, jeśli powstaną krople i zamoczą drewno. Zawartość wilgoci (MC) powyżej 80% (w przeliczeniu na suchą masę) spowoduje anoksję w tkankach, ograniczy rozkład przez grzyby tlenowe i zwiększy zmienność. MC oblicza się następująco:
   
   MC* = [(Masa świeża x masa sucha) / masa sucha] x 100
   
   *(MC może przekraczać 100% - może wydawać się to nietypowym sposobem obliczania MC, ale jest to standardowa metoda)
   1. Alternatywne mikrokosmosy: Jeśli testowane są tkanki roślinne, które muszą zostać wstępnie zmielone i przesiane (np. łodygi i liście kukurydzy razem), stosujemy dwie opcje naczyń. Dostępne są podzielone szalki Petri z 2 lub 4 sekcjami, gdzie w przedziałach z proszkiem można pominąć agar. Zestalony agar można również wyciąć i usunąć jego część, aby zrobić miejsce na proszek, jednak należy zadbać o zachowanie równych objętości pozostałego agaru, jeśli chcemy kontrolować dostępność składników odżywczych.
6. Na powierzchnię szalek nałożyć odpowiednio przycięte plastikowe siatki, używając dokładnie umytych i wysterylizowanych w autoklawie siatek, dodawanych aseptycznie. Jako siatki stosujemy produkt Gutter Guard (35 x 50 mm, grubość 2 mm); za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej wykazaliśmy, że powierzchnia po myciu wodą z mydłem jest czysta i nie wykazuje penetracji przez grzyby. Mieliśmy mieszane rezultaty przy stosowaniu filtrów z włókna szklanego oraz kładzeniu bloczków bezpośrednio na rozwiniętą grzybnię, co wynikało z problemów z podsiąkaniem. Rozkład wystąpi, ale współczynnik zmienności (CV) będzie wysoki, co osłabi statystycznie porównania między próbami. Wcześniej stosowaliśmy pręty szklane, ale bloczki mają tendencję do zsuwania się z prętów podczas wstrząsów, co prowadzi do ich kontaktu z agarem. Dobrą alternatywą jest wycięcie pełnych okręgów dopasowanych do szalek, z odcięciem jednego brzegu w celu umieszczenia inokulum. Generalnie, należy dociąć siatki do własnej konfiguracji, upewniając się, że leżą one całkowicie płasko w szalkach Petri.

2) Przygotowanie podłoży blokujących

Protokoły te zostały opracowane dla litego drewna, ale można je dostosować do innych tkanek roślinnych. Ubytek masy jest standardową miarą postępu rozkładu w drewnie degradowanym przez grzyby nitkowate. W związku z tym nasze podejście wykorzystuje masę suchej masy (po suszeniu w piekarniku) przed i po rozkładzie w celu określenia ubytku masy. Jednak w badaniach nad bioenergetyką, gdzie głównym punktem ciężkości jest chemia tkanek roślinnych, wielu badaczy uważa, że korzystniejsze jest suszenie tkanek na powietrzu. Przedstawiamy tutaj protokoły przygotowania kultur na blokach agaru z wykorzystaniem materiału wyjściowego suszonego w piekarniku, ale podajemy również alternatywne informacje dotyczące suszenia na powietrzu oraz przetwarzania proszku zamiast substratów stałych.

1. W tej demonstracji wykorzystujemy sosnę południową (Southern Yellow Pine, SYP). SYP jest komercyjnie dostępnym drewnem konstrukcyjnym, reprezentującym ogromną większość tarcicy stosowanej w budownictwie mieszkalnym w USA. Może ona pochodzić od dowolnego z czterech gatunków Pinus. Używa się drewna nieimpregnowanego, a bloki bez sęków są wycinane z jednego paska (cięcia wzdłużnego) wzdłuż słojów (19 x 19 mm). Minimalizuje to zmienność chemiczną drewna. Pasek ten jest cięty na bloki o wymiarach 19 mm³. Rozmiaru tego używamy w próbach z blokami glebowymi, wycinając wiele bloków podczas jednej sesji na pile stołowej.
2. Bloki 19 mm³ przeznaczone do mikrokosmosów z blokami agarowymi są następnie dzielone na pół wzdłuż słojów za pomocą dłuta i młotka, a nie piły. Dzięki temu jedna krawędź bloku pozostaje szorstka i przylega do plastikowej siatki, a górna krawędź jest gładka i służy do opisywania. Bloki należy opisać ołówkiem. Jeśli nie można opisać podłoży, należy opracować system śledzenia próbek. Należy wyciąć wystarczającą liczbę bloków dla wszystkich wariantów (ponownie, stosujemy n=5 na wariant), a także niezaszczepione próbki kontrolne, które będą służyć zarówno jako monitory kontaminacji, jak i próbki danych bazowych, kondycjonowane równolegle.
3. W przypadku materiału suszonego w piecu, należy umieścić próbki w piecu konwekcyjnym w temperaturze 100°C przez 48 h. Jeśli wymagany jest materiał suszony powietrzem, próbki należy kondycjonować w komorze lub pomieszczeniu o stałej wilgotności i temperaturze. Stosujemy 65% RH i 20°C, a czas kondycjonowania wynosi zazwyczaj od 10 do 14 dni, w zależności od materiału.
4. Próbki należy zważyć wstępnie, aby określić początkową masę suchej (po suszeniu w piecu) lub świeżą. Próbki z pieca należy po prostu przenieść do eksykatora w celu schłodzenia, a następnie zważyć.
   1. Alternatywne suszenie powietrzem: W przypadku materiału suszonego powietrzem, należy pobrać pięć próbek (n=5; próbki poświęcalne – nie będą one użyte w mikrokosmosach), zważyć je na świeżo, wysuszyć w piecu jak opisano powyżej i zważyć ponownie po suszeniu. Obliczamy współczynnik korekcji wilgotności dla każdego z dwóch bloków w następujący sposób:
      
      Współczynnik korekcji MC = masa sucha / masa świeża
      
      Przykład: 2,46 g (sucha) / 2,68 g (świeża) = 0,918; zatem blok o masie świeżej 3,0 g ma masę 2,75 g po wysuszeniu w piecu
      
      Wyciągamy średnią z pięciu próbek, aby uzyskać średni współczynnik korekcji. Następnie ważymy wszystkie bloki suszone powietrzem. Każną masę mnożymy przez średni współczynnik korekcji MC, aby określić początkowe masy suche.
5. Opisane próbki należy autoklawować w temperaturze 121°C i pod ciśnieniem 16 psi przez 1 h lub dłużej w przypadku większych próbek. Należy szczelnie owinąć próbki folią aluminiową, aby zminimalizować ich zawilgocenie.
   1. Alternatywna sterylizacja: Jeśli jest dostępna, do sterylizacji można użyć promieniowania gamma. Wcześniej testowaliśmy drewno świerkowe i bukowe pod kątem wpływu temperatury na utratę hemiceluloz i nie stwierdzono takich efektów, ani utraty wytrzymałości czy zmiany koloru. Może to jednak różnić się w zależności od podłoża oraz preferencji i potrzeb użytkownika, a promieniowanie gamma jest sprawdzoną alternatywą.
6. W tej demonstracji badamy rolę stałego gipsu (czystego w porównaniu z 1% FeSO₄) w degradacji naszych próbek sosny (SYP). Są one przygotowane w formie dysków o dokładnie określonych powierzchniach i objętościach, aby kontrolować ich dostępność oprócz stężenia. Dyski te są autoklawowane oddzielnie i dodawane podczas etapu szczepienia. Potrzebujemy jednego dysku na każdy blok i dodajemy dwa bloki do każdej szalki Petriego, aby umożliwić dwa zbiory.

3) Inokulacja i etykietowanie

Inokulacja mikrokosmosów z blokami agaru jest bardziej czasochłonna niż inokulacja słoików z blokami gleby. W naszym przypadku zakładamy, że każda inokulacja zajmuje 3 min. Do szalek Petri z agarem w tym momencie dodaje się siatkę, drewno, wszelkie egzogenne źródła składników odżywczych (tutaj: granulki gipsu) oraz grzyba. Istnieje zwiększone ryzyko kontaminacji ze względu na czas, przez który pokrywka pozostaje otwarta, oraz liczbę interwencji wewnątrz naczynia. Na tym etapie często popełnia się również kilka kluczowych błędów, które najlepiej omówić, łącząc materiał wideo z tekstem. Obejrzyj wideo.

1. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza przygotuj puste szalki z agarem, płytkę źródłową z inokulum grzybowym (stosujemy 2-tygodniowe kultury), siatkę, podłoże roślinne (drewno), materiały egzogenne, marker permanentny, paski Parafilmu oraz narzędzia do transferu. Sterylizację przeprowadzamy przy użyciu 70% etanolu i palnika; do przenoszenia inokulum używamy narzędzia transferowego, a do bloków drewna i siatki – pęsety. Parafilm należy przeciąć żyletką, aby uniknąć nacięć na krawędziach. Nacięcia w Parafilmie prowadzą do przerw podczas uszczelniania, co może spowodować przesunięcie się próbek i konieczność ponownego otwarcia szalki.
2. Przepal narzędzia transferowe lub pęsetę przed dodaniem następujących elementów (w podanej kolejności):
   1. Siatka plastikowa.
   2. Podłoże drewniane. W naszej demonstracji dodamy dwa bloki drewna wzdłuż siatki, oba pochodzące z tego samego pierwotnego bloku, który został podzielony, aby umożliwić sparowanie danych z wczesnych i późnych zbiorów. Bloki te układa się obok siebie, tak aby koniec słojów (przekrój poprzeczny drewna) był skierowany w stronę punktu z inokulum grzybowym.
   3. Materiały egzogenne. W tym przypadku badamy rolę gipsu w rozkładzie powodowanym przez grzyba nitkowatego. Chcemy zatem, aby grzyb napotkał dyski gipsowe przed dotarciem do drewna, dlatego dodajemy jeden dysk gipsowy między każdym punktem inokulacji a blokiem drewna na wierzchu siatki. Oznacza to dodanie 2 dysków na jeden mikrokosmos. Nie dopuszczaj do kontaktu między dyskami a drewnem, ale umieść je blisko siebie.
   4. Inokulum grzybowe. Używamy wycinaka do korków nr 4 o średnicy 7 mm do przygotowania czopków z 2-tygodniowych kultur hodowanych na 20 ml agaru. Pomaga to kontrolować objętość inokulum. W przypadku kontroli nieinokulowanych najlepiej dodać czopek z jałowej płytki. Zazwyczaj dodajemy te czopki bezpośrednio na agar, a nie na siatkę. Nie dopuszczaj do kontaktu między inokulum a podłożami egzogennymi ani drewnem, ale ponownie – umieść je blisko siebie. Na każdy blok przypada jeden czopek inokulum.
      
      Uwaga: Warto złożyć te elementy w szalce z agarem przed rozpoczęciem procesu, aby upewnić się, że pozostanie co najmniej 3 mm wolnej przestrzeni u góry, że odległość między blokami drewna a ściankami pokrywki wyniesie co najmniej 3 mm oraz że wymiary plastikowej siatki bez problemu pomieszczą podłoża.
3. Uszczelnij szalki Parafilmem, utrzymując zapalony płomień alkoholowy i mając pęsetę w pogotowiu. Trzymaj szalki poziomo i owijaj Parafilm płynnym, ciągłym ruchem. Jeśli Parafilm pęknie lub zawartość przesunie się, usuń Parafilm, otwórz szalkę ponownie, ułóż zawartość i spróbuj jeszcze raz.
4. Oznacz pokrywki szalek markerem odpornym na alkohol, wpisując numery bloków bezpośrednio nad odpowiednimi podłożami. Rysujemy również okręgi nad dyskami gipsowymi. W miarę rozkładu drewna prawdopodobnie utracisz możliwość odczytania oznaczeń na podłożach. Ważne jest, aby kontrolować położenie szalek. Ponadto nie należy lekceważyć zdolności grzyba do degradacji lub kolonizacji wielu innych rodzajów materiałów, w tym metali.
5. Jeśli na siatce znajduje się delikatna kompozycja, PRZENOŚ płytki do inkubatora OSTROŻNIE. Jednorazowo zdarzyło nam się uderzyć pojemnikiem z płytkami o futrynę drzwi, co wymusiło ponowne złożenie próbek. Nie spiesz się i zaplanuj trasę przenoszenia. To jednorazowa czynność, więc zachowaj szczególną ostrożność.

4) Inkubacja i zbieranie

Płytki można inkubować w warunkach dostosowanych do danego grzyba, jednak w miarę możliwości należy przechowywać je w inkubatorze biologicznym, aby uniknąć kondensacji pary wodnej spowodowanej wahaniami temperatury. Zbiory w serii czasowej przeprowadza się aseptycznie, z wyjątkiem ostatniego zbioru. Jeśli te pośrednie zbiory są wykonywane po znacznym wzroście na podłożach, manipulowanie płytkami jest łatwiejsze, ponieważ strzępki tworzą sieci łączące podłoża.

1. W naszej demonstracji inkubujemy płytki w temperaturze 20°C i w ciemności. W punkcie zbioru w 5. tygodniu wyjmujemy całą partię badawczą, spryskujemy każdą stronę (górną i dolną) 70% etanolem i używamy wypalanych pęsetą narzędzi do usuwania materiału wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego.
2. Wykonaj zdjęcia przed zniszczeniem płytek z agarem, skupiając się na morfologii lub melanizacji.
3. Usuń bloki przeznaczone do obróbki zgodnie z potrzebami. Użyj palca (w rękawiczkach nitrylowych), aby odsunąć nadmiar strzępek, uważając jednak, aby nie zgubić żadnego materiału rozłożonego. Zazwyczaj suszymy bloki w suszarce w aluminiowych naczynkach wagowych w celu określenia ubytku masy, wykorzystując masę świeżą i suchą próbek kontrolnych do monitorowania nadmiernego odprowadzania wilgoci. Oznaczamy i śledzimy również wszelkie ciemnobrązowe bloki, które są wyraźnie nasiąknięte wodą, choć przy zastosowaniu tej metody powinno to wystąpić minimalnie. Dane dotyczące ubytku masy pomagają ocenić postęp rozkładu i są istotnymi danymi, jeśli w późniejszym czasie stężenia pierwiastków mają być obliczane w przeliczeniu na gram masy. Pamiętaj również, że dane procentowe muszą zostać znormalizowane na potrzeby statystyki. Obliczamy je w następujący sposób:
   
   % ubytku masy = [(masa początkowa - masa końcowa) / masa początkowa] x 100
   1. Alternatywne suszenie powietrzne: Jeśli wymagane jest suszenie powietrzne z zamiarem dalszej biologicznej obróbki materiału, należy zastosować reżim kondycjonowania z sekcji 2.3 w celu ponownego kondycjonowania. Jeśli konieczne jest określenie ubytku masy, będzie to wymagało pomiaru zawartości wilgoci. Jednym z rozwiązań jest podzielenie bloków (lub proszków) na część dużą i małą. Zważ obie części, ale wysusz w suszarce tylko część małą. Oblicz współczynnik konwersji zawartości wilgoci, jak wyżej, a następnie zastosuj go do całkowitej masy świeżej części małej i dużej (całkowitej masy świeżej bloku). Szczególnie w przypadku wstępnej obróbki materiału grzybem przed sacharyfikacją lub innymi procesami, ubytek masy pomoże w późniejszym określeniu bilansu masy i uwzględni węglowodany zużyte przez grzyba.
4. Zniszcz kultury w workach autoklawowalnych, ale zachowaj plastikową siatkę wsporczą oraz wszelkie inne komponenty, które mogą zostać poddane recyklingowi i wykorzystane w przyszłych eksperymentach.

5) Interpretacja wyników

Tkanki lignocelulozowe zazwyczaj rozkładają się wolniej w układach z blokami agaru, jednak na tym etapie zmienność powinna być stosunkowo niska nawet przy umiarkowanym stopniu rozkładu. W tkankach kontrolnych powinna występować umiarkowana (20-50%), a nie wysoka wilgotność.

1. Zawartość wilgoci (w przeliczeniu na suchą masę) w drewnie niepoddanym działaniu grzybów jest zazwyczaj umiarkowana; w niniejszej demonstracji wynosi ona około 40%. Wartość ta przekracza punkt nasycenia włókien (FSP) sosny (zwykle około 24%), co oznacza obecność wolnej wody ponad ilość wody związanej w lignocelulozowej wtórnej ścianie komórkowej. Oznacza to również, że prawdopodobnie zachodzi zjawisko podciągania kapilarnego. Wilgotność względna (RH) na poziomie 100% nadal nie powinna powodować przekroczenia punktu FSP dla zawartości wilgoci w drewnie. Uzyskane wyniki mogą się różnić w zależności od doboru podłoża i siatki. Kluczowe jest utrzymanie zawartości wilgoci poniżej około 85% w przeliczeniu na suchą masę.
2. Procentowa utrata masy drewna degradowanego w tych mikrokosmosach na blokach agaru wynosi zazwyczaj około 30% po 16 tygodniach dla większości grzybów. W przypadku wybranych gatunków, w tym przypadku Serpula lacrymans, grzyby osiągną pełną degradację w tym czasie, >60% ubytku masy. S. lacrymans jest grzybem brunatnej zgnilizny, który usuwa niewielkie ilości ligniny, zatem 62% ubytku masy w tym badaniu oznacza, że proces rozkładu jest bliski zakończenia lub został już zakończony. Grzyby białej zgnilizny usuwają ligninę, a ubytek masy zależy zarówno od gatunku, jak i od podłoża.
3. Należy starannie zarejestrować morfologię strzępek. W niniejszym pokazie morfologia strzępek nie wskazywała w sposób bezpośredni na sukces lub niepowodzenie którejkolwiek z metod traktowania, jednak istotne były kolory melanizacji. Pozwoliło nam to powiązać rolę żelaza jako zanieczyszczenia w gipsie z wcześniejszymi badaniami, takimi jak prace Low. i wsp. (2000), w którym przetestowano materiały naturalne i w którym zaobserwowano to rdzawy kolor. Rola wapnia i żelaza była przedmiotem dyskusji w Low i wsp. (2000), a tutaj obserwujemy nasilony rozkład w obecności żelaza, a nie wapnia, oraz te same strzępki o rdzawym kolorze.
4. Jeśli chcą Państwo zmierzyć stężenia jakichkolwiek substancji w tym zdegradowanym drewnie, najlepiej jest dokonać normalizacji względem ubytku masy. Jeśli na przykład wapń nie jest ani wprowadzany, ani usuwany z drewna z 50% stopniem rozkładu, jego stężenie w przeliczeniu na masę będzie wydawać się dwukrotnie wyższe w momencie końcowego zbioru w porównaniu z czasem zero. Dzieje się tak, ponieważ 1 g proszku reprezentuje obecnie dwukrotnie większą objętość drewna niż w czasie zero. Grzyb skonsumował 50% macierzy, co doprowadziło do zmniejszenia gęstości. Aby skompensować ubytek masy, należy znormalizować dowolne stężenie (np. mmol/g) w następujący sposób:
   
   Znormalizowane stężenie = mmol/g x [1 - (% ubytku masy / 100)]
   
   Przykład: 10 mmol/g Ca w drewnie zdegradowanym w 20%, w porównaniu do 7 mmol/g w czasie zero.
   
   Pytanie: Czy zawartość Ca wzrosła w trakcie rozkładu?
   
   Wartość 10 mmol/g stanowi pozorny wzrost o 3 mmol/g, czyli wzrost o 43%, jednak jeden gram proszku z drewna zdegradowanego o niższej gęstości reprezentuje obecnie większą objętość. W celu porównania początkowej i końcowej zawartości wapnia (Ca) w równych objętościach drewna konieczna jest normalizacja.
   
   10 x [1 x (20% / 100)] = 8 mmol/g znormalizowano
   
   Odpowiedź: Tak, poziom Ca wzrósł, ale o 14%, a nie o 43%.
   
   (Dane można również wyrazić w przeliczeniu na objętość drewna, mmol/cm³)³poprzez pomnożenie przez gęstość.

Rysunek 1. Mikrokosmos w bloku agaru, przygotowany zgodnie z tą demonstracją, przed inkubacją.

Rysunek 2. Serpula lacrymans kolonizująca bloki drewna sosnowego spoczywające na plastikowej siatce w celu uniesienia bloków ponad poziom kontaktu z agarem. Grzybnia ta stanowi istotne połączenie między drewnem a egzogennymi źródłami składników odżywczych/pierwiastków; kontrolowanie tych egzogennych źródeł materiałów w agarze lub w formie materiałów stałych jest kluczową zaletą projektu z blokiem na agarze w porównaniu do projektu z blokiem w glebie.

Rycina 3. Średni % utraty masy jako miara stopnia rozkładu drewna przez Serpula lacrymans po 5 i 15 tygodniach inkubacji z sosną w mikrokosmosach z bloków agaru. Zastosowano następujące warianty: brak (bez Ca), dodatek 5 mM CaCl₂ do agaru (CaCl₂), gips o czystości >99% (CaSO₄) lub gips z dodatkiem 1% żelaza. Porównania średnich za pomocą chronionej analizy ANOVA przeprowadzono testami Tukeya przy α=0.05. Dla każdego zbioru słupki oznaczone tą samą literą nie wykazują istotnych różnic. Słupki błędów = odchylenie standardowe. Opublikowano w Schilling (2010).

Rycina 4. Zdjęcie z góry (A) wszystkich pięciu powtórzeń w 15. tygodniu rozkładu wywołanego przez ten sam testowy grzyb brunatnej zgnilizny, Serpula lacrymans, a także bloków (B) usuniętych i wysuszonych w suszarce. Należy zwrócić uwagę na brak melanizacji w wariancie bez wapnia, żółknięcie w wariantach z czystym wapniem oraz rdzawy wygląd w wariancie z dodatkiem żelaza. Warianty są oznaczone analogicznie jak na rysunku 3, przy czym kontrola w (B) to bloki nieinokulowane, służące do porównania.

Rysunek 5. Zdjęcie z góry z innej próby z zastosowaniem pożywki o wyższym stężeniu żelaza, agaru słodowego Blakeslee. Należy zwrócić uwagę na brak obserwowanej melanizacji w porównaniu z Rysunkiem 4. Usunięte i zważone bloki nie wykazały wpływu zabiegu na ubytek masy. Jest to przedstawione jako demonstracja wpływu komponentów egzogennych w tych próbach z blokami. Efekty te nie byłyby możliwe do przetestowania w układach słoikowych z blokami gleby, gdzie kontrola tych wkładów egzogennych jest zbyt trudna.

Dyskusja

Korzystając z naszej konfiguracji z blokiem agaru (Rysunek 1), Serpula lacrymans rosła w bezpośrednim kontakcie z powierzchniami gipsu i wrastała w bloki drewna (Rysunek 2), co doprowadziło do utraty masy wynoszącej ponad 60% w kontrolnych blokach sosny dotkniętych brunatną zgnilizną (Rysunek 3). Spełnia to z łatwością cel normy ASTM wynoszący >50% rozkładu, a średni współczynnik zmienności (C_V) rozkładu w 16. tygodniu wyniósł 0,055. Dane te zostały opublikowane w pracy Schilling⁷. Pono...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalki Petriego	Nalge Nunc international	4014	25 x 150 mm
Agar, Typ A	Sigma-Aldrich	A4550
Azotan amonu, NH4NO3	Millinckrodt	3436-12
Fosforan potasu, KH2PO4	JT Baker	3246-01
Siarczan magnezu 7-wodny, MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	230391
D-(+)-Glukoza	Sigma-Aldrich	G8270	Dekstroza
Kwas borowy, H3BO4	Mallinckrodt Baker Inc.	2549-04
Siarczan cynku 7-wodny, ZnSO4•7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	8880-12
Chlorek manganu(II) 4-wodny, MnCl2•4H2O	JT Baker	2540-04
Siarczan miedzi(II) 5-wodny, CuSO4•5H2O	Sigma-Aldrich	209198
Heptamolibdan amonu 4-wodny, (NH4)6Mo7O24•4H2O	Sigma-Aldrich	431346
Chlorek wapnia dwuwodny, CaCl2•2H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	4160-12
Chlorek sodu, NaCl	Mallinckrodt Baker Inc.	7581-12
Siarczan żelaza(II) 7-wodny, FeSO4•7H2O	Mallinckrodt Baker Inc.	5056-12
Pipet-aid	Drummond Scientific	4-000-110	Bezprzewodowy EtOH na powierzchnię
Sterylna pipeta polistyrenowa 10 ml	BD Biosciences	357551
Gutter Guard	Thermwell Products Co.	VX620	Wstępnie wyszorowany mydłem Sklep budowlany
Siarczan wapnia półwodny, CaSO4•0.5H2O	Acros Organics	385355000
Wycinak do korków #4	Boekel Scientific	1601
Parafilm "M"	Pechiney Plastic Packaging	PM-996